Coleção de respiração das crianças para a descoberta de biomarcador de doença

Resumo

Este protocolo descreve um método simples para a aquisição das amostras de respiração dos filhos. Brevemente, amostras de ar misto pré-concentram-se em tubos de adsorvente antes da análise por cromatografia gasosa / espectrometria de massa. Biomarcadores de respiração de doenças infecciosas e não-infecciosa podem ser identificados usando este método de coleta de respiração.

Resumo

Análise e coleta de respiração podem ser usados para descobrir biomarcadores voláteis em um número de doenças infecciosas e não infecciosas, como malária, tuberculose, câncer de pulmão e doença hepática. Este protocolo descreve um método reprodutível para amostragem de respiração em crianças e depois estabilizar amostras de respiração para uma análise mais aprofundada com cromatografia gasosa / espectrometria de massa (GC-MS). O objetivo desse método é estabelecer um protocolo padronizado para a aquisição de amostras de hálito para posterior análise química, de crianças com idades entre 4 a 15 anos. Primeiro, respiração é amostrada utilizando um papelão bocal conectado a uma válvula de 2 vias, que é conectada a uma bolsa de 3 L. Respiração analitos são então transferidos para um tubo de desorção térmica e armazenados a 4-5 ° C até análise. Esta técnica tem sido usada anteriormente para capturar o fôlego das crianças com malária para identificação de biomarcador de respiração bem sucedida. Posteriormente, nós tem aplicado com sucesso esta técnica de coortes pediátricas adicionais. A vantagem deste método é que ele exige cooperação mínima por parte do paciente (de determinado valor em populações pediátricas), tem um período curto da coleção, não requer pessoal treinado e pode ser realizado com equipamento portátil em configurações de campo de recursos limitados.

Introdução

Biomarcadores podem render informações valiosas sobre os processos biológicos normais e patológicos que podem contribuir para a doença clinicamente identificável. Recentemente, tem havido um interesse crescente na avaliação de compostos voláteis de respiração como biomarcadores para uma variedade de doenças, incluindo câncer ¹, distúrbios metabólicos e infecção. Ar exalado contém níveis quantificáveis de compostos orgânicos voláteis (COV), compostos orgânicos semivoláteis e amostras com derivada material (por exemplo, os ácidos nucleicos de bactérias e vírus). O objetivo central de análise do ar exalado é obter conhecimento sobre o status de uma condição médica e/ou exposições ambientais não invasiva. Existem vários métodos de coleta e análise de ar exalado, dependendo dos componentes de interesse. Atualmente não há nenhum método de coleta de ar exalado padronizada, que dificulta a análise comparativa dos resultados através de estudos. Padronização de procedimentos de coleta de respiração é essencial, como o próprio procedimento de amostragem tem um efeito considerável sobre os resultados a jusante das análises de respiração.

Em muitos estudos, tarde amostragem respiratória respiração é empregada^2,3. Esta amostragem envolve rejeitando a porção inicial do ar exalado ("dead space"), a fim de capturar preferencialmente o ar no final do ciclo de respiração. A vantagem desta estratégia é que minimiza os níveis de COV exógeno (por exemplo, VOCs ambientais), enquanto enriquece para VOCs endógenas, específicos do paciente. Este método exclui os primeiros segundos da expiração de um indivíduo antes de coletar a amostra de respiração. Outros pesquisadores têm utilizado um sensor de pressão para ativar a amostragem durante uma fase predefinida de expiração^4,5. Sensores de pressão requer engenharia complexa, este método alternativo requer um dispositivo de amostragem relativamente caro e dedicado.

Amostragem de respiração pediátrica pode ser especialmente desafiador. Uma preocupação-chave é que as crianças podem ser incapazes de cooperar com protocolos para voluntária exalação de ar de "dead space". Por esta razão, é mais fácil obter a respiração respiratória mista de crianças. No entanto, uma ressalva importante com amostras de respiração respiratória mista é o risco de contaminação ambiental e material. Portanto, a viabilidade de coleta pediátrica é uma preocupação de condução no campo.

Além disso, métodos de coleta, armazenamento de amostras de hálito também pode influenciar a qualidade da amostra. A alta umidade no ar exhalate e as ultra baixas concentrações (partes por trilhão) de respiração orgânicos voláteis compostos fazer respiração amostras particularmente suscetível a problemas relacionados a armazenamento^6,7. Apesar do grande potencial das técnicas em tempo real como espectrometria de massa-reação de transferência de próton (PTR-MS), GC-MS continua a ser o padrão-ouro para a análise de amostras de respiração. Desde que a análise por CG-em de amostras de respiração é uma técnica de off-line, está acoplada com métodos de pré-concentração tais como tubos de desorção térmica (TD), microextração de fase sólida e dispositivos de armadilha de agulha. Antes da pré-concentração, amostras de hálito precisam ser armazenados temporariamente em polímero sacos⁸. Sacos de polímero são populares por causa de seu preço moderado, relativamente boa durabilidade e capacidade de reutilização. Enquanto sacos podem ser reutilizados, tempo e esforço são necessários para garantir a eficiente limpeza^7,8. Cada tipo de saco específico também requer procedimentos empiricamente determinados e padronizados para controle de qualidade, reutilização e recuperação.

Tubos de TD são amplamente utilizados para pré-concentração de respiração porque eles capturar um grande número de compostos voláteis e podem ser personalizados. Os materiais absorventes usados para embalar os tubos TD podem ser adaptados para aplicações particulares e voláteis de destino específico de interesse. Tubos de TD substancialmente melhorar a conveniência de estudos de biomarcador de respiração, especialmente em locais de campo remoto, porque TD tubos com segurança loja voláteis de respiração pelo menos duas semanas e são fáceis de transporte³.

Em um esforço para padronizar a coleção de respiração pediátrica para descoberta de biomarker, aqui nós descrevemos um método simples para coletar o hálito de crianças pequenas. Para ilustrar os resultados representativos dos protocolos implementados, dados de identificados são apresentados de uma coorte em curso das crianças (8-17 anos) submetidos à avaliação para doença hepática não-alcoólica de ácido graxo (NAFLD). Os resultados completos e a análise deste estudo serão relatados em uma publicação posterior. Neste trabalho, relatamos um subconjunto de dados que demonstrem a aplicação do nosso protocolo. Em breve, as crianças são instruídas a Expire normalmente através do bocal em um saco de polímero, como se "soprando um balão." O processo é repetido 2 - 4 vezes até 1 L de ar é coletada. A amostra é então transferida para um tubo de TD e armazenada a 5 ° C, antes da análise por GC-MS.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo institucional Review Board da Washington University School of Medicine (#201709030). Foi obtido o consentimento dos pais ou tutores legais antes da inclusão no estudo. Fotografias em Figura 2 reproduzida com o consentimento informado dos pais.

1. montagem de sampler respiração

1. Usar luvas descartáveis, anexe um bocal de papelão para o sampler de respiração, como mostrado na Figura 1de suplementar. Anexe um comprimento curto de tubos de grande diâmetro para o outro extremo do amostrador a respiração, como mostrado na Figura suplementar 1. Use a tubulação nova para cada paciente.
2. Ligue o conector de respiração para a válvula do saco através da tubulação. Veja a Figura 1 para foto do amostrador de respiração e saco ligado.
3. Gire o parafuso recartilhado do lado de ajuste no sentido anti-horário para destravar a válvula de entrada de e empurre a haste da válvula do saco, para abrir a entrada da montagem para amostragem.
4. Fechar a válvula aberta, girando o parafuso recartilhado do lado da entrada de ajuste no sentido horário.
5. Confirme que a válvula azul no sampler respiração está aberta (em paralelo com o conector).
6. Escreva o paciente ID, data e hora no rótulo do saco do polímero.
7. Tubo adsorvente de condição TD antes da respiração coleção usando recomendado procedimentos (disponíveis a partir de fabricantes individuais). Cap e armazenar tubos de desorção térmica 4 – 5 ° c antes da coleção de respiração para minimizar artefatos.

2. coleção de respiração

1. Realizar uma demonstração de exalação da respiração para a criança usando um amostrador de respiração (sem um saco). Explica à criança que eles devem expirar como eles seriam quando "soprando um balão" e continuar respirando para fora tanto quanto eles podem confortavelmente. Coloque o bocal de papelão entre seus lábios e expire o mais longe puder.
2. Fornecer a criança com um novo amostrador de respiração anexado a um saco e pedir-lhes para exalar como a demonstração, conforme ilustrado na Figura 2.
3. Feche a válvula azul no dispositivo de amostrador de ar assim que a criança tenha terminado expirando. Reabra a válvula conforme necessário antes de exalações adicionais.
4. Repita a etapa 2.2 e 2.3, até pelo menos 1 L de ar tenha sido coletado. Para uma criança saudável pode levar 2 exalações e para um exalações de criança doente ou mais jovem 2 – 4. 1 L de ar é o requisito mínimo de analítico. Observe no rótulo do saco quantas respirações foram coletadas do paciente. Consulte Supplemental Figura 2 para uma foto do saco contendo diferentes volumes de ar.
5. Antes de retirar o saco do amostrador de ar, certifique-se de soltar o parafuso recartilhado no lado de entrada do encaixe girando-a no sentido anti-horário e empurre a haste da válvula até fechar o encaixe da entrada. Ver suplementar Figura 3 para a foto do saco a válvula na posição aberta e fechada.
6. Feche a válvula do saco fechada girando o parafuso recartilhado do lado da entrada de ajuste no sentido horário.
7. Retire o saco do amostrador a respiração.
8. Alienar o bocal e pôr de lado o amostrador de ar para limpeza antes da sua utilização com um paciente diferente.

3. transferência hálito para tubos de desorção térmica

1. Retire o tubo de TD da geladeira. Remova as tampas de armazenamento a longo prazo do tubo adsorvente, usando a ferramenta de nivelamento/desoperculação tubo fornecido pelo fabricante.
2. Fixe a extremidade ranhurada do tubo adsorvente TD saco de recolha utilizando tubos. Note que a orientação do tubo é importante, como TD tubos são projetados para ter o ar flui em uma direção apenas, a partir do final de ranhurados. Observe que a transferência de ar do saco de TD deve ser feita dentro de 1 hora de coleção de respiração.
3. Introduza a outra extremidade do tubo TD a tubulação, que é ligada a uma bomba.
4. Ligue a bomba e definido para ser executado em 100 mL/min por 10 min.
5. Abra a válvula do saco rodando no sentido anti-horário o parafuso recartilhado no lado do encaixe da entrada e empurre a haste da válvula para baixo para abrir o encaixe da entrada. Isso é ilustrado no Supplemental Figura 4, que demonstra a transferência de ar num tubo adsorvente TD usando uma bomba.
6. Ligue a bomba, que vai parar após 10min de coleção.
7. Remover o tubo adsorvente TD e aperte as tampas em ambas as extremidades, usando a ferramenta de nivelamento/desoperculação tubo. Tampões de armazenamento a longo prazo devem ser firmemente apertados para garantir uma vedação estanque.
8. Coloca um adesivo na extremidade de um tampão para indicar que o tubo foi usado. No adesivo, indica a data e número de identificação (ID) do paciente do estudo.
9. Colocar o tubo em um pequeno saco de plástico re-selável. Tubo adsorvente de loja 4 e 5 ° c. Pressione o resto da respiração fora do saco e descartar o saco. Gravar o paciente estudo ID, TD tube número de série, dia de coleta, da coleção de respiração, tempo de transferência de respiração e ingestão de alimentos (tempo de ingestão de alimentos antes da coleção de respiração e as refeições consumidas).

4. coleção de ar ambiente

1. Colete as amostras de ar ambiente no ambiente do paciente imediatamente após a colheita de respiração.
   1. Prenda o saco à porta de saída da bomba por meio de tubulação, conforme ilustrado na Figura suplementar 5.
   2. Empurre a haste da válvula do saco até abrir o encaixe da entrada para a amostragem.
   3. Trave a válvula aberta, girando no sentido horário o parafuso recartilhado no lado do encaixe da entrada.
2. Ligue a bomba e definido para ser executado em 100 mL/min por 12 min. A bomba irá recolher 1.200 mL de ar ambiente.
3. Depois que o volume solicitado foram coletado, afrouxe o parafuso recartilhado no lado de entrada do encaixe girando-a no sentido anti-horário e empurre a haste da válvula até fechar o encaixe da entrada.
4. Feche a válvula do saco fechada girando no sentido horário o parafuso recartilhado no lado do encaixe da entrada.
5. Retire o saco da bomba.
6. Siga os mesmos passos como na seção 3. A única diferença é que ar ambiente que COV vai ser transferido, não aqueles de respiração.

5. a amostra e análise de dados

Nota: As condições para análise de amostras de ar e respiração foram descritos anteriormente⁹.

1. Analisar dados coletados e detectar compostos nos cromatogramas. Use programas de software típico para encontrar e identificar todos os compostos detectados pelo instrumento (Figura 3A). Por exemplo, use um recurso de deconvolução para identificar compostos. Filtrar dados usando fator de tamanho de janela de retenção de 80, alturas em massa filtros ≥100 conta, e composto de área absoluta filtro ≥500 conta.
2. Use padrões químicos para compostos de identidade em amostras de ar e respiração. Extrair a área do pico íon base de compostos de interesse, tais como isopreno e β-pineno (Figura 4) e comparar os níveis de compostos voláteis em respiração e ar.

Resultados

Em nosso estudo, respiração, as amostras foram coletadas de 10 crianças (8-17 anos) passando por avaliação no Hospital de crianças St. Louis. Amostras de hálito e amostras de ar ambiente (n = 10) foram coletadas conforme descrito acima. As amostras foram analisadas utilizando cromatografia gasosa quadrupolo tempo-de-voo espectrometria de massa (GC-MS QToF) e dessorção térmica, como descrito anteriormente⁹. Após a remoção de contaminantes de fu...

Discussão

Apesar dos progressos consideráveis em pesquisa de fôlego na última década, práticas padronizadas para a amostragem e análise de compostos voláteis de gás de respiração permanecem indefinidos¹⁰. A principal razão para essa falta de padronização tem sido a diversidade de métodos de recolha de respiração, que têm impacto direto sobre a diversidade química resultante presente em qualquer amostra de determinado ar exalado. Respiração exhalate contém uma extensa gama de compostos o...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")