İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Özet

Transgenik lck:eGFP Zebra balığı GFP son derece T lenfosit hızlı ve T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi çalışmaya kullanılmıştır. Bu satırı lck daha alt düzeylerde hızlı çalışma B hücreleri için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı arıtma lck:eGFP Zebra balığı kötü huylu ve kötü huylu olmayan B hücre açıklar.

Özet

Zebra balığı (Danio rerio) lenfosit geliştirme eğitim için güçlü bir model vardır. Memeliler gibi D. rerio B ve T lenfositleri içeren bir adaptif bağışıklık sisteminin sahip. D. rerio hücre yüzey işaretleyicileri tanıma antikorlar genellikle yalıtım ve karakterizasyonu B lineage dahil olmak üzere farklı lenfosit nüfusun karmaşık hale getiren, olmaması nedeniyle Zebra balığı lymphopoiesis çalışmaları zor hücreleri. Transgenik satırları lineage özgü fluorophore ifade ile sık sık bu zorluğu aşmak için kullanılır. Transgenik lck:eGFP satırı D. rerio T hücre gelişimini incelemek için kullanılan ve aynı zamanda modeli T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) kullanıldığında vardır. LCK:eGFP balık yaygın olarak T-lineage çözümlemek için kullanılan olsa da, bunlar B hücreleri çalışmaya kullanılmıştır değil. Son zamanlarda, birçok Zebra balığı B hücreleri de lck, hızlı da olsa daha alt düzeylerde keşfettik. Sonuç olarak, lck:eGFP B hücreleri aynı şekilde GFP seviyesinin düşük hızlı. Bu bulgu üzerinde bağlı olarak, biz burada rapor lck:eGFP Zebra balığı B lineage hücrelerden arındırmak için bir protokol geliştirdik. Bizim yöntem lck:eGFP balık veya çift transgenik rag2:hMYCgibi ilgili satırları B hücreleri arındırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) kullanmak açıklar; LCK:eGFP balık. Bu satırları, B hücreleri, özellikle olgunlaşmamış B hücreleri, düşük ama algılanabilir seviyede hızlı GFP GFP son derece hızlı T hücrelerden ayırt edici olmalarını sağlar. B hücreleri kemik iliği, timus, dalak, kan veya diğer dokularda ayrılmış olabilir. Bu iletişim kuralı D. rerio B hücreleri, B hücre gelişimi ve B lenfosit maligniteler gibi konular üzerinde duruldu çalışmalar etkinleştirme arındırmak için yeni bir yöntem sağlar.

Giriş

Zebra balığı genetik yaklaşımlar kullanarak eğitim omurgalı geliştirme kolaylaştırmak güçlü öznitelikleri genetik manipulability, yüksek verimlilik, optik kalınlığı ve hızlı bir gelişme gibi sunuyoruz. Teleost ve memeli hematopoiesis, paylaşılan özellikleri ile birlikte bu avantajları D. rerio larva yetişkinlik boyunca erken kendi görünümünü gelen lymphopoiesis ve lenfosit fonksiyon içinde vivo analizleri için ideal kılar. Zebra balığı kan geliştirme memeliler ile paylaşılan iyi korunmuş genetik işlemleri üzerine dayanır ve bunlar edinilmiş bağışıklık sistemi genişletmek. Ayrıca, moleküler mekanizmaları lenfoid geliştirme yöneten Zebra balığı ve memeliler¹arasında son derece korunmuş.

Son 2 yılda bu etiket belirli kan soy transgenik D. rerio hatları ve mutant satırları bu soy eksik^2,3,4,5oluşturulmuştur. Bunlardan lck:eGFP transgenik hattı, Zebra balığı lenfosit protein tirozin kinaz (lck) organizatörü GFP ifade⁶sürücü için kullanır. Çok T-lineage öncüleri ve Olgun T lenfositler tarafından ifade edilir, bu gen içinde vivo timik T hücre gelişimi ve ex vivo arıtma T-lineage hücre FACS⁷tarafından izleme sağlar. Daha önce biz bu hat bir ileri genetik trk mutagenesis ekran germline mutantlar T-ALL için eğilimli tanımlamak ve genetik olaylar somatically satın T hücre oncogenesis^8,9' a bağlı çalışma için kullanılır.

Son zamanlarda, bizim laboratuvar lck:eGFP Zebra balığı yardımcı programı daha da genişletilmiş. Çift-transgenik rag2:hMYC içinde (insan MYC), T-ALL ¹⁰, geliştirmek için bilinen lck:eGFP ö rerio keşfettiğimiz B lineage tüm da¹¹oluşur. B-tüm loş floresan T-ALL parlak yüksek GFP ifade nedeniyle belli, bu modelde aksine düşük GFP düzeyleri nedeniyle balık fena halde üzerinden bu T-ALL ile floresan mikroskopi tarafından ayırt edici olması için B-ALL ile izin. Bu fark GFP ifade de GFP^lo B-tüm hücreleri ayrılması GFP^Merhaba --dan T-tüm hücreleri FACS¹¹kullanarak verir. Ayrıca, düşük lck ifade insan B-tüm Ayrıca hızlı düşük seviyelerde LCK^11,12B-ALL, Zebra balığı benzersiz değildir. Aynı şekilde, normal B lineage hücreleri D. rerio, fareler ve insanlar da lckseviyesinin düşük hızlı /Lck/LCK, olgunlaşmamış B hücreleri ile sahip en yüksek ifade^11,13. Hücre başına bazında, B-lineage hücreleri lckeGFP Zebra balığı veya türev satırı % 1-10 kadar GFP T lenfositler ifade. Bu GFP^lo hızlı karakteristik B hücre mRNA'ların pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzve diğerleri gibi hücreleri ve kemik iliği, timus, dalak veya periferik saf kan¹¹. Bu nedenle, her iki B - ve T-hücreler olabilir soy lckeGFP Zebra balığı ve rag2hMYC, lckeGFP hayvanlar, B ve T tüm hücreleri de söz konusu olduğunda¹¹izole.

Burada, bizim iletişim kuralı lck:eGFP Zebra balığı ve rag2hMYC-kötü huylu veya kötü huylu B hücrelerinin verimli bir şekilde FACS arındırmak Malign B hücreleri için mevcut; lck:eGFP balık, çeşitli kaynak dokuları kullanarak. Bu hücreler aynı şekilde Akış Sitometresi FACS yalıtım, olmadan tarafından istenirse sayısal. Düşük lck ifade keşfi- ve sonuç olarak, GFP ifade düşük-B tarafından hücreleri açar yeni kapılar için lckeGFP Zebra balığı, deneysel olanaklar içinde vivo B hücre gelişim çalışmaları gibi. Böylece, transgenik bu içini kaplamak, 2004'te, ilk rapor kullanmak o Zebra balığı edinilmiş bağışıklığın ile ilgili taze anlayışlar seçip ayırmak için aramak gibi yeni bir hayat var.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Zebra balığı içeren tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından kabul edildi.

1. Non-Malign B ve T lenfositleri transgenik lck:eGFP balık izole

1. %0,02 tricaine (MS-222) Balık sistem su kullanarak balık anestezi.
2. Zebra balığı ve diğer teleosts¹⁴bransiyal boşluğuna dorsomedial yönü de bulunan 2-6 ay eski balık floresan thymi için inceleyin. Bir epifluorescence mikroskobu (470/40 uyarma dalga boyu ve 525/50 emisyon filtre) GFP algılamak için kullanın.
3. Önceden filtre sterilize 1 Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) içeren % 1 fetal sığır serum ve % 1 penisilin-streptomisin (sıralama medya) x 50 mL hazırlamak. Kullanılmayan sıralama medya 4 ° C'de 2 aya kadar saklanabilir.
4. Balık % 0,2 içeren bir kabı yerleştirerek ötenazi için yaklaşık 5 dk, Tricaine buz banyosu daldırma tarafından takip. Ölüm opercular (solungaç) hareket durdurulması tarafından onaylayın.
5. Euthanized balık bir Petri kabına yerleştirin ve lenfoid organlar GFP⁺ thymi¹⁴ve böbrek kemik iliği ve dalak¹⁵incelemek için parlak alan mikroskobu ayarlarını incelemek için floresan mikroskop kullanarak ilgi incelemek. Sonuçları burada sunulan 3 aylık balık kullanarak elde edilmiştir. Lenfosit oranlarını ve kesin rakamlar yaş ve genotip (daha fazla ayrıntı için bkz) göre değişir.
6. Her disseke organ medya sıralama soğuk 500 µL içeren bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.
7. Buzda bir havaneli ile mikro-tüp homogenizer kullanarak doku lunaparkçı.
8. Homojenize doku bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için 35 µm gözenekli filtre geçmek. Hücreler buz üzerinde analiz kadar tutmak.

2. çift-transgenik rag2:hMYC; lck:eGFP Zebra balığı üzerinden Malign lenfositler yalıtma

1. 2-4 aylıkken başlayarak, mikroskobik rag2:hMYCekran; LCK:eGFP balık anormal GFP desenler için.
   Not: B hücreleri vardır GFP^lo lck:eGFP arka planda, B-tüm tanımak; pratik gerektirir T hücreleri GFP^Merhabaçünkü T-ALL açıktır. Sonuç olarak, rag2:hMYC, lck:eGFP çift-transgenik satır iki fenotipleri vardır: parlak floresan T-genellikle timus ortaya ve vücut ve loş floresan B-tüm içine genişletmek tüm,.
   1. Bir floresan mikroskop kullanarak ekran "düşük pozlama" ayarlarla (200 ms, 2.4 x kazanç) parlak T-ALL (şekil 1A) ve "yüksek pozlama" tanımlamak için balık (1,5 s, 3,4 x kazanç) loş B-ALL (şekil 1A) tanımlamak için. WT denetimleri ve önceden lösemik balık sadece timus (şekil 1B) Lokalize GFP var.
2. Anestezi ve 1.1-1.2 adımlarda açıklandığı gibi balık inceleyin.
3. GFP Floresan, basit bir üç kategori sistemi kullanarak kapsam üzerinde dayalı balık sınıflandırmak:
   Not: Düzey 1: Floresan timik tümörle sadece sınırlı yerel yayılmış olarak görünür.
   Düzey 2: Floresan timus, maddelerle ilgili görünür < vücudun % 50.
   Düzey 3: Floresan vücut % 50'si uzanır.
4. Tüm bu kanser olmadan balık ayırın. Önceden lösemik balık (yani, Balık GFP⁺ tümör olmadan) bir kez aylık yeni ALL gelişimi için izleyin. Tarafından ~ 9 ay, tüm rag2:hMYC, lck:eGFP balık geliştirmek T-ALL, B-tüm veya her ikisini de.
5. T veya B tüm yalıtım hücre, düzey 3 balık seçin (tüm içeren > vücudun % 50), tüm hücreleri ve genellikle çok daha fazla 2 x 10'dan fazla⁶ verim.
6. Balık olduğu gibi adım 1.4 ötenazi.
   Not: TÜM hücreleri elde etmek için iki yöntem vardır: bütün vücut homojenizasyon ve Periton yıkama tekniği¹⁶. Hücreleri sıralamak için toplanan mutlak sayısında yöntemleri farklılık gösterir ve böylece, FACS miktarda gerekli ve maliyet zaman (daha fazla ayrıntı için bkz).
7. Her iki yöntem için ilk euthanized balık bir Petri kabına yerleştirin ve jilet kullanarak, timik bölgesi dahil olmak üzere baş kaldırma. Bu ayrı olarak, istenen veya histolojik boyama için kullanılan işlenebilir.
8. Periton yıkama yöntemi
   1. P1000 pipet kullanarak, Balık Periton boşluğuna 500 µL soğuk ortam, hücre ve 5 mL tüp medyada toplama sıralama ile yıkayın.
   2. Taze pipet ucu kullanarak, bir ek 200 – 300 µL soğuk sıralama medya vücut boşluğuna enjekte et. Daha sonra pipet ucu kullanarak, hafif basınç balık vücut hücreleri vücut boşluğu dışında Yükselt için geçerli. Bu medya toplamak ve 5 mL tüp ekleyin.
   3. 2.8.2 2-3 kez tekrarlayın. Kendine hakim hücre buz medyada sıralama tutun.
   4. 35 µm mesh Akış Sitometresi/FACS önce filtre ve hücreler buz üzerinde analiz kadar tutmak rağmen hücre süspansiyon filtre.
9. Tüm vücut homojenizasyon
   1. Balık kafası kaldırdıktan sonra vücut medya sıralama 200 µL içeren bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.
   2. Bir havaneli ile mikro-tüp homogenizer kullanarak vücudun homojenize.
   3. Soğuk ortam sıralama ek bir 300 µL ekleyin. Hücre süspansiyon rağmen 35 µm gözenekli filtre filtre. Sıralama medya kadar sadece doku enkaz üzerinde filtre kalır tüm hücreleri filtreden yıkamak için gerektiği gibi ekleyin. Hücreler buz üzerinde analiz kadar tutmak.

3. sitometrik analizinde Normal veya malign B lenfositler

1. Akış sitometrik çözümlemesi ve/veya Üretici kılavuzuna göre FACS parametreleri ayarlayın.
2. Başlangıçta karakterize örnek olayların istediğiniz sayıyı elde etmek. 1 x 10⁴ 5 x 10⁴ olaylara sonraki sıralama adımları için belirli ağ geçitlerini belirlemek için sıralama önce analiz.
   1. Gates belirlemek: ileri dağılım (FSC) ve hücresel enkaz (şekil 2A-C)¹⁷hariç yan dağılım (SSC) parametreleri kullanarak lenfosit ve progenitör hücre kapıları tanımlayın. FSC ve SSC hücre boyutu/çapı ve taneciklik, sırasıyla karşılık gelir.
      Not: GFP^-, GFP^love GFP^Merhaba hücreleri 10-için-100-kat onların GFP floresan yoğunluğu açısından bu nüfus basit (Şekil 2-5) ayrılması yapma farklı. Canlı ölü ayrımcılık bu noktada propidium iyot (PI) veya 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) Boyama canlılık kullanarak tespit edilebilir. PI ile önceki deneyler genellikle göstermek > % 95 canlılığı GFP⁺ hücre FACS sonra.
   2. Hücre birini kullanılan FACS makine parametrelere göre hariç.
   3. Lenfoid ve/veya öncül gates içinde sayısını ve GFP⁺ hücreleri yüzdesini belirleyin.
3. Phycoerythrin (PE) ve GFP yoğunluklarda kullanın, GFP^lo GFP^Merhaba hücreleri vs vs GFP için^- geçidi tanımlamak.
   Not: B hücreleri loş GFP Floresans sergi ve T hücreleri parlak GFP lck:eGFP satırları gösterir. Birçok lenfoid organlar ya da tümör örnekleri her iki GFP⁺ örneğin alınma olasılığını içerir. B-lineage hücreler/B-tüm GFP^lo ve T-lineage hücreler/T-ALL vardır GFP^Merhaba. GFP^-, GFP^lo, GFP^Merhaba hücreleri arasında ayrım yapmalarını geçitlerini tanımlamak ve bu nüfus ayrı ayrı toplamak (şekil 2A-C, şekil 3A-C, şekil 4A ve şekil 5A).
4. Her hücre nüfus medya sıralama 2 mL içeren farklı 15 mL polipropilen borular veya doğrudan farklı 1,5 mL tüpler (örneğin, RNA, DNA veya protein ayıklama, allo-nakli, vb) daha fazla analizleri için uygun bir arabellek içeren sıralamak.
5. Arıtılmış hücreler buz daha fazla analizleri önce tutmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Biz analiz etmek için Akış Sitometresi ve FACS GFP^lo ve GFP^Merhaba hücrelerden timus, böbrek kemik iliği ve dalak lck:eGFP transgenik Zebra balığı, izole etmek için kullanılır. 3 aylık balık analizini timus çoğunlukla GFP⁺ lenfosit içerdiği ortaya koydu. GFP⁺ hücreler büyük ölçüde lenfoid kapıyı Traver vd.¹⁷tarafından daha önce açıklanan sınırlı. İki ayrı GFP⁺ nüfus,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz gelişmiş ve bu B-lineage etiketleri^3,4ile diğer D. rerio modeller ekleme lck:eGFP transgenik Zebra balığı, B hücreleri izole etmek için bir protokol sağlar. Biraz şaşırtıcı, GFP^lo B hücreleri bu satırdaki tanımlaması açıklamasını 2004 yılında beri gözden kaçmış gitmiş. Genel olarak, lck T hücre özgü⁶olarak kabul edilir, ama beklenmedik lck ifade doğal öld?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030