Atem-Sammlung von Kindern für Krankheit Entdeckung von Biomarkern

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode für den Erwerb von Atemproben von Kindern. Kurz, sind Proben von Mischluft vorab in Sorptionsmittel Röhren vor der Gaschromatographie-Massenspektrometrie Analyse konzentriert. Atem-Biomarker von infektiösen und nicht infektiösen Krankheiten können mit dieser Atem Sammlung Methode identifiziert werden.

Zusammenfassung

Atem-Sammlung und Analyse können verwendet werden, um flüchtige Biomarker in einer Reihe von infektiösen und nicht infektiösen Krankheiten, wie Malaria, Tuberkulose, Lungenkrebs und Lebererkrankungen. zu entdecken Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare Methode zur Probenahme Atem bei Kindern und dann Stabilisierung Atemproben zur weiteren Analyse mit Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS). Das Ziel dieser Methode ist es, ein standardisiertes Protokoll für den Erwerb von Atemproben zur weiteren chemischen Analyse von Kindern im Alter von 4-15 Jahre zu etablieren. Erstens ist Atem Stichprobe mit einem Karton Mundstück befestigt, ein 2-Wege-Ventil, das mit einem 3 L Beutel verbunden ist. Atem Analyten sind dann eine thermische Desorption Rohr übertragen und dort gespeichert bei 4-5 ° C bis zur Analyse. Diese Technik wurde früher Atem von Kindern mit Malaria für erfolgreiche Atem Biomarker Identifikation zu erfassen. Anschließend haben wir diese Technik erfolgreich auf zusätzlichen pädiatrischen Kohorten angewendet. Der Vorteil dieser Methode ist, dass es minimale Zusammenarbeit seitens des Patienten (von besonderem Wert in pädiatrischen Populationen erfordert), eine kurze Auflistung Periode hat geschultes Personal erfordert und mit tragbaren Geräten in durchgeführt werden kann begrenzten Ressourcen Feldeinstellungen.

Einleitung

Biomarker können wertvolle Informationen über normale und pathologische biologische Prozesse führen, die klinisch erkennbare Krankheit beitragen kann. Vor kurzem gab es zunehmende Interesse an der Bewertung von Atem Volatiles als Biomarker für eine Vielzahl von Krankheitszuständen, einschließlich Infektionen, Stoffwechselstörungen und Krebs ¹. Ausatmungsluft enthält quantifizierbare Mengen an flüchtigen organischen Verbindungen (VOC), semi-flüchtige organische Verbindungen und mikrobiell abgeleitete Material (z. B. Nukleinsäuren vor Bakterien und Viren). Das zentrale Ziel der Ausatmungsluft Analyse ist nicht-invasiv Einblick in den Status einer Erkrankung und/oder Umwelteinflüsse. Es gibt verschiedene Methoden zum sammeln und analysieren der Ausatmungsluft, abhängig von den Bestandteilen von Interesse. Derzeit gibt es keine standardisierte Ausatmungsluft Erhebungsmethode, die vergleichende Analyse der Ergebnisse in den Studien erschwert. Standardisierung der Atem Sammlung Verfahren ist wichtig, da das Stichprobenverfahren selbst einen erheblichen Einfluss auf die nachgelagerten Ergebnisse der Atem hat.

In vielen Studien ist spät Atemwege Atem Probenahme eingesetzten^2,3. Diese Auswahl beinhaltet verwerfen des ersten Teils der Ausatmungsluft ("dead Space"), um bevorzugt die Luft am Ende des Kreislaufs Atem erfassen. Der Vorteil dieser Strategie ist, dass es das Niveau der exogenen VOC (z. B. ökologische VOC), minimiert während bereichernd für endogene, patientenspezifische VOC. Diese Methode verhindert Individuum vor dem Sammeln der Atemprobe, die ersten paar Sekunden ausatmen. Andere Forscher haben einen Drucksensor Probenahme in einer vordefinierten Phase Ablauf^4,5aktivieren eingesetzt. Da Drucksensoren komplexe Technik erfordern, erfordert diese alternative Methode ein engagiertes und relativ kostspielig Probenahmegerät.

Pädiatrische Atem Probenahme kann besonders schwierig sein. Ein wichtiges Anliegen ist, dass junge Kinder möglicherweise nicht auf die Zusammenarbeit mit Protokolle für freiwillige Ausatmen von Luft "dead Space". Aus diesem Grund ist es einfacher, gemischte Atemwege Atem von Kindern zu erhalten. Eine wichtige Einschränkung mit gemischten Atemwege Atemproben ist jedoch das Risiko einer Kontamination der Umwelt und Material. Deshalb ist die Machbarkeit der pädiatrischen Sammlung eine treibende Anliegen im Bereich.

Darüber hinaus, um Methoden der Datenerhebung kann Atem Probenaufbewahrung auch Sample-Qualität beeinflussen. Die hohe Luftfeuchtigkeit im Atem exhalate und der ultra-niedrigen Konzentrationen (Teile pro Billion) von flüchtigen organischen Verbindungen machen Atem Atemproben besonders anfällig für Probleme im Zusammenhang mit Speicher^6,7. Trotz des großen Potenzials des Echtzeit-Techniken wie Proton Transfer Reaktion-Massenspektrometrie (PTR-MS) bleibt GC-MS der Goldstandard für die Analyse der Atemproben. Da GC-MS-Analyse der Atemproben eine offline-Technik ist, ist es mit Vorkonzentrierung Methoden wie thermische Desorption (TD) Rohre, Mikro-Festphasenextraktion und Nadel Falle Geräte gekoppelt. Bevor Sie Vorkonzentrierung müssen Atemproben in Polymer Taschen⁸zwischengelagert werden. Polymer-Taschen sind beliebt wegen ihrer moderaten Preis, relativ gute Haltbarkeit und Wiederverwendbarkeit. Während Taschen wiederverwendet werden können, sind Zeit und Aufwand erforderlich, um effiziente Reinigung^7,8sicherzustellen. Jede spezifische Tasche verlangt auch empirisch bestimmte und standardisierte Verfahren zur Qualitätskontrolle, Wiederverwendbarkeit und Erholung.

TD-Rohre sind für Atem Vorkonzentrierung verbreitet, da sie eine große Anzahl von Volatiles erfassen und besonders angefertigt werden können. Die saugfähigen Materialien verwendet für das Verpacken von TD-Rohre können bestimmte Anwendungen und bestimmtes Ziel flüchtigen Bestandteile von Interesse angepasst. TD Rohre wesentlich verbessern den Komfort der Atem Biomarker Studien, vor allem in abgelegenen Wiese, weil TD Rohre sicher speichern Atem Volatiles für mindestens zwei Wochen und sind leicht zu Transport³.

In dem Bemühen, pädiatrische Atem Sammlung für Entdeckung von Biomarkern zu standardisieren beschreiben wir hier eine einfache Methode um Atem von Kindern zu sammeln. Um die repräsentativen Ergebnisse der implementierten Protokolle zu veranschaulichen, werden anonymisierte Daten präsentiert eine andauernde Kohorte der Kinder (8-17 Jahre) in der Bewertung für alkoholfreie Fettsäuren Leber Krankheit (NAFLD). Die vollständigen Ergebnisse und Analyse dieser Studie werden in einer späteren Publikation gemeldet. Dabei berichten wir über eine Teilmenge von Daten zur Anwendung von unserem Protokoll zu demonstrieren. In Kürze werden Kinder angewiesen, normalerweise über Mundstück Ausatmen in eine Polymer-Tasche, als ob "einen Ballon weht." Der Prozess wird 2-4 Mal wiederholt, bis 1 L des Atems abgeholt wird. Die Probe wird dann in ein TD-Rohr übertragen und gespeichert bei 5 ° C vor der GC-MS-Analyse.

Protokoll

Die Studie wurde von der institutionellen Review Board der Washington University School of Medicine (#201709030) genehmigt. Die Einwilligung wurde von einem Elternteil oder Erziehungsberechtigten vor Aufnahme in die Studie. Fotos in Abbildung 2 wiedergegeben mit schriftlicher Einwilligung der Eltern informiert.

1. Atem Sampler Montage

1. Verwendung von Einweg-Handschuhe, Messen Sie Karton Sprachrohr der Atem-Sampler bei, wie in zusätzliche Abbildung 1dargestellt. Legen Sie eine kurze Länge von großem Durchmesser Schlauch in das andere extrem von der Atem-Sampler, wie in zusätzliche Abbildung1dargestellt. Verwenden Sie neue Schläuche für jeden Patienten.
2. Das Beutel-Ventil über den Schlauch den Atem-Anschluss zuordnen. Siehe Abbildung 1 für Foto des Atem-Sampler und Tasche verbunden.
3. Drehen Sie die gerändelte Rändelschraube an der Seite der Einlass gegen den Uhrzeigersinn um das Ventil zu entsperren passend und drücken den Stamm des Ventils Tasche, passend für die Probenahme Zulauf öffnen.
4. Geöffnetem Ventil durch Drehen der Rändelschraube Rändelschraube an der Seite des Einlass im Uhrzeigersinn passend zu sperren.
5. Bestätigen Sie, dass das blaue Ventil auf dem Atem Sampler geöffnet ist (parallel mit dem Stecker).
6. Patienten-ID, Datum und Uhrzeit auf dem Etikett der Polymer-Tasche zu schreiben.
7. Zustand TD Sorbens Rohr vor Atem Sammlung mit empfohlenen Verfahren (von einzelnen Herstellern angeboten). Kappe und speichern thermische Desorption Rohre bei 4 – 5 ° C vor der Entnahme der Atem, Artefakte zu minimieren.

(2) Atem Sammlung

1. Führen Sie eine Demonstration der Atem ausatmen, das Kind mit einem Atem-Sampler (ohne Tasche). Erklären Sie dem Kind, dass sie ausatmen sollten, wie würden sie tun, wenn ein Ballon "Sprengung" und weiter Ausatmen so weit wie sie bequem können. Setzen Sie das Kartonage Mundstück zwischen die Lippen und atmen Sie so weit wie Sie können.
2. Geben Sie das Kind mit einem neuen Atem-Sampler an einer Tasche befestigt und bitten Sie ihn, wie in der Demo, Ausatmen, wie in Abbildung 2dargestellt.
3. Schließen Sie das blaue Ventil auf dem Atem-Sampler-Gerät, sobald das Kind fertig ist Ausatmen. Öffnen Sie das Ventil vor zusätzliche Ausdünstungen Bedarf.
4. Wiederholen Sie Schritt 2.2 und 2.3 bis mindestens 1 L des Atems gesammelt wurden. Für ein gesundes Kind dauert dies 2 Ausdünstungen und für ein krankes oder jüngere Kind 2 – 4 Ausdünstungen. 1 L des Atems ist die analytische Mindestanforderung. Hinweis: auf das Taschenlabel wie viele Atemzüge des Patienten gesammelt wurden. Siehe zusätzliche Abbildung2 für ein Foto Tasche mit verschiedenen Bänden des Atems.
5. Vor dem Abnehmen der Tasche aus dem Atem-Sampler, achten Sie darauf, die gerändelte Rändelschraube an der Seite der Einlass Montage durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn lösen und drücken Sie den Stamm des Ventils bis Abschluss der Einlass-Armatur. Foto von der Tasche Ventil in geöffneter und geschlossener Position finden Sie unter zusätzliche Abbildung 3 .
6. Sperren Sie die Tasche Ventil durch Drehen der Rändelschraube Rändelschraube an der Seite des Einlass passend im Uhrzeigersinn geschlossen.
7. Lösen Sie die Tasche aus dem Atem-Sampler.
8. Entsorgen Sie das Mundstück und den Atem-Sampler für die Reinigung vor der Verwendung mit einem anderen Patienten beiseite.

(3) Atem Übertragung auf thermische Desorption Rohre

1. Nehmen Sie das TD-Rohr aus dem Kühlschrank. Entfernen Sie die langfristige Lagerung Kappen des Sorbens Rohres, unter Verwendung der vom Hersteller bereitgestellten capping/Entdeckeln Füllwerkzeug.
2. Schlauch mit Auffangbeutel zuordnen Sie gerillte Ende des TD Sorbens Rohres. Beachten Sie, dass Rohr Ausrichtung ist wichtig, als TD Röhren sind entworfen, um Luft fließt nur in eine Richtung, die gerillte Ende ab. Beachten Sie, dass die Übertragung des Atems aus Bag TD innerhalb einer Stunde der Atem Sammlung erfolgen sollte.
3. Stecken Sie das andere Ende des Schlauches TD in den Schlauch, der mit einer Pumpe verbunden ist.
4. Einschalten der Pumpe und mit 100 mL/min für 10 min laufen.
5. Öffnen Sie das Ventil auf der Tasche durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn die gerändelte Rändelschraube an der Seite der Zulauf Armatur und drücken Sie den Stamm des Ventils nach unten offenen Einlass-Montage. Dies zeigt zusätzliche Abbildung 4, die Atem-Transfer zu einem TD Sorbens Schlauch mittels einer Pumpe zeigt.
6. Starten Sie die Pumpe, die nach 10 min Sammlung anhält.
7. Das TD-sorbent-Rohr zu entfernen und die Kappen auf beiden Enden mit dem Rohr capping/Entdeckeln Werkzeug anziehen. Langfristige Lagerung Kappen müssen fest angezogen werden, um eine Dichte Abdichtung zu gewährleisten.
8. Legen Sie einen Aufkleber auf das Ende einer Kappe um anzuzeigen, dass das Rohr verwendet worden ist. Geben Sie auf dem Aufkleber Patienten Studie Identifikationsnummer (ID) und das Datum an.
9. Legen Sie Rohr in einem kleinen wiederverschließbaren Plastikbeutel. Speichern Sie Sorbens Rohr bei 4 – 5 ° C. Drücken Sie den Auslöser des Atems aus dem Beutel und entsorgen Sie Beutel. Nehmen Patienten Studie ID, TD tube Seriennummer, Sammlung Tag, Zeit der Atem Sammlung, Atem-Transfer und Nahrungsaufnahme (Zeitpunkt der Nahrungsaufnahme vor dem Atem Sammlung und Mahlzeiten verzehrt).

(4) Luft-Sammlung

1. Sammeln Sie die Umgebungsluft Proben im Umfeld des Patienten sofort nach der Entnahme der Atem.
   1. Legen Sie die Tasche auf Auslass der Pumpe mit Schlauch, wie in zusätzliche Abbildung 5dargestellt.
   2. Klappen Sie den Stamm des Ventils Tasche nach unten offenen Einlass-Montage für die Probenahme.
   3. Geöffnetem Ventil durch Drehen im Uhrzeigersinn den gerändelten Rändelschraube an der Seite der Zulauf Armatur zu sperren.
2. Einschalten der Pumpe und mit 100 mL/min für 12 min zu laufen. Die Pumpe wird 1.200 mL der Umgebungsluft sammeln.
3. Nachdem das gewünschte Volumen gesammelt hat, lösen Sie die gerändelte Rändelschraube an der Seite der Montage durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn Einlass und drücken Sie den Stamm des Ventils bis Abschluss der Zulauf Armatur.
4. Sperren Sie die Tasche Ventil durch Drehen im Uhrzeigersinn den gerändelten Rändelschraube an der Seite der Zulauf Armatur geschlossen.
5. Trennen Sie die Tasche von der Pumpe.
6. Die gleichen Schritte wie in Abschnitt 3. Der einzige Unterschied ist, dass Umgebungsluft, die flüchtigen organischen Verbindungen übertragen werden, nicht die von Atem.

5. Probe und Datenanalyse

Hinweis: Bedingungen für die Analyse von Atem und Luft Proben wurden⁹beschrieben.

1. Gesammelte Daten zu analysieren und Verbindungen in die Chromatogramme erkennen. Verwenden Sie typische Software-Programme zu finden und alle Verbindungen, die durch das Instrument (Abbildung 3A) erkannt. Z. B. eine Funktion Dekonvolution, um Verbindungen zu identifizieren. Filtern von Daten mit Aufbewahrung Fenster Größenfaktor von 80, Masse Höhen Filter ≥100 zählt, und zusammengesetzte absolute Bereich Filter ≥500 zählt.
2. Verwenden Sie chemische Standards zur Identität Verbindungen in Atem und Luft Beispielen. Extrahieren Sie die base Ionen Peakfläche der Verbindungen des Interesses, wie Isopren und β-Pinen (Abbildung 4), und vergleichen Sie die Ebenen der flüchtigen Bestandteile in Atem und Luft.

Ergebnisse

In unserer Studie Atem gesammelten Proben von 10 Kindern (8-17 Jahre alt) waren derzeit Evaluierung im Kinderkrankenhaus St. Louis. Atem und Umgebungsluft Proben (n = 10) wurden gesammelt, wie oben beschrieben. Proben wurden mit Gaschromatographie Quadrupol Flugzeit-Massenspektrometrie (GC-QToF-MS) und thermische Desorption als zuvor beschriebenen⁹analysiert. Nach Entfernung der Hintergrund Verunreinigungen ergab die implementierten Protokolle durchschnitt...

Diskussion

Trotz erheblicher Fortschritte in der Atem-Forschung in den letzten zehn Jahren bleiben standardisierte Verfahren für die Probenahme und Analyse von flüchtigen Stoffen Atem Gas undefiniert¹⁰. Einer der Hauptgründe für diesen Mangel an Standardisierung wurde die Vielfalt der Atem Methoden der Datenerhebung, die direkten Einfluss auf die resultierende chemische Vielfalt in jeder gegebenen Ausatmungsluft Probe haben. Atem exhalate enthält ein umfangreiches Angebot an flüchtigen organischen Verb...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")