Isolando il maligno e le cellule di B Non-maligna da lck:eGFP Zebrafish

Riepilogo

Zebrafish transgenici lck:eGFP esprimono GFP altamente nei linfociti T e sono stati usati per studiare lo sviluppo delle cellule T e la leucemia linfoblastica acuta. Questa linea può essere utilizzato per Studio B cellule, che esprimono lck a livelli inferiori. Questo protocollo descrive la purificazione delle cellule di B maligne e benigne da lck:eGFP zebrafish.

Abstract

Zebrafish (Danio rerio) sono un potente modello per studiare lo sviluppo del linfocita. Come mammiferi, d. rerio possiedono un sistema immunitario adattativo che include i linfociti B e T. Gli studi di zebrafish linfopoiesi sono difficili perché anticorpi che riconoscono i marcatori di superficie delle cellule di d. rerio non sono generalmente disponibili, isolamento e caratterizzazione di popolazioni linfocitarie diverse, tra cui B-stirpe di complicazione cellule. Linee transgeniche con espressione fluoroforo lineage-specifici sono spesso utilizzati per aggirare questa sfida. La linea transgenica lck:eGFP è stata utilizzata per studiare lo sviluppo delle cellule di T di d. rerio e inoltre è stata utilizzata per lo sviluppo delle cellule di T di modello e leucemia linfoblastica acuta (LAL-T). Anche se lck:eGFP pesce sono stati ampiamente usati per analizzare il T-stirpe, essi non sono stati utilizzati per studiare le cellule B. Recentemente, abbiamo scoperto che molte cellule di zebrafish B esprimono anche lck, seppur a livelli inferiori. Di conseguenza, le cellule lck:eGFP B similarmente esprimono bassi livelli di GFP. Sulla base di questa individuazione, abbiamo sviluppato un protocollo per purificare le cellule di B-stirpe da lck:eGFP zebrafish, che segnaliamo qui. Il nostro metodo viene descritto come utilizzare un sorter fluorescente-attivata delle cellule (FACS) per purificare le cellule B da lck:eGFP pesce o righe correlate, ad esempio transgenici doppio rag2:hMYC; pesce LCK:EGFP . In queste righe, cellule B, cellule B particolarmente immature, GFP espressa a livelli bassi ma rilevabili, consentendo loro di essere distinto dalle cellule T, che esprimono GFP altamente. B cellule possono essere isolate da midollo osseo, timo, milza, sangue o altri tessuti. Questo protocollo fornisce un nuovo metodo per purificare le cellule di B di d. rerio , abilitazione studi incentrati su temi come lo sviluppo delle cellule B e le malignità del linfocita B.

Introduzione

Zebrafish offrono potenti attributi, ad esempio manipolabilità genetica, alta fecondità, ottico traslucenza e rapido sviluppo che semplificano lo sviluppo vertebrato Studio utilizzando approcci genetici. Questi vantaggi, insieme con le funzionalità condivise di teleostei e mammiferi ematopoiesi, rendono d. rerio ideale per analisi in vivo della funzione del linfocita e linfopoiesi, dalla loro prima apparizione nelle larve durante l'età adulta. Sviluppo di sangue in zebrafish si basa su processi genetici ben conservati che vengono condivisi con i mammiferi, e questi si estendono per il sistema immunitario adattativo. Inoltre, i meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo linfoide notevolmente sono conservate tra zebrafish e mammiferi¹.

Negli ultimi 2 decenni, linee transgeniche d. rerio lignaggi di sangue specifico tale etichetta e linee mutanti carenti in queste linee cellulari sono state create^2,3,4,5. Uno di questi, la linea transgenica lck:eGFP , utilizza il promotore di zebrafish del linfocita proteina tirosina chinasi (lck) a guidare la GFP espressione⁶. Questo gene, che è altamente espressa da precursori di LAL-T e i linfociti T maturi, permette in vivo monitoraggio dello sviluppo della cellula T timica ed ex vivo purificazione delle cellule di T-stirpe di FACS⁷. In precedenza, abbiamo usato questa linea in uno schermo di mutagenesi ENU avanti-genetica per identificare i mutanti di germline inclini a LAL-T e per studiare eventi genetici somatico acquisito legati a cellula T oncogenesi^8,9.

Recentemente, il nostro laboratorio esteso ulteriormente l'utilità di lck:eGFP zebrafish. In transgenici doppio rag2:hMYC (MYC umano), lck:eGFP D. rerio che sono noti per sviluppare LAL-T ¹⁰, abbiamo scoperto che LAL-B si verificano anche¹¹. A differenza di LAL-T in questo modello, che reagiscono in brillantemente dovuto l'alta espressione di GFP, B-tutti sono scarsamente-fluorescenti a causa di bassi livelli di GFP, permettendo il pesce con B-ALL per essere distinti grossolanamente da quelli con LAL-T da microscopia fluorescente. Questa espressione di GFP differenziale consente inoltre la separazione di cellule GFP^lo B-tutti da GFP^Ciao cellule T-ALL usando FACS¹¹. Inoltre, espressione di basso lck non è univoco per zebrafish B-ALL, come umano anche esprimere bassi livelli di B-ALL di LCK^11,12. Allo stesso modo, le cellule normali di B-stirpe di d. rerio, topi e gli esseri umani esprimono anche bassi livelli di lck/LckLCK, con cellule di B acerbe che hanno la più alta espressione^11,13. Su una base per cellula, le cellule di B-stirpe in linee di zebrafish o derivato di lckeGFP express 1-10% tanto GFP come linfociti T. Questi GFP^lo cellule espressa caratteristica delle cellule di B mRNA come pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighze altri e possa essere purificate dal midollo osseo, timo, milza o periferico ¹¹del sangue. Di conseguenza, entrambi LAL-B e T-cellule possono essere isolato da lckeGFP zebrafish e nel caso di rag2hMYC, lckeGFP animali, anche le cellule di B - e T-ALL¹¹.

Qui, vi presentiamo il nostro protocollo efficiente FACS-purificare B cellule benigne da lck:eGFP zebrafish e benigne o maligne cellule di B di rag2hMYC; LCK:EGFP pesce, utilizzando vari tessuti di origine. Tali cellule allo stesso modo possono essere quantificate mediante citometria a flusso senza isolamento FACS, se lo si desidera. Scoperta di espressione bassa lck - e di conseguenza bassa espressione di GFP-di B cellule apre nuove porte di possibilità sperimentali per lckeGFP zebrafish, come in vivo B cella studi evolutivi. Così, questa linea transgenica, primo luogo segnalata in 2004, ha una nuova vita come cerchiamo di utilizzarlo per raccogliere nuove intuizioni relative all'immunità adattativa zebrafish.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono zebrafish sono state approvate dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) presso la University of Oklahoma Health Sciences Center.

1. isolare i linfociti T e B Non-maligne da transgenici lck:eGFP pesce

1. Anestetizzare il pesce utilizzando 0,02% tricaina (MS-222) in pesci d'acqua del sistema.
2. Esaminare il pesce di 2 – 6 mesi per thymi fluorescente, che si trovano presso l'aspetto di dorsomedial della cavità branchiale di zebrafish e altri Teleostei¹⁴. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza (470/40 lunghezza d'onda di eccitazione e filtro di emissione 525/50) per rilevare la GFP.
3. Preparare in anticipo 50 mL di 1x filtro-sterilizzato di Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) contenenti 1% fetale bovino del siero e l'1% penicillina-streptomicina (ordinamento media). Supporti inutilizzati ordinamento possono essere memorizzati a 4 ° C fino a 2 mesi.
4. Eutanasia il pesce mettendolo in un becher contenente 0,2% tricaina per circa 5 min, seguita da immersione in bagno ghiaccio. Confermare la morte causata dalla cessazione della circolazione opercular (gill).
5. Mettere il pesce eutanasizzato in una capsula di Petri e dissezionare organi linfoidi di interesse, utilizzando il microscopio a fluorescenza per sezionare la GFP⁺ thymi¹⁴e impostazioni di microscopia del campo luminoso dissezionare il rene del midollo e della milza¹⁵. Risultati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando 3 mesi pesci. Le proporzioni dei linfociti e numeri assoluti variano a seconda dell'età e genotipo (vedi discussione per ulteriori dettagli).
6. Posizionare ogni organo sezionato in una provetta da 1,5 mL contenente 500 µ l di freddo l'ordinamento di media.
7. Omogeneizzare il tessuto sul ghiaccio con un omogeneizzatore di micro-tubo di pestello.
8. Passare tessuto omogeneizzato attraverso un filtro a maglia 35 µm per generare una sospensione unicellulare. Mantenere le cellule su ghiaccio fino all'analisi.

2. isolare linfociti maligni da transgenici doppio rag2:hMYC; lck:eGFP Zebrafish

1. All'inizio della 2-4 mesi, microscopicamente schermo rag2:hMYC; LCK:EGFP pesce per modelli anormali di GFP.
   Nota: le cellule B sono GFP^lo sullo sfondo di lck:eGFP , quindi B-ALL richiede pratica per riconoscere; T-ALL è evidente, perché le cellule T sono GFP^Ciao. Di conseguenza, il rag2:hMYC, lck:eGFP dual-transgenici linea ha due fenotipi: brillantemente-fluorescente T-ALL, che di solito derivano da timo e si estendono nel corpo e scarsamente fluorescente B-ALL.
   1. Utilizzo di un microscopio a fluorescenza, schermo il pesce utilizzando le impostazioni di "bassa esposizione" (200 ms, 2,4 x guadagno) per identificare LAL-T luminoso (Figura 1A) e "alta esposizione" (1,5 s, 3,4 x guadagno) per identificare dim B-ALL (Figura 1A). Controlli WT e pesce pre-leucemiche hanno GFP localizzato solo nel timo (Figura 1B).
2. Anestetizzare ed esaminare il pesce come descritto ai punti 1.1 – 1.2.
3. Categorizzare il pesce basato sulla misura della fluorescenza di GFP, utilizzando un semplice sistema di 3 Categoria:
   Nota: Livello 1: Fluorescenza appare come un tumore timico con solo limitata diffusione locale.
   Livello 2: Fluorescenza appare di là del timo, che coinvolgono < 50% del corpo.
   Livello 3: Fluorescenza si estende oltre il 50% del corpo.
4. Separare il pesce con tutto da quelli senza cancro. Controllo pre-leucemica pesce (cioè, senza tumori GFP⁺ ) una volta mensile per lo sviluppo di nuovo tutti. Da ~ 9 mesi, tutti i rag2:hMYC, lck:eGFP pesce sviluppare LAL-T, B-ALL, o entrambi.
5. Per LAL-T o B cellula di isolamento, selezionare livello 3 pesci (tutti coinvolgendo > 50% del corpo), che producono più di 2 x 10⁶ tutte le cellule e in genere molti di più.
6. Eutanasia il pesce come descritto al punto 1.4.
   Nota: Ci sono due metodi per ottenere tutte le celle: omogeneizzazione e una tecnica di lavaggio peritoneale¹⁶del corpo intero. I metodi differiscono per il numero assoluto delle cellule raccolte per l'ordinamento, e così, la quantità di FACS tempo richiesto e costo (vedi discussione per ulteriori dettagli).
7. Per entrambi i metodi, prima di mettere il pesce eutanasizzato in una capsula di Petri e usando una lama di rasoio, rimuovere la testa compresa la regione timica. Questo può essere elaborato separatamente, se lo si desidera, o utilizzato per la colorazione istologica.
8. Metodo di lavaggio peritoneale
   1. Utilizzando una pipetta P1000, lavare la cavità peritoneale di pesce con 500 µ l di freddo ordinamento media, raccoglie le cellule ed i media in una provetta da 5 mL.
   2. Utilizzando un puntale fresco, iniettare un ulteriore 200 – 300 µ l di freddo media ordinamento nella cavità del corpo. Quindi, usando la punta della pipetta, applicare una leggera pressione per il corpo dei pesci per estrudere le cellule fuori della cavità di corpo. Raccogliere questa media e aggiungere alla provetta da 5 mL.
   3. Ripetere il passaggio 2.8.2 2 – 3 volte. Mantenere le cellule raccolte in ordinamento media sul ghiaccio.
   4. Filtrare la sospensione cellulare anche se una mesh di 35 µm filtrare prima del flusso cytometry/FACS e mantenere le cellule su ghiaccio fino all'analisi.
9. Omogeneizzazione di tutto il corpo
   1. Dopo aver rimosso la testa di pesce, posizionare il corpo in una provetta da 1,5 mL contenente 200 µ l di ordinamento media.
   2. Omogeneizzare il corpo utilizzando un omogeneizzatore di micro-tubo di pestello.
   3. Aggiungere un ulteriore 300 µ l di freddo l'ordinamento di media. Filtrare la sospensione cellulare anche se un filtro a maglia 35 µm. Aggiungere file multimediali ordinamento come necessario per lavare tutte le cellule attraverso il filtro, fino a quando rimane solo detriti del tessuto sul filtro. Mantenere le cellule su ghiaccio fino all'analisi.

3. Cytometric analisi dei linfociti B normali o maligni

1. Impostare l'analisi cytometric di flusso e/o parametri FACS secondo la guida del produttore.
2. Acquisire il numero di eventi per caratterizzare inizialmente il campione desiderato. Analizzare 1 x 10⁴ a 5 x 10⁴ eventi prima dell'ordinamento alla determinazione di specifiche porte per i successivi passaggi di ordinamento.
   1. Determinare i cancelli: definire dei linfociti e cellule progenitrici delle cellule Gate utilizzando forward scatter (FSC) e i parametri di dispersione (SSC) di lato, escluse detriti cellulari (Figura 2A-C)¹⁷. FSC e SSC corrispondono alle dimensioni/diametro delle cellule e granularità, rispettivamente.
      Nota: GFP^–, GFP^loe^Ciao cellule GFP differiscono da 10-100-piegatura in termini di loro intensità di fluorescenza di GFP, rendendo la separazione di queste popolazioni semplice (figure 2-5). Vive-morte discriminazione può essere valutata a questo punto utilizzando iodio propidio (PI) o 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) vitalità colorazione. Precedenti esperimenti con PI dimostrano tipicamente > 95% attuabilità delle cellule GFP⁺ dopo FACS.
   2. Escludere i doppietti di cella, secondo i parametri della macchina FACS utilizzato.
   3. All'interno dei cancelli linfoidi e/o precursore, determinare il numero e la percentuale di cellule GFP⁺ .
3. Utilizzare ficoeritrina (PE) e intensità di GFP, definire il cancello per GFP^– vs GFP^lo vs^Ciao cellule GFP.
   Nota: Le cellule B presentano fluorescenza GFP dim e T cellule mostrano brillante GFP nelle linee di lck:eGFP . Molti organi linfoidi o campioni tumorali contengono entrambe le popolazioni GFP⁺ . LAL-B sono cellule/B-ALL GFP^lo e T-stirpe cellule/T-tutti sono GFP^Ciao. Definire gate di distinguere tra GFP^–, GFP^loe^Ciao cellule GFP e raccogliere queste popolazioni separatamente(Figura 2A-C, Figura 3A-C, Figura 4A e Figura 5a).
4. Ordinare ogni popolazione di cellule in provette di polipropilene diverse 15 mL contenente 2 mL di ordinamento media o direttamente in tubi diversi 1.5 mL contenente un tampone appropriato per ulteriori analisi (ad es., RNA, DNA o estrazione di proteine, allo-trapianto, ecc.).
5. Mantenere le cellule purificate su ghiaccio prima di ulteriori analisi.

Risultati

Abbiamo usato il flusso cytometry per analizzare e FACS per isolare GFP^lo e GFP^Ciao cellule da timo, midollo del rene e la milza di zebrafish transgenici lck:eGFP . Analisi di pesce 3-month-old ha rivelato che il timo contenuto principalmente i linfociti GFP⁺ . Le cellule GFP⁺ in gran parte sono state limitate al cancello linfoide precedentemente descritto da Traver et al.¹⁷. Due popolazioni distinte di GFP^+...

Discussione

Abbiamo sviluppato e fornire un protocollo per isolare le cellule B da lck:eGFP zebrafish transgenici, l'aggiunta di questo ad altri modelli di d. rerio con B-stirpe etichette^3,4. Abbastanza sorprendentemente, l'identificazione delle GFP^lo B cellule in questa linea passò inosservato dalla relativa descrizione nel 2004. In genere, lck è considerato specifico delle cellule T⁶, ma recenti studi trovano ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030