Изоляция злокачественные и Non-злокачественные клетки B от lck:eGFP данио рерио

Резюме

Данио рерио трансгенных lck:eGFP Экспресс GFP высоко в Т-лимфоцитов и были использованы для изучения развития Т-клеток и острый лимфобластный лейкоз. Эта строка может использоваться для исследования B клеток, которые выражают lck на более низких уровнях. Этот протокол описывает очищение злокачественных и доброкачественных клеток B от lck:eGFP рыбок данио.

Аннотация

Данио рерио (Danio рерио) являются мощным модель для изучения развития лимфоцитов. Как и млекопитающие D. рерио обладают адаптивной иммунной системы, которая включает B и T лимфоциты. Исследования у рыбок данио лимфопоэза трудны, потому что антитела, признавая D. рерио клеток поверхностных маркеров, как правило, не доступны, осложняющих изоляции и характеристика лимфоцитов различных групп населения, включая B-линии клетки. Трансгенные линии с Флюорофор линии конкретного выражения часто используются для обхода этой проблемы. Линия трансгенных lck:eGFP был использован для изучения развития D. рерио Т-клеток и также использовались для разработки модели Т-клеток и острый лимфобластный лейкоз (T-ALL). Хотя рыбы lck:eGFP широко использовались для анализа T-линии, они не использовались для изучения B клеток. Недавно мы обнаружили, что многие данио рерио B клетки также выразить lck, хотя и на более низких уровнях. Следовательно клетки lck:eGFP B также выразить низкий уровень GFP. Основываясь на этот вывод, мы разработали протокол, чтобы очистить клетки B-линии от lck:eGFP данио рерио, который мы приводим здесь. Наш метод описывает, как использовать люминесцентные активации клеток сортировщик (FACS) очищает клетки от lck:eGFP рыбы или связанные линии, такие как двойной трансгенных rag2:hMYC; LCK:eGFP рыбы. В этих строках, B клеток, особенно незрелые клетки B, Экспресс GFP на низкой, но обнаружить уровнях, позволяя им следует отличать от Т-клеток, которые выражают GFP высоко. B клетки могут быть изолированы от костного мозга, тимуса, селезенки, крови или других тканей. Этот протокол обеспечивает новый метод для очистки д рерио B клетки, включение исследований было сосредоточено на такие темы, как развитие B-клеток и лимфоцитов злокачественных опухолей.

Введение

Данио рерио предлагают мощные атрибутов, таких как генетические manipulability, высокая плодовитость, Оптическая прозрачность и быстрое развитие которые облегчают изучение развития позвоночных, использованием генетических подходов. Эти преимущества, вместе с общей характеристики костистых и млекопитающих кроветворения, делают D. рерио идеально подходит для в-vivo анализ функции лимфопоэза и лимфоцитов, от их раннее появление в личинки всей взрослой жизни. Развития крови в zebrafish опирается на хорошо сохранившихся генетических процессов, которые являются общими с млекопитающих, и они распространяются на адаптивной иммунной системы. Кроме того молекулярные механизмы, регулирующие развитие лимфоидных удивительно консервируют между¹данио рерио и млекопитающих.

За последние 2 десятилетия трансгенных D. рерио линии что ярлык конкретные крови линий и мутантных линий дефицит этих линий были созданы^2,3,4,5. Один из них, трансгенные линии lck:eGFP , использует данио рерио лимфоцитов белки тирозин киназы (lck) промоутер водить GFP выражение⁶. Этот ген, который сильно выраженные T-линии прекурсоров и зрелых Т-лимфоцитов, позволяет в естественных условиях, отслеживание развития тимуса Т-клеток и ex vivo очистки T-линии клеток, СУИМ⁷. Ранее мы использовали эту строку вперед генетические экране мутагенеза ENU для идентификации микрофлорой мутантов склонны к T-все и учиться соматически приобретенных генетических событий, связанных с Т-клеток онкогенеза^8,9.

Недавно Наша лаборатория расширена Утилита lck:eGFP рыбок данио. В двойной трансгенных rag2:hMYC (человеческий MYC), lck:eGFP D. рерио , которые известны для разработки T-все ¹⁰, мы обнаружили, что B-линии все также происходят¹¹. В отличие от T-все в этой модели, которая ярко флуоресцировать благодаря высокая экспрессия гена GFP, B-все тускло люминесцентные из-за низких уровней GFP, позволяя рыбы с B-все следует отличать грубо от тех, с T-все с флуоресцентной микроскопии. Этот дифференцированный экспрессия гена GFP также позволяет разделение клетки GFP^Ло B-все от GFP^Привет T-все клетки с помощью СУИМ¹¹. Кроме того низкий lck выражение не является уникальным для данио рерио B-все, как человека B-все также Ускоренная низкий уровень LCK^11,12. Аналогичным образом, нормальные клетки B-линии D. рерио, мышей и людей также выразить низкий уровень lck/Lck/LCK, с незрелые клетки с высоким выражение^11,13. На основе клеток в клетки B-линия в lckeGFP данио рерио или производной линии Экспресс 1-10% столько GFP как Т-лимфоцитов. Эти GFP^Ло клетки Экспресс характеристикой клетки B мРНК, например pax5, cd79b, blnk, БТК, ighm, ighzи другие и может быть очищен от костного мозга, тимуса, селезенки или периферической ¹¹крови. Таким образом оба B - и T-линии клетки могут быть изолированы от lckeGFP данио рерио и в случае rag2hMYC, lckeGFP животных, B - и T-все клетки также¹¹.

Здесь мы представляем наш протокол эффективно очищают СУИМ доброкачественные клетки B от lck:eGFP данио рерио и доброкачественные или злокачественные клетки B rag2hMYC; LCK:eGFP рыбы, с использованием различных источников тканей. Такие клетки можно также выразить количественно подачей cytometry без изоляции СУИМ, при желании. Обнаружение низких lck выражения- и следовательно, низкая экспрессия гена GFP-от B клеток открывает новые возможности экспериментальных возможностей для lckeGFP данио рерио, такие, как в естественных условиях B ячейки развития исследований. Таким образом это трансгенные линии, впервые сообщалось в 2004 году, имеет новую жизнь, как мы стремимся использовать его для сбора свежих идей, касающихся данио рерио адаптивного иммунитета.

протокол

Все процедуры, связанные с данио рерио были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете штата Оклахома медицинских наук центр.

1. изоляция Non злокачественное B и T-лимфоцитов от трансгенных lck:eGFP рыбы

1. Анестезировать рыбы с использованием tricaine (MS-222) 0,02% в воде рыбы системы.
2. Изучите 2 – 6 месяца рыбы для флуоресцентной thymi, которые расположены в дорсомедиального аспект жаберных полости данио рерио и другие teleosts¹⁴. Воспользуйтесь помощью эпифлуоресцентного микроскопа (470/40 длина волны возбуждения и фильтра выбросов 525/50) для обнаружения гена GFP.
3. Заранее подготовьте 50 мл фильтр стерилизованные 1 x Розуэлл парк Мемориальный институт среднего (RPMI) содержащий 1% плода говядину сыворотки и 1% пенициллин стрептомицином (сортировки СМИ). Неиспользуемые сортировки СМИ могут храниться при температуре 4 ° C на срок до 2 месяцев.
4. Усыпить рыбы, поместив его в стакан, содержащие 0,2% Tricaine около 5 минут, затем льда Ванна погружения. Подтвердите смерть, прекращение движения opercular (Гилл).
5. Место Усыпленных рыбы в чашку Петри и вскрыть лимфоидных органов, представляющих интерес, используя флуоресцентный микроскоп для того чтобы рассечь GFP⁺ thymi¹⁴и параметры микроскопии яркие поля для того чтобы рассечь почек костного мозга и селезенки¹⁵. Здесь представлены результаты были получены с помощью 3 месячного рыбы. Лимфоцитов пропорции и абсолютные цифры зависят от возраста и генотип (см. обсуждение для более подробной информации).
6. Место каждого расчлененных органа в 1,5 мл трубка, содержащая 500 мкл холода, сортировка СМИ.
7. Однородный ткани на льду, с использованием гомогенизатора микро Тюбе пестиком.
8. Гомогенизированные ткани проходят через сетчатый фильтр 35 мкм для создания одной ячейки подвеска. Держите клетки на льду до анализа.

2. изоляция злокачественные лимфоциты от двойной трансгенных rag2:hMYC; lck:eGFP данио рерио

1. Начало в 2-4 месяца, микроскопически экран rag2:hMYC; LCK:eGFP рыбы для ненормальных GFP шаблонов.
   Примечание: клетки B настолько GFP^Ло в фоновом режиме lck:eGFP , B-все требует практики, чтобы признать; T-все очевидно, потому что Т-клетки являются GFP^Привет. Следовательно, rag2:hMYC, lck:eGFP двойной трансгенные линии имеет два фенотипов: ярко люминесцентные T-ALL, которые обычно возникают из тимуса и расширить в тело и тускло люминесцентные B-все.
   1. С помощью флуоресцентного микроскопа, экран рыбы с помощью параметров «низкого воздействия» (200 мс, 2.4 x прибыль) для выявления яркие T-ALL (рис. 1A) и «высокие уровни воздействия» (1,5 s, 3.4 x прибыль) для выявления Дим B-ALL (рис. 1A). WT контроля и предварительно лейкозных рыбы имеют GFP локализуется только в вилочковой железы (рис. 1B).
2. Анестезировать и изучить рыбы, как описано в шагах 1.1-1.2.
3. Классифицировать рыб, основанные на степени GFP флуоресценции, с помощью простой системы три категории:
   Примечание: Уровень 1: Флуоресценции появляется как вилочковой железы опухоль с только ограниченные местные распространения.
   Уровень 2: Флуоресценции появляется вне тимуса, с участием < 50% тела.
   Уровень 3: Флуоресценции выходит за пределы 50% тела.
4. Отделяйте рыба все из тех, кто без рака. Контролировать предварительно лейкозных рыбы (т.е., рыбы без опухоли GFP⁺ ) однажды ежемесячно для развития новой все. ~ 9 месяцев, все rag2:hMYC, lck:eGFP рыбы развивать T-ALL, B-все, или оба.
5. Для T - и B-все ячейки изоляции, выберите уровень 3 рыбы (все с участием > 50% тела), которые дают более чем 2 x 10-⁶ все ячейки и как правило многое другое.
6. Усыпить рыбы как шаг 1.4.
   Примечание: Существует два метода для получения всех клеток: весь организм гомогенизации и перитонеальной мыть техника¹⁶. Методы отличаются в абсолютное количество собранных для сортировки клеток, таким образом, количество СУИМ времени и необходимых и стоимости (см. обсуждение для более подробной информации).
7. Для любого метода сначала место Усыпленных рыбы в чашку Петри и с помощью лезвия бритвы, удалить головы, включая тимуса региона. Это могут быть обработаны отдельно, если желаемого, или использоваться для гистологической пятнать.
8. Перитонеальные мыть метод
   1. С помощью пипетки P1000, мойте рыбы брюшной полости с 500 мкл холода, сортировка СМИ, собирая клетки и СМИ в 5 мл.
   2. С помощью кончика свежие пипетки, придать еще 200 – 300 мкл холодной сортировки СМИ в полость тела. Затем используя кончиком пипетки, примените нежное давление к телу рыбы для выдавливания клетки из полости тела. Собирать этот носитель и добавьте 5 мл.
   3. Повторите шаг 2.8.2 2 – 3 раза. Сохранить собранные клетки в сортировке СМИ на льду.
   4. Фильтрации суспензии клеток, хотя 35 мкм сетки фильтра до потока цитометрии/СУИМ и сохранить клетки на льду до анализа.
9. Всего тела гомогенизации
   1. После удаления Рыбья голова, место тела в 1,5 мл тубы 200 мкл сортировки СМИ.
   2. Однородный тела с использованием гомогенизатора микро Тюбе пестиком.
   3. Добавьте дополнительные 300 мкл холода, сортировка СМИ. Фильтрации суспензии клеток, хотя сетчатый фильтр 35 мкм. Добавление сортировки СМИ при необходимости мыть все клетки через фильтр, пока только ткани мусор остается на фильтре. Держите клетки на льду до анализа.

3. анализ гранулярных лимфоцитов B нормальной или злокачественных

1. Установите гранулярных анализ потока и/или СУИМ параметры согласно руководству производителя.
2. Приобрести нужное количество событий для первоначально характеризуют образца. Анализ⁴ 1 x 10-5 х 10⁴ события до сортировки для определения конкретных ворота для последующей сортировки шаги.
   1. Определить ворота: определить лимфоцитов и прогениторных клеток ворота с использованием точечной вперед (FSC) и стороны точечной (SSC) параметры, за исключением сотовой мусора (рисунок 2A-C)¹⁷. FSC и SSC соответствуют размер/диаметр ячеек и гранулярности, соответственно.
      Примечание: GFP^–, GFP^Лои GFP^Привет клетки отличаются 10-к-100-раз с точки зрения их интенсивности флуоресценции GFP, делая разделение этих популяций простой (на рисунках 2-5). Жить мертвый дискриминации можно оценить на данном этапе с помощью пропидий йода (PI) или окрашивание жизнеспособности D (7-AAAD) 7-aminoactinomycin. Предыдущие эксперименты с PI обычно демонстрируют > 95% жизнеспособность клеток GFP⁺ после СУИМ.
   2. Исключите ячейки Дуплеты, согласно параметрам машина СУИМ.
   3. В пределах лимфоидной или прекурсора ворот Определите количество и процент клеток GFP⁺ .
3. Фикоэритрин (PE) и интенсивности GFP, определить ворота для GFP^– vs. GFP^Ло против GFP^Привет клетки.
   Примечание: Клетки B экспонат Дим GFP флуоресценции и Т-клетки Показать яркие GFP в lck:eGFP линиях. Многие лимфоидных органов или опухоль образцы содержат оба GFP⁺ населения. B-линии клетки/B-все GFP^Ло и T-линии клетки/T-все являются GFP^Привет. Определить ворота различать GFP^–, GFP^Лои GFP^Привет клетки и собирать эти популяции отдельно (рисунок 2A-C, рисунок 3A-C, Рисунок 4A и Рисунок 5а).
4. Сортировки каждой популяции клеток в различных 15 мл полипропиленовые пробирки, содержащие 2 мл сортировки СМИ, или непосредственно в различных 1,5 мл пробирки, содержащие соответствующий буфер для дальнейшего анализа (например, РНК, ДНК или белка добычу, Алло трансплантации, и т.д.).
5. Держите очищенной ячейки на льду до дальнейшего анализа.

Результаты

Мы использовали проточной цитометрии для анализа и СУИМ изоляции КГВ^Ло и GFP^Привет клетки вилочковой железы, почки костного мозга и селезенки lck:eGFP трансгенных данио рерио. Анализ 3-месячного рыбы показал, тимуса содержит главным образом GFP⁺ лимфоц...

Обсуждение

Мы разработали и предоставляют протокол изолировать B клеток от lck:eGFP трансгенных данио рерио, добавляя это для других моделей D. рерио с B-линии этикетки^3,4. Немного удивительно идентификации GFP^Ло B клеток в этой линии незамеченным с ее описа?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 µm mesh	Sefar Filter technology	7050-1220-000-13
5 mL Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap	Falcon Corning Brand	352235
50 mL conical tube	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Fluorescent microscope	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	Nikon
Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Fetal bovine Serum	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
lck:eGFP			See Langeneu et al., 2004
NIS Elements software	Nikon	Version 4.13
Penicilin-Streptomycin	Sigma	P4333
Pestle micro-tube homogenizers	Electron Microscopy Sciences	64788-20
Plastic Transfer pippetes
rag2:hMYC-ER			See Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030