Collezione di respiro dai bambini per la scoperta di Biomarker di malattia

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo semplice per l'acquisizione di campioni di aria espirata da bambini. Brevemente, campioni di aria mista pre-sono concentrati in tubi sorbente prima dell'analisi gas cromatografia spettrometria di massa. Biomarcatori di respiro delle malattie infettive e non infettive possono essere identificati usando questo metodo di raccolta di respiro.

Abstract

Analisi e raccolta di respiro può essere utilizzati per scoprire volatili biomarcatori in un certo numero di malattie infettive e non infettive, come la malaria, la tubercolosi, cancro ai polmoni e affezione epatica. Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per il campionamento di respiro nei bambini e quindi stabilizzare campioni di aria espirata per ulteriori analisi con spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS). L'obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standardizzato per l'acquisizione di campioni di aria espirata per ulteriore analisi chimica, da bambini di 4-15 anni. In primo luogo, respiro viene campionata utilizzando un boccaglio cartone attaccato ad una valvola 2 vie, che è collegata ad un sacchetto di 3L. Respiro analiti sono poi trasferiti in una provetta di desorbimento termico e conservati a 4-5 ° C fino all'analisi. Questa tecnica è stata utilizzata in precedenza per catturare il respiro dei bambini con la malaria per identificazione di biomarcatori di successo respiro. Successivamente, abbiamo applicato con successo questa tecnica per ulteriori coorti pediatriche. Il vantaggio di questo metodo è che esso richiede la cooperazione minimo da parte del paziente (di particolare valore nella popolazione pediatrica), ha un periodo di breve raccolta, non richiede personale specializzato e può essere eseguita con apparecchiature portatili in impostazioni del campo di risorse limitate.

Introduzione

Biomarcatori possono fornire preziose informazioni circa processi biologici normali e patologici che possono contribuire alla malattia clinicamente identificabile. Recentemente, c'è stato un crescente interesse nella valutazione di sostanze volatili respiro come biomarcatori per una varietà di Stati di malattia, compreso l'infezione, disordini metabolici e cancro ¹. Espirata contiene livelli quantificabili di composti organici volatili (COV), composti organici semi-volatili e microbica derivato materiale (ad es., acidi nucleici da batteri e virus). L'obiettivo centrale dell'analisi del respiro esalato è di approfondire lo stato di una condizione medica e/o esposizioni ambientali non invadente. Ci sono vari metodi per la raccolta e l'analisi di respiro esalato, a seconda i costituenti di interesse. Attualmente non esiste un metodo di raccolta standardizzata di respiro esalato, che complica l'analisi comparativa dei risultati attraverso gli studi. Standardizzazione delle procedure di raccolta del respiro è essenziale, come la stessa procedura di campionamento ha un effetto notevole sui risultati a valle dell'analisi del respiro.

In molti studi, tardo respiratorio respiro campionamento è autonomo^2,3. Questo campionamento coinvolge scartando la parte iniziale di respiro esalato ("dead space"), al fine di catturare preferenzialmente l'aria alla fine del ciclo del respiro. Il vantaggio di questa strategia è che riduce al minimo i livelli di VOC esogeni (ad es., ambientale COV), arricchendo per COV endogeno, specifico per ogni paziente. Questo metodo esclude i primi secondi di espirazione da un individuo prima di prelevare il campione di respiro. Altri ricercatori hanno utilizzato un sensore di pressione per attivare campionamento durante una fase di predefiniti di scadenza^4,5. Poiché i sensori di pressione richiedono ingegneria complesso, questo metodo alternativo richiede un dispositivo di campionamento dedicato e relativamente costoso.

Campionamento alito pediatrica può essere particolarmente impegnativo. La preoccupazione principale è che i bambini piccoli sia in grado di cooperare con protocolli per volontario espirazione dell'aria "dead space". Per questo motivo, è più facile ottenere misto respiratorio respiro da bambini. Tuttavia, un avvertimento importante con campioni di aria espirata respiratoria mista è il rischio di contaminazione ambientale e dei materiale. Di conseguenza, la fattibilità della raccolta pediatrica è una preoccupazione di guida nel campo.

Inoltre, per i metodi di raccolta, stoccaggio di campioni di aria espirata può anche influenzare la qualità del campione. L'alta umidità in respiro exhalata e l'ultra-basse concentrazioni (parti per trilione) di respiro organici volatili composti fanno campioni di aria espirata particolarmente suscettibili a problemi legati al deposito^6,7. Nonostante le grandi potenzialità delle tecniche in tempo reale come spettrometria di reazione-massa trasferimento di protone (PTR-MS), GC-MS rimane il gold standard per l'analisi di campioni di aria espirata. Analisi GC-MS di campioni di aria espirata, essendo una tecnica non in linea, è accoppiato con i metodi di pre-concentrazione quali tubi di desorbimento termico (TD), micro-estrazione in fase solida e dispositivi trappola dell'ago. Prima del pre-concentrazione, è necessario essere memorizzati temporaneamente in polimero borse⁸campioni di aria espirata. Borse di polimero sono popolari a causa del loro prezzo moderato, relativamente buona durevolezza e riusabilità. Mentre borse possono essere riutilizzati, tempo e fatica sono tenuti ad assicurare l'efficiente pulizia^7,8. Ogni tipo di borsa specifica richiede anche empiricamente determinate e standardizzate le procedure per il controllo di qualità, riutilizzo e recupero.

TD tubi sono ampiamente utilizzati per pre-concentrazione respiro perché catturare un gran numero di sostanze volatili e possono essere personalizzati. I materiali assorbenti utilizzati per il confezionamento TD tubi possono essere adattati alle particolari applicazioni e sostanze volatili particolare target di interesse. TD tubi sostanzialmente migliorare la convenienza di studi di biomarcatore respiro, soprattutto in siti remoti, perché TD tubi tranquillamente conservare sostanze volatili respiro per almeno due settimane e sono facili da trasporto³.

Nel tentativo di standardizzare la raccolta di respiro pediatrica per la scoperta del biomarcatore, qui descriviamo un metodo semplice per raccogliere il respiro da bambini piccoli. Per illustrare i risultati rappresentativi dei protocolli implementati, i dati sono presentati da un gruppo in corso dei bambini (età 8-17) in fase di valutazione per la malattia dell'acido grasso non alcolica del fegato (NAFLD). Risultati completi e analisi di questo studio verranno segnalati in una pubblicazione successiva. In questo lavoro, segnaliamo un sotto insieme di dati per dimostrare l'applicazione del nostro protocollo. In breve, i bambini sono istruiti per espirare normalmente tramite boccaglio in un sacchetto di polimero, come se "soffiando un palloncino". Il processo viene ripetuto 2 - 4 volte fino a 1 L di respiro sono raccolti. Il campione è quindi trasferito in una provetta di TD e conservato a 5 ° C prima dell'analisi GC-MS.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dall'istituzionale Review Board di Washington University School of Medicine (#201709030). Consenso informato è stato ottenuto da un genitore o tutore legale prima dell'inclusione nello studio. Fotografie nella Figura 2 è riprodotto con consenso informato dei genitori.

1. Assemblea di campionatore respiro

1. Utilizzando guanti monouso, allegare un boccaglio cartone al campionatore respiro, come mostrato in supplementare nella figura 1. Allegare un breve tratto di tubi di grande diametro per l'altro estremo del campionatore respiro, come mostrato nella Figura 1 supplementare. Utilizzare nuove tubazioni per ogni paziente.
2. Collegare il connettore di respiro alla valvola della borsa attraverso i tubi. Vedere la Figura 1 per foto del campionatore di respiro e borsa collegato.
3. Girare la vite zigrinata sul lato il raccordo in senso antiorario per sbloccare la valvola di ingresso e spingere lo stelo della valvola borsa, aprire il raccordo per il campionamento di ingresso.
4. Bloccare la valvola aperta, ruotando la vite zigrinata sul lato il raccordo in senso orario di ingresso.
5. Confermare che la valvola blu sul campionatore di respiro è aperta (in parallelo con il connettore).
6. Scrivere ID paziente, data e ora sull'etichetta della borsa polimero.
7. Tubo assorbente di condizione TD prima del respiro insieme utilizzando procedure (disponibile da singoli produttori) raccomandate. Tappo e memorizzare tubi di desorbimento termico a 4 – 5 ° C prima della raccolta di respiro per ridurre al minimo gli artefatti.

2. collezione respiro

1. Eseguire una dimostrazione dell'espirazione del respiro al bambino utilizzando un campionatore di respiro (senza sacchetto). Spiegare al bambino che si deve espirare come avrebbero fare quando "scoppiare un aerostato" e continuare a respirare fuori in quanto possono comodamente. Mettere il cartone boccaglio tra le labbra ed espirare, per quanto è possibile.
2. Fornire al bambino un nuovo sampler di respiro collegato ad un sacchetto e chiedere loro di espirare come la dimostrazione, come illustrato nella Figura 2.
3. Chiudere la valvola blu del dispositivo del campionatore di respiro, non appena il bambino ha finito di respirare fuori. Riaprire la valvola come necessario prima altre esalazioni.
4. Ripetere il passaggio 2.2 e 2.3 per almeno 1 L di respiro sono stati raccolti. Per un bambino sano, questo potrebbe richiedere 2 esalazioni e per un esalazioni di malati o più giovane bambino 2 – 4. 1 L di respiro è il requisito minimo di analitico. Nota sull'etichetta della borsa quanti respiri sono stati raccolti dal paziente. Per una foto della busta contenente diversi volumi di respiro, vedere Supplemental figura 2 .
5. Prima di staccare il sacchetto dal campionatore di respiro, assicurarsi di allentare la vite a testa zigrinata sul lato del raccordo ruotandolo in senso antiorario di ingresso e spingere lo stelo della valvola fino a chiudere il raccordo di entrata. Per foto della valvola in posizione aperta e chiusa borsa, vedere Supplemental figura 3 .
6. Bloccare la valvola del sacchetto chiusa ruotando la vite zigrinata sul lato il raccordo in senso orario di ingresso.
7. Staccare il sacchetto dal campionatore di respiro.
8. Smaltire il boccaglio e mettere da parte il campionatore di respiro per la pulizia prima dell'uso con un paziente differente.

3. trasferimento respiro ai tubi di desorbimento termico

1. Rimuovere il tubo di TD dal frigorifero. Rimuovere i tappi di archiviazione a lungo termine del tubo assorbente, utilizzando lo strumento di tappatura/uncapping tubo fornito dal produttore.
2. Collegare l'estremità scanalata del tubo assorbente TD a sacchetto di campionamento utilizzando tubi. Si noti che tubo orientamento è importante, come TD tubi sono progettati per avere aria che fluisce in una sola direzione, a partire dall'estremità scanalata. Si noti che il trasferimento di respiro dalla borsa per TD dovrebbe essere fatto entro 1 ora dal prelievo di respiro.
3. Inserire l'altra estremità del tubo TD nel tubo, che è collegato ad una pompa.
4. Accendere la pompa e impostato per funzionare a 100 mL/min per 10 min.
5. Aprire la valvola sulla borsa, girando in senso antiorario la vite a testa zigrinata sul lato del raccordo di entrata e spingere lo stelo della valvola verso il basso per aprire il raccordo di entrata. Ciò è illustrato nel supplementare nella figura 4, che dimostra il trasferimento di respiro in un tubo assorbente TD utilizzando una pompa.
6. Avviare la pompa, che si fermerà dopo 10 min di raccolta.
7. Rimuovere il tubo assorbente TD e serrare i tappi su entrambe le estremità utilizzando lo strumento di tappatura/uncapping tubo. Tappi di archiviazione a lungo termine devono essere serrati al fine di garantire una tenuta ermetica.
8. Collocare un adesivo sull'estremità di un tappo per indicare che il tubo è stato utilizzato. Sull'adesivo, indicare data e numero di identificazione (ID) di studio paziente.
9. Posizionare il tubo in un sacchetto di plastica richiudibile. Tubo assorbente archivio a 4 – 5 ° C. Premere il resto del soffio fuori dalla borsa e scartare sacchetto. Registrare il paziente studio ID, TD tubo numero di serie, collezione giorno, tempo di raccolta di respiro, tempo di trasferimento di respiro e l'ingestione di cibo (tempo di assunzione di cibo prima della raccolta di respiro e i pasti consumati).

4. ambient air collezione

1. Raccogliere i campioni di aria ambiente nell'ambiente del paziente subito dopo il prelievo di respiro.
   1. Attaccare il sacchetto presa della pompa tramite tubi, come illustrato nella Figura 5 supplementare.
   2. Spingere lo stelo della valvola borsa verso il basso per aprire il raccordo di entrata per il campionamento.
   3. Bloccare la valvola aperta ruotando in senso orario la vite a testa zigrinata sul lato del raccordo di entrata.
2. Accendere la pompa e impostato per funzionare a 100 mL/min per 12 min. La pompa raccoglierà 1.200 mL di aria ambiente.
3. Dopo aver raccolto il volume richiesto, allentare la vite a testa zigrinata sul lato del raccordo ruotandolo in senso antiorario di ingresso e spingere lo stelo della valvola fino a chiudere il raccordo di entrata.
4. Bloccare la valvola del sacchetto chiusa ruotando in senso orario la vite a testa zigrinata sul lato del raccordo di entrata.
5. Staccare il sacchetto dalla pompa.
6. Seguire la stessa procedura come descritto in sezione 3. L'unica differenza è che l'aria ambiente che COV verranno trasferiti, non quelli dal respiro.

5. il campione e l'analisi dei dati

Nota: Condizioni per l'analisi di campioni di respiro e aria sono stati descritti in precedenza⁹.

1. Analizzare i dati raccolti e rilevare composti nei cromatogrammi. Utilizzare programmi software tipico per trovare e identificare tutti i composti rilevati dallo strumento (Figura 3A). Ad esempio, utilizzare una funzionalità di deconvoluzione per identificare composti. Filtrare i dati utilizzando il fattore di dimensione finestra di conservazione di 80, massa altezze filtri ≥ 100 conta, e la zona assoluta composto filtro ≥ 500 conta.
2. Utilizzare standard chimici ai composti di identità nei campioni di respiro e aria. Estrarre l'area dei picchi dello ione base di composti di interesse, come isoprene e β-pinene (Figura 4) e confrontare i livelli di sostanze volatili nell'aria e respiro.

Risultati

Nel nostro studio, respiro sono stati raccolti campioni da 10 bambini (8-17 anni) in fase di valutazione all'ospedale dei bambini di St. Louis. Campioni di aria espirata e campioni di aria ambiente (n = 10) sono stati raccolti come sopra descritto. I campioni sono stati analizzati mediante spettrometria di massa tempo di volo del quadrupole gas cromatografia (GC-QToF-MS) e desorbimento termico, come descritto in precedenza⁹. Dopo la rimozione di contaminan...

Discussione

Nonostante i notevoli progressi nella ricerca di respiro nell'ultimo decennio, le pratiche standardizzate per il campionamento e l'analisi di composti volatili respiro gas rimangono indefiniti¹⁰. Un motivo principale per questa mancanza di standardizzazione è stato la diversità dei metodi di raccolta di respiro, che hanno un impatto diretto sulla diversità chimica risultante presenti in qualsiasi campione dato respiro esalato. Respiro exhalata contiene una vasta gamma di composti organici volat...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")