Aislar maligno y no maligno de células B lck:eGFP pez cebra

Resumen

Pez cebra transgénico lck:eGFP expresan GFP altamente en los linfocitos T y se han utilizado para estudiar el desarrollo de las células T y leucemia linfoblástica aguda. Esta línea puede utilizarse para células de estudio B, que expresan lck en niveles inferiores. Este protocolo describe la purificación de las células B malignas y no malignas del pez cebra lck:eGFP .

Resumen

Pez cebra (Danio rerio) son un poderoso modelo para estudiar el desarrollo de linfocitos. Como mamíferos, D. rerio poseen un sistema inmune adaptativo que incluye linfocitos B y T. Estudios de linfopoyesis de pez cebra son difíciles porque anticuerpos reconociendo D. rerio marcadores de superficie celular generalmente no están disponibles, que complica el aislamiento y caracterización de poblaciones de diferentes linfocitos, incluyendo B-linaje células. Líneas transgénicas con expresión fluoróforo específico de linaje se utilizan a menudo para eludir este desafío. La línea transgénica lck:eGFP se ha utilizado para estudiar el desarrollo de las células T D. rerio y se ha utilizado también para el desarrollo del modelo de la célula de T y leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Aunque lck:eGFP peces se han utilizado ampliamente para analizar el linaje T, no ha utilizado para estudiar las células de B. Recientemente, hemos descubierto que muchas células de pez cebra B también expresan lck, aunque a niveles más bajos. Por lo tanto, las células lck:eGFP B además expresan bajos niveles de GFP. Basado en este hallazgo, hemos desarrollado un protocolo para purificar células B linaje de peces cebra lck:eGFP , que se presenta aquí. Nuestro método describe cómo utilizar un clasificador célula fluorescente activada (FACS) para purificar las células de B de pescado lck:eGFP o líneas relacionadas, tales como doble transgénico rag2:hMYC; Lck:EGFP de pescado. En estas líneas, las células B, células B particularmente inmaduras, GFP expreso en niveles bajos pero detectables, lo que les permite distinguirse de las células T que expresan GFP altamente. B células pueden ser aisladas de médula ósea, timo, bazo, sangre u otros tejidos. Este protocolo proporciona un nuevo método para purificar células B D. rerio , permitiendo estudios enfocados en temas como el desarrollo de las células B y linfocitos B malignos.

Introducción

Pez cebra ofrecen poderosos atributos, como manipulability genético, alta fecundidad, transparencia óptica y desarrollo rápido que facilitan el estudio del desarrollo de vertebrados utilizando enfoques genéticos. Estas ventajas, junto con las características compartidas de teleósteos y mamífera hematopoyesis, hacen D. rerio ideal para análisis in vivo de la linfopoyesis y linfocito función, desde su más temprana aparición en larvas a lo largo de la edad adulta. Desarrollo de sangre en el pez cebra depende de procesos genéticos bien conservados que se comparten con los mamíferos, y estos se extienden al sistema inmune adaptante. Además, los mecanismos moleculares que regulan el desarrollo linfoide se conservan notable entre el pez cebra y mamíferos¹.

En las últimas 2 décadas, transgénicos D. rerio líneas linajes de sangre específicos de etiqueta y las líneas mutantes deficientes en estos linajes se han creado^2,3,4,5. Uno de ellos, la línea transgénica lck:eGFP , utiliza el promotor de pez cebra linfocitos proteína tirosina quinasa (lck) para unidad de expresión de GFP⁶. Este gen, que es altamente expresada por precursores de linaje T y los linfocitos T maduros, permite seguimiento de desarrollo de la célula de T tímico y ex vivo de purificación de las células de linaje T por FACS⁷en vivo. Anteriormente, utilizamos esta línea en una pantalla de mutagénesis ENU avance genético para identificar a mutantes del germline propensos a todo T y para estudiar fenómenos genéticos adquiridos somáticamente vinculados a la célula de T oncogénesis^8,9.

Recientemente, nuestro laboratorio extendido más la utilidad del pez cebra lck:eGFP . En doble transgénico rag2:hMYC (MYC humano), lck:eGFP D. rerio que son conocidos por desarrollar todo T ¹⁰, descubrimos que B linaje también ocurren¹¹. A diferencia de la T-ALL en este modelo, que es fluorescente brillante debido a la alta expresión de GFP, B-todos son débilmente fluorescente debido a niveles bajos de la GFP, que pescado con B-todo distinguirse groseramente de los T-todo por microscopia fluorescente. Esta expresión de GFP diferencial también permite la separación de GFP^lo -todas las células desde GFP^Hola células T-todos usando FACS¹¹. Por otra parte, expresión de lck de baja no es exclusiva de pez cebra B-ALL, como humanos-todas también expresan bajos niveles de LCK^11,12. Asimismo, células normales B-linaje de D. rerio, ratones y seres humanos también expresan niveles bajos de lck/Lck/LCK, células B inmaduras con la más alta expresión^11,13. Sobre una base por celular, las células de linaje B en líneas de pez cebra o derivado de lckeGFP expresan 1-10% tanto GFP como los linfocitos T. Estos GFP^lo expresa característica mRNAs de la célula de B como pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzy otros de las células y puede ser purificado de la médula ósea, timo, bazo o periférico la sangre¹¹. Por lo tanto, ambos linaje B y T las células pueden ser aisladas de pez cebra lckeGFP y en caso de rag2hMYC, lckeGFP animales, células B y T todos así¹¹.

Aquí, presentamos nuestro protocolo eficiente FACS purificar células no malignas B de pez cebra lck:eGFP y las células de B no malignos o malignas de rag2hMYC; Lck:EGFP peces, con varios tejidos de origen. Tales células pueden cuantificarse por el flujo cytometry sin aislamiento de FACS, además si lo desea. Descubrimiento de la expresión de lck de baja- y en consecuencia, la baja expresión de GFP-b células abre nuevas puertas de posibilidades experimentales del pez cebra lckeGFP , como vivo en B estudios del desarrollo de la célula. Así, esta línea transgénica, primero divulgada en 2004, tiene nueva vida al intentar utilizarlo para obtener ideas frescas sobre inmunidad adaptativa de pez cebra.

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Protocolo

Todos los procedimientos de pez cebra fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en el Universidad de Oklahoma Health Sciences Center.

1. aislar no malo B y los linfocitos T de transgénicos lck:eGFP pescado

1. Anestesiar los peces Metanosulfonato de 0.02% (MS-222) en el agua del sistema de pescado.
2. Examinar el pescado de 2 a 6 meses para thymi fluorescente, que se encuentran en el aspecto dorsomedial de la cavidad branquial del pez cebra y otros teleósteos¹⁴. Usar un microscopio de epifluorescencia (470/40 longitud de onda de excitación y emisión de 525/50 filtro) para detectar la GFP.
3. Prepara con antelación 50 mL de 1 filtro esterilizado x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) que contiene 1% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina (clasificación media). Sin utilizar medios de clasificación pueden almacenarse a 4 ° C hasta por 2 meses.
4. Eutanasia a los peces colocando en un vaso de precipitados que contiene 0.2% Metanosulfonato de aproximadamente 5 minutos, seguido por la inmersión del baño de hielo. Confirman muerte por el cese del movimiento opercular (gill).
5. Coloque el pescado sacrificaron en una placa Petri y diseccionar órganos linfoides de interés, utilizando el microscopio de fluorescencia para disecar la GFP⁺ thymi¹⁴y ajustes de microscopía de campo brillante disección del riñón médula y bazo¹⁵. Resultados aquí presentados fueron obtenidos usando 3 meses pescado. Proporciones de linfocitos y números absolutos varían por edad y genotipo (véase discusión para más detalles).
6. Colocar cada órgano disecado en un tubo de 1,5 mL conteniendo 500 μl de fría clasificación de los medios de comunicación.
7. Homogeneizar el tejido sobre el hielo usando un homogeneizador de micro tubo de mortero.
8. Pasar el tejido homogeneizado a través de un filtro de malla de 35 μm para generar una suspensión unicelular. Mantener las células en hielo hasta su análisis.

2. aislamiento de linfocitos malignos de doble transgénico rag2:hMYC; lck:eGFP pez cebra

1. Microscópico a partir en 2-4 meses, pantalla rag2:hMYC; Lck:EGFP pescado de patrones anormales de la GFP.
   Nota: las células de B son GFP^lo en el fondo de lck:eGFP , B-todo requiere práctica de reconocer; T-todo es obvio, porque las células T son GFP^Hola. En consecuencia, el rag2:hMYC, lck:eGFP línea doble transgénico tiene dos fenotipos: brillantemente fluorescentes T-ALL, que generalmente se derivan del timo y extender en el cuerpo y débilmente fluorescente-todas.
   1. Usando un microscopio de fluorescencia, los peces utilizando la configuración de "baja exposición" (200 ms, ganancia de 2,4 x) identificar brillante T-ALL (figura 1A) y "exposición" de la pantalla (1,5 s, 3,4 x ganancia) para identificar dim-todas (figura 1A). Controles de peso y pescado pre leucémico tiene GFP localizada únicamente en el timo (figura 1B).
2. Anestesiar y examinar el pescado tal como se describe en los pasos 1.1 – 1.2.
3. Categorizar los peces basados en la medida de la fluorescencia de GFP, usando un simple sistema de tres Categoría:
   Nota: Nivel 1: Fluorescencia aparece como un tumor tímico con sólo limitada propagación local.
   Nivel 2: Fluorescencia aparece más allá del timo, que < 50% del cuerpo.
   Nivel 3: Fluorescencia se extiende más allá del 50% del cuerpo.
4. Separe el pescado con todos de los que no tienen cáncer. Monitor pre leucémico peces (es decir, sin tumores GFP⁺ ) una vez cada mes para el desarrollo de nuevo todo. ~ 9 meses, todos rag2:hMYC, lck:eGFP peces desarrollan T-ALL, B-ALL, o ambos.
5. Para el aislamiento de la célula T o B todos, seleccione nivel 3 peces (todo con > 50% del cuerpo), que producen más de 2 x 10⁶ todas las células y por lo general muchos más.
6. Eutanasia a los peces como en el paso 1.4.
   Nota: Existen dos métodos para obtener todas las células: cuerpo entero de homogeneización y una lavado peritoneal técnica¹⁶. Los métodos difieren en el número absoluto de células recogidas para la clasificación, y así, las cantidades de FACS tiempo necesario y coste (véase discusión para más detalles).
7. Para cualquiera de los métodos, primero coloque el pescado sacrificaron en una placa Petri y utilizando una hoja de afeitar, retirar la cabeza incluyendo la región tímica. Esto puede ser procesado por separado, si lo desea, o tinción histológica.
8. Método de lavado peritoneal
   1. Con una pipeta P1000, lavar la cavidad peritoneal de pescado con 500 μl de fría clasificación de los medios de comunicación, recoger las células y los medios de comunicación en un tubo de 5 mL.
   2. Utilizando una nueva pipeta, inyectar un adicional 200 – 300 μL de medios clasificación frío en la cavidad del cuerpo. Entonces, utilizando la punta de la pipeta, aplique presión suave sobre el cuerpo de los pescados para extruir las células fuera de la cavidad del cuerpo. Recoger este medio y añadir al tubo de 5 mL.
   3. Repita el paso 2.8.2 2 – 3 veces. Mantener las células recogidas en la clasificación de los medios de comunicación en el hielo.
   4. Filtrar la suspensión de células aunque una malla de 35 μm filtro antes de citometría de flujo/FACS y mantener las células en hielo hasta su análisis.
9. Homogeneización de todo el cuerpo
   1. Después de quitar la cabeza de pescado, coloque el cuerpo en un tubo de 1,5 mL que contiene 200 μL de la clasificación de los medios de comunicación.
   2. Homogeneizar el cuerpo, utilizando un homogeneizador de micro tubo de mortero.
   3. Agregar un adicional de 300 μL de fría clasificación de los medios de comunicación. Filtrar la suspensión de células, aunque un filtro de malla de 35 μm. Agregue media clasificación para lavar todas las células a través del filtro, hasta que quede sólo restos de tejido en el filtro. Mantener las células en hielo hasta su análisis.

3. cytometric del análisis de los linfocitos B normales o malignas

1. Definirse el análisis cytometric del flujo y parámetros de FACS según manual del fabricante.
2. Adquirir el número deseado de eventos inicialmente caracterizar la muestra. Analizar 1 x 10⁴ 5 x 10⁴ eventos antes de la clasificación para determinar puertas específicas para pasos posteriores de clasificación.
   1. Determinar puertas: definir puertas célula linfocito y progenitoras utilizando forward scatter (FSC) y parámetros de scatter (SSC) de lado, excepto los detritos celulares (figura 2A-C)¹⁷. FSC y SSC corresponden al diámetro de la célula y granularidad, respectivamente.
      Nota: GFP^–, GFP^loy GFP^Hola las células difieren doble 10 a 100 en cuanto a su intensidad de fluorescencia de GFP, haciendo separación de estas poblaciones sencillas (figuras 2-5). Muertos viven discriminación puede ser evaluada en este punto con yodo de propidio (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) tinción de viabilidad. Experimentos anteriores con PI demuestran típicamente > 95% de viabilidad de células GFP⁺ después de FACS.
   2. Excluir los dobletes de la célula, según los parámetros de la máquina de FACS se utiliza.
   3. Dentro de las puertas linfoides o precursor, determinar el número y porcentaje de células GFP⁺ .
3. Uso ficoeritrina (PE) e intensidades GFP, definir puerta para GFP^– vs GFP^lo vs células GFP^Hola .
   Nota: Células B presentan fluorescencia de GFP dim y las células T muestran brillante GFP en líneas lck:eGFP . Muchos órganos linfoides o muestras tumorales contienen ambas poblaciones de GFP⁺ . B linaje células, B-todo son GFP^lo y células de linaje T, T-todo son GFP^Hola. Definir puertas distinguir entre GFP^–, GFP^loy GFP^Hola las células y recoger por separado las poblaciones(Figura 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A y figura 5A).
4. Ordenar cada población celular en tubos de polipropileno de diferentes 15 mL que contiene 2 mL de la clasificación de los medios de comunicación, o directamente en tubos de 1,5 mL diferentes con un tampón adecuado para análisis adicionales (por ejemplo, ARN, ADN o extracción de proteínas, allo-trasplante, etcetera).
5. Mantener las células purificadas en hielo antes de mayores análisis.

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Resultados

Hemos utilizado la citometría de flujo para analizar y FACS para aislar GFP^lo y GFP^Hola células de timo, médula ósea riñón y bazo de pez cebra transgénico lck:eGFP . El análisis de peces 3 meses reveló que el timo contiene principalmente linfocitos GFP⁺ . Las células GFP⁺ fueron confinadas en gran parte a la puerta linfoide descrita por Traver et al¹⁷. Dos poblaciones distintas de la GFP⁺ , G...

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Discusión

Desarrollamos y proporcionar un protocolo para aislar las células de B de pez cebra transgénico lck:eGFP , añadir esto a otros modelos de D. rerio con linaje B etiquetas^3,4. Sorprendentemente, la identificación de GFP^lo B células en esta línea pasó desapercibida desde su descripción en el año 2004. Generalmente, lck es considerada específica de la célula de T⁶, pero estudios recientes encont...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030