جمع التنفس من الأطفال لاكتشاف العلامات البيولوجية المرض

Summary

ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة للحصول على عينات التنفس من الأطفال. بإيجاز، وعينات هواء مختلطة قبل يتركز في أنابيب ماصة قبل التحليل اللوني للغاز-قياس الطيف الكتلي. يمكن تحديد المؤشرات الحيوية التنفس من الأمراض المعدية وغير المعدية باستخدام هذا الأسلوب جمع التنفس.

Abstract

يمكن استخدام التنفس جمع وتحليل لاكتشاف المؤشرات الحيوية متقلبة في عدد من الأمراض المعدية وغير المعدية، مثل الملاريا والسل وسرطان الرئة وأمراض الكبد. هذا البروتوكول وصف أسلوب استنساخه لأخذ عينات التنفس في الأطفال واستقرار ثم عينات التنفس لمزيد من التحليل مع الفصل اللوني للغاز-الكتلي (GC-MS). والهدف من هذا الأسلوب وضع بروتوكول موحد للحصول على عينات التنفس لمزيد من التحليل الكيميائي، من الأطفال الذين تتراوح أعمارهم بين 4 سنوات و 15 سنة. أولاً، هو عينات التنفس استخدام لسان حال الورق المقوى تعلق بصمام 2-الطريق، الذي يرتبط بكيس 3 لتر. ثم نقل إلى أنبوب الامتزاز حراري تحليلها التنفس والمخزنة في 4-5 درجة مئوية حتى التحليل. وقد استخدمت هذا الأسلوب سابقا لالتقاط النفس للأطفال المصابين بالملاريا لتحديد العلامات البيولوجية التنفس ناجحة. في وقت لاحق، نحن قد طبقت بنجاح هذا الأسلوب للافواج طب إضافية. وميزة هذا الأسلوب هو أنه يتطلب تعاون الحد الأدنى على جزء من المريض (للحصول على قيمة خاصة في طب الأطفال من السكان)، وفترة قصيرة جمع، لا يتطلب موظفين مدربين، ويمكن تنفيذها مع الأجهزة المحمولة في إعدادات الحقل ذات الموارد المحدودة.

Introduction

المؤشرات الحيوية يمكن أن تسفر عن معلومات قيمة عن العمليات البيولوجية العادية والمرضية التي قد تساهم في المرض سريرياً يمكن تحديدها. في الآونة الأخيرة، كان هناك اهتمام متزايد في تقييم التنفس التطاير كالمؤشرات الحيوية لمجموعة متنوعة من الحالات المرضية، بما في ذلك العدوى والاضطرابات الأيضية والسرطان ¹. التنفس الزفير يحتوي على مستويات قابلة للقياس الكمي للمركبات العضوية المتطايرة (VOCs) والمركبات العضوية شبه المتطايرة والمواد المشتقة ميكروبيالي (مثلاً، الأحماض النووية من البكتيريا والفيروسات). الهدف المركزي لتحليل التنفس الزفير التبصر في حالة وجود حالة طبية و/أو التعرض البيئي غير إينفاسيفيلي. وهناك أساليب مختلفة لجمع وتحليل التنفس الزفير، اعتماداً على مكونات هذه الفائدة. لا يوجد حاليا أي أسلوب جمع التنفس الزفير موحدة، مما يزيد من تعقيد التحليل المقارن للنتائج عبر الدراسات. توحيد إجراءات جمع التنفس ضروري، كإجراءات أخذ العينات نفسها قد أثر كبير على نتائج تحليل التنفس المتلقين للمعلومات.

في العديد من الدراسات، يتم أخذ عينات التنفس الرئوي أواخر العاملين^2،3. أخذ العينات هذا ينطوي على تجاهل الجزء الأولى من التنفس الزفير ("الفضاء الميت")، من أجل التقاط الهواء تفضيلي في نهاية دورة التنفس. وميزة هذه الاستراتيجية أنه يقلل مستويات خارجية المركبات العضوية المتطايرة (مثل البيئة المركبات العضوية المتطايرة)، حين إثراء للمركبات العضوية المتطايرة الذاتية، الخاصة بالمريض. ويستثنى هذا الأسلوب الثواني القليلة الأولى من زفير من فرد قبل جمع العينة التنفس. غيرها من المحققين قد استخدمت جهاز استشعار ضغط لتنشيط العينات خلال مرحلة محددة مسبقاً من انقضاء^4،5. لأنها تتطلب أجهزة استشعار الضغط الهندسية المعقدة، يتطلب هذا الأسلوب البديل جهاز أخذ عينات مخصصة ومكلفة نسبيا.

طب التنفس أخذ العينات يمكن أن يكون تحديا كبيرا. أحد الشواغل رئيسية أن الأطفال الصغار قد تكون غير قادر على التعاون مع بروتوكولات للتبرعات زفير الهواء "قتلى الفضاء". لهذا السبب، فإنه من الأسهل الحصول على التنفس الرئوي مختلطة من الأطفال. تحذير رئيسية مع عينات التنفس الرئوي مختلطة غير خطر التلوث البيئي والمادي. ولذلك، إمكانية جمع طب الأطفال مصدر قلق قيادة في الميدان.

وبالإضافة إلى ذلك، إلى أساليب جمع، تخزين عينات التنفس يمكن أن تؤثر أيضا على نوعية العينة. ارتفاع نسبة الرطوبة في التنفس اكسهالاتي وتركيزات منخفضة للغاية (أجزاء كل تريليون) التنفس العضوية المتطايرة المركبات جعل التنفس العينات المعرضة بشكل خاص للمشاكل المتعلقة بالتخزين^6،7. وعلى الرغم من الإمكانات الكبيرة للتقنيات في الوقت الحقيقي مثل بروتون نقل رد فعل-الكتلي (PTR-مرض التصلب العصبي المتعدد)، يظل GC-MS المعيار الذهبي لتحليل عينات التنفس. منذ GC-MS تحليل عينات التنفس أسلوب غير متصل، فإنه يقترن بأساليب الاعتقال السابقة مثل أنابيب الامتزاز الحراري (TD) والمرحلة الصلبة الصغيرة-استخراج إبرة فخ الأجهزة. قبل الاعتقال السابقة، تحتاج إلى عينات التنفس ليتم تخزينها مؤقتاً في أكياس البوليمر⁸. أكياس البوليمر تحظى بشعبية بسبب أسعارها معتدلة، ومتانة جيدة نسبيا، وإعادة استخدام. في حين يمكن إعادة استخدام أكياس، الوقت والجهد ضرورية لضمان كفاءة التنظيف^7،8. يتطلب كل نوع حقيبة محددة أيضا إجراءات تجريبية حازمة وموحدة لمراقبة الجودة، وإعادة استخدام، والانتعاش.

أنابيب TD تستخدم على نطاق واسع للتنفس قبل تركيز لأنها التقاط عدد كبير من التطاير ويمكن تخصيصها. قد تكون المواد الماصة المستخدمة للتغليف والأنابيب TD تكييفها مع تطبيقات معينة والتطاير هدف معين من الفائدة. أنابيب TD إلى حد كبير تحسين راحة التنفس الدراسات العلامات البيولوجية، لا سيما في المواقع الميدانية النائية، نظراً لأن أنابيب TD بأمان تخزين التطاير التنفس لمدة أسبوعين على الأقل، وهي سهلة النقل³.

في محاولة لتوحيد جمع طب التنفس لاكتشاف العلامات البيولوجية، هنا يصف لنا طريقة بسيطة لجمع التنفس من الأطفال الصغار. لتوضيح نتائج تنفيذها بروتوكولات تمثيلية، وترد البيانات إزالة الألغام التي تم تحديدها من فوج الجارية الأطفال (سن 8-17) يجري تقييم للمرض الأحماض الدهنية في الكبد (NAFLD). وستبلغ النتائج الكاملة والتحليل لهذه الدراسة في نشرة لاحقة. في هذا العمل، نحن تقرير مجموعة فرعية من البيانات لإثبات تطبيق البروتوكول، لدينا. وباختصار، الأطفال هي تعليمات الزفير عادة عن طريق بوق في كيس من بوليمر، كما لو كان "تهب بالون". يتم تكرار العملية 2-4 مرات حتى يتم جمع 1 لتر التنفس. العينة ثم تحويلها إلى أنبوب TD وتخزينها في 5 درجة مئوية قبل تحليل GC-MS.

Protocol

الدراسة قد أقرها "المؤسسية استعراض المجلس لواشنطن كلية الطب بجامعة" (#201709030). تم الحصول على الموافقة المستنيرة من أحد الوالدين أو الوصي القانوني قبل إدراجها في الدراسة. استنساخ الصور الفوتوغرافية في الشكل 2 موافقة الوالدين مستنيرة مكتوبة.

1-التنفس العينات الجمعية

1. استخدام القفازات المتاح، إرفاق لسان حال الورق المقوى لعينات التنفس، كما هو مبين في تكميلية الشكل 1. إرفاق مدة قصيرة من أنابيب كبيرة قطرها إلى الطرف الآخر عينات التنفس، كما هو مبين في تكميلية الشكل 1. استخدام أنابيب جديدة لكل مريض.
2. توصيل موصل التنفس إلى صمام الكيس عن طريق الأنابيب. انظر الشكل 1 لصور عينات التنفس وحقيبة متصلة.
3. تشغيل ثومبسكريو مخرش على جانب المدخل المناسب عكس اتجاه عقارب الساعة لفتح الصمام ودفع الجذع صمام حقيبة أسفل، لفتح المدخل المناسب لأخذ العينات.
4. تأمين فتح صمام، بتحول ثومبسكريو مخرش على جانب المدخل المناسب في اتجاه عقارب الساعة.
5. التأكد من أن الصمام الأزرق على عينات التنفس مفتوح (بالتوازي مع الموصل).
6. كتابة معرف المريض والتاريخ والوقت على تسمية الحقيبة البوليمر.
7. وأوصت الشرط TD أنبوب ماصة قبل التنفس باستخدام مجموعة إجراءات (المتاحة من مصنعي الفردية). كاب وتخزين أنابيب الامتزاز الحراري في 4 – 5 درجة مئوية قبل جمع التنفس للتقليل من القطع الأثرية.

2-التنفس جمع

1. إجراء مظاهرة زفير التنفس للطفل باستخدام عينة نفسا (بدون حقيبة). اشرح للطفل ينبغي أن تنفس مثل أنها سوف تفعل عندما "تفجير بالون" ومواصلة التنفس قدر ما أنها يمكن بشكل مريح. وضع لسان الورق المقوى بين الشفاه الخاص بك والزفير بقدر ما تستطيع.
2. تزويد الطفل بعينه نفسا جديدة مرفقة بكيس وأطلب منهم أن الزفير كما هو الحال في المظاهرة، كما هو مبين في الشكل 2.
3. إغلاق صمام الأزرق على جهاز التنفس العينات فور انتهاء الطفل التنفس. فتح الصمام حسب الحاجة قبل المتشرب إضافية.
4. كرر الخطوة 2، 2 و 2-3 حتى تم جمعها على الأقل 1 لتر التنفس. لطفل سليم وهذا قد يستغرق المتشرب 2، المتشرب الأطفال الصغار أو المرضى 2 – 4. 1 لتر التنفس هو الحد الأدنى من المتطلبات التحليلية. مذكرة بشأن التسمية حقيبة الأنفاس كم جمعت من المريض. انظر تكميلية الرقم 2 لصور حقيبة تحتوي على أحجام مختلفة من التنفس.
5. قبل فصل الكيس من عينات التنفس، تأكد لتخفيف ثومبسكريو مخرش على جانب المدخل المناسب بتحويلها الفيلتر ودفع ساق الصمام حتى إغلاق المدخل المناسب. انظر تكميلية الشكل 3 لصور صمام حقيبة في موقف المفتوحة والمغلقة.
6. قفل صمام حقيبة مغلقة عن طريق تحويل ثومبسكريو مخرش على جانب المدخل المناسب في اتجاه عقارب الساعة.
7. فصل الكيس من عينات التنفس.
8. التصرف بلسان وتنحية عينات التنفس للتنظيف قبل استخدامها مع مريض آخر.

3-التنفس نقل أنابيب الامتزاز الحراري

1. إزالة أنبوب TD من الثلاجة. إزالة قبعات أنبوب ماصة، استخدام أداة وضع حد أقصى uncapping الأنبوبة المتوفرة من قبل الشركة المصنعة للتخزين طويل الأجل.
2. إرفاق مخدد نهاية أنبوب ماصة TD الحقيبة أخذ العينات باستخدام أنابيب. لاحظ أن اتجاه أنبوب المهم، ك TD تستهدف أنابيب الهواء تتدفق في اتجاه واحد فقط، ابتداء من نهاية مخدد. علما بأن نقل التنفس من حقيبة للدفتيريا وينبغي أن يتم داخل 1 ساعة جمع التنفس.
3. إدراج الطرف الآخر من الأنبوب TD في الأنبوب، الذي يرتبط بمضخة.
4. تشغيل المضخة وتعيين لتشغيل في 100 مل/دقيقة لمدة 10 دقائق.
5. فتح الصمام على الحقيبة التي تحول ثومبسكريو مخرش على جانب مدخل تركيب الفيلتر ودفع الجذع صمام وصولاً إلى فتح المدخل المناسب. وهذا يتضح في تكميلية الشكل 4، مما يدل على نقل التنفس في أنبوب ماصة TD استخدام مضخة.
6. بدء تشغيل المضخة، التي سوف تتوقف بعد 10 دقائق من جمع.
7. إزالة أنبوب ماصة TD وتشديد القبعات على كلا طرفي باستخدام أداة وضع حد أقصى uncapping الأنبوبة. يجب تشديد قبعات التخزين طويل الأجل بحزم بغية ضمان ختم تسرب ضيق.
8. وضع ملصق على نهاية سقف واحد للإشارة إلى الأنبوب قد استخدمت. على الملصق، تشير إلى التاريخ ورقم تعريف (ID) دراسة المريض.
9. وضع أنبوب في كيس من بلاستيك يمكن إعادة إغلاقها بشرط صغير. تخزين أنبوب ماصة في 4-5 درجة مئوية. اضغط بقية التنفس خارج الحقيبة وتجاهل حقيبة. سجل دراسة المريض معرف, TD أنبوب الرقم التسلسلي، وجمع يوم، وقت جمع التنفس، وقت نقل التنفس، وتناول الطعام (وقت تناول الطعام قبل جمع التنفس ووجبات الطعام المستهلكة).

4-جمع الهواء المحيط

1. جمع عينات الهواء المحيط في بيئة المريض فورا بعد جمع التنفس.
   1. إرفاق الحقيبة إلى منفذ مخرج المضخة باستخدام أنابيب، كما هو موضح في تكميلية الشكل 5.
   2. دفع الجذع صمام حقيبة وصولاً إلى فتح المدخل المناسب لأخذ العينات.
   3. تأمين فتح صمام بتحويل اتجاه عقارب الساعة ثومبسكريو مخرش على جانب المدخل المناسب.
2. تشغيل المضخة وتعيين لتشغيل في 100 مل/دقيقة لمدة 12 دقيقة. سيتم جمع المضخة 1,200 مل هواء المحيط.
3. بعد أن تم جمعها الحجم المطلوب، ترخي ثومبسكريو مخرش على جانب المدخل المناسب بتحويلها الفيلتر ودفع ساق الصمام حتى إغلاق المدخل المناسب.
4. قفل صمام حقيبة مغلقة عن طريق تحويل اتجاه عقارب الساعة ثومبسكريو مخرش على جانب المدخل المناسب.
5. فصل الكيس من المضخة.
6. اتبع نفس الخطوات كما هو الحال في الباب 3. والفرق الوحيد هو أن الهواء المحيط سيتم نقل المركبات العضوية المتطايرة، ليس تلك من التنفس.

5-العينة وتحليل البيانات

ملاحظة: شروط لتحليل عينات التنفس والهواء قد سبق وصفها⁹.

1. تحليل البيانات التي تم جمعها، والكشف عن المركبات في تشروماتوجرامس. استخدام البرامج النموذجية للعثور والتعرف على جميع مركبات الكشف عنها بواسطة الصك (الشكل 3A). على سبيل المثال، استخدم ميزة deconvolution للتعرف على المركبات. تصفية البيانات باستخدام عامل حجم النافذة الاحتفاظ من 80، مرتفعات كتلة مرشحات إيه وان زيرو زيرو حساب، وحساب المجال مطلقة مجمع تصفية إيه فايف زيرو زيرو.
2. استخدام المعايير الكيميائية لمركبات الهوية في عينات التنفس والهواء. استخراج منطقة الذروة أيون قاعدة المركبات ذات الأهمية، مثل أيسوبرين وبيتا-بينين (الشكل 4)، ومقارنة مستويات التطاير في التنفس والهواء.

النتائج

وفي دراستنا، تمر التنفس وجمعت عينات من الأطفال 10 (8-17 سنة) التقييم في مستشفى سانت لويس "الأطفال". عينات التنفس وعينات الهواء المحيط (n = 10) وقد تم جمع كما هو موضح أعلاه. تم تحليل العينات باستخدام الامتزاز الحراري، والفصل اللوني للغاز الرباعي وقت الطيران الطيف الكتلي (GC-قط...

Discussion

وعلى الرغم من التقدم الكبير في التنفس للبحث على مدى العقد الماضي، تظل ممارسات موحدة لأخذ العينات وتحليل للتنفس الغاز التطاير غير معرف¹⁰. وكان سبب الرئيسي لهذا الافتقار إلى التوحيد تنوع أساليب جمع التنفس، التي لها تأثير مباشر على تنوع الكيميائية الناتجة عن هذا في أي نموذج معين...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")