儿童疾病生物标志物发现的呼吸收集

摘要

该协议描述了一种从儿童身上采集呼吸样本的简单方法。简单地说, 混合空气样品在气相色谱-质谱分析之前, 先在吸附剂管中进行预浓缩。使用这种呼吸收集方法可以确定传染病和非传染性疾病的呼吸生物标志物。

摘要

呼吸收集和分析可用于发现疟疾、结核病、肺癌和肝病等一些传染病和非传染性疾病中的挥发性生物标志物.该协议描述了一种可重复的方法, 用于在儿童中采样呼吸, 然后稳定呼吸样本, 以便使用气相色谱-质谱联用 (gc-ms) 进行进一步分析。这种方法的目的是建立一个标准化的协议, 从4-15 的儿童身上采集呼吸样本, 以便进一步进行化学分析。首先, 使用连接到双向阀门上的纸板喉舌对呼吸进行采样, 该口子连接到3l 袋上。呼吸分析物然后被转移到热解吸管中, 并存储在 4-5, 直到分析。这种技术以前已被用来捕捉疟疾儿童的呼吸, 以成功地识别呼吸生物标志物。随后, 我们成功地将这一技术应用于其他儿科队列。这种方法的优点是, 它需要患者的最低限度的合作 (在儿科人口中具有特殊价值), 收集时间很短, 不需要训练有素的工作人员, 可以使用便携式设备在资源有限的字段设置。

引言

生物标志物可以产生关于正常和病理生物过程的有价值的信息, 这些过程可能导致临床可识别的疾病。最近, 人们越来越关注将呼吸挥发物作为各种疾病状态的生物标志物进行评估, 包括感染、代谢紊乱和癌症¹。呼气含有可量化的挥发性有机化合物 (vocs)、半挥发性有机化合物和微生物衍生材料 (例如细菌和病毒的核酸)。呼气分析的中心目标是深入了解非侵入性医疗状况和/或环境暴露的状况。根据感兴趣的成分, 有多种方法可以收集和分析呼气。目前还没有标准化的呼气采集方法, 这使得对各种研究结果的比较分析复杂化。标准化的呼吸收集程序至关重要, 因为取样程序本身对呼吸分析的下游结果有相当大的影响。

在许多研究中, 呼吸后期采样采用了^2,3.这种采样包括丢弃呼气的初始部分 ("死空间"), 以便在呼吸周期结束时优先捕捉空气。这种策略的优点是, 它最大限度地减少了外源 voc (如环境挥发性有机化合物) 的水平, 同时丰富了内生的、针对患者的挥发性有机化合物。此方法排除在收集呼吸样本之前从单个中呼出的前几秒钟。其他研究人员使用压力传感器在预定义的到期阶段^激活采样4^,5。由于压力传感器需要复杂的工程, 这种替代方法需要专用且成本相对较高的采样装置。

儿童呼吸采样可能特别具有挑战性。一个主要关切是, 幼儿可能无法配合自愿呼出 "死空间" 空气的议定书。因此, 从儿童身上获得混合呼吸更容易。然而, 混合呼吸样本的一个主要警告是环境和材料污染的风险。因此, 儿科收藏的可行性是该领域的一个驱动问题。

此外, 对于采集方法, 呼吸样品的储存也会影响样品的质量。呼吸中的高湿度和挥发性有机呼吸化合物的超低浓度 (每万亿分之) 使得呼吸样本特别容易受到与储存^6,7有关的问题的影响。尽管质子转移反应质谱 (ptr-ms) 等实时技术潜力巨大, 但 gc-ms 仍然是分析呼吸样本的黄金标准。由于气检的 gc-ms 分析是一种离线技术, 它与预浓缩方法 (如热解吸管、固相微萃取和针陷阱装置) 相结合。在预浓缩之前, 呼吸样品需要暂时储存在聚合物袋^中8。聚合物袋之所以受欢迎, 是因为它们价格适中, 耐久性相对较好, 可重用性强。虽然袋子可以重复使用, 但需要时间和精力来确保高效清洁^7,8。每种特定的包类型还需要经过经验确定和标准化的程序来进行质量控制、可重用性和恢复。

td 管被广泛用于呼吸预浓缩, 因为它们捕获大量挥发物, 并且可以定制。用于包装 td 管的吸收材料可适用于特定的应用和感兴趣的特定目标挥发物。td 管极大地提高了呼吸生物标志物研究的便利性, 特别是在偏远的现场, 因为 td 管安全地储存呼吸挥发物至少两周, 并且易于运输³。

为了规范儿童的呼吸收集生物标志物的发现, 我们在这里描述了一个简单的方法来收集幼儿的呼吸。为了说明已实施的方案的代表性结果, 正在进行非酒精性脂肪酸肝病 (nafld) 评估的儿童 (8-17) 中提供了被取消识别的数据。这项研究的全部结果和分析将在以后的出版物中报告。在这项工作中, 我们报告了一个数据子集, 以演示我们协议的应用。简单地说, 孩子们被指示通过喉舌正常呼气到一个聚合物袋子里, 就像 "吹气球" 一样。这个过程重复2-4 次, 直到收集到1升的呼吸。然后将样品转移到 td 管中, 并在 gc-ms 分析之前在5°c 下储存。

研究方案

这项研究已得到华盛顿大学医学院机构审查委员会 (#201709030) 的批准。在纳入研究报告之前, 必须征得父母或法定监护人的知情同意。图2中的照片在父母书面知情同意的情况下转载。

1. 呼吸采样器总成

1. 使用一次性手套, 在呼吸采样器上安装一个纸板喉舌, 如补充图 1所示。将短长度的大直径油管连接到呼吸采样器的另一个极端, 如补充图 1所示。为每个病人使用新的导管。
2. 通过管道将呼吸接头连接到袋阀上。有关连接的呼吸采样器和包的照片, 请参见图 1 。
3. 逆时针转动进气口接头一侧的滚花拇指螺钉, 解锁阀门, 向下推袋阀杆, 打开进气道接头进行取样。
4. 将阀门锁上, 顺时针旋转进气口安装一侧的滚花拇指螺钉。
5. 确认呼吸采样器上的蓝色阀门是打开的 (与连接器平行)。
6. 在聚合物袋的标签上写上病人的身份证、日期和时间。
7. 使用推荐的程序 (可从个别制造商处获得) 在呼吸收集前使用的条件 td 吸附剂管。在吸气收集前, 将热解吸管盖好并存放在 4–5°c, 以最大限度地减少伪影。

2. 呼吸收集

1. 使用呼吸采样器 (不带袋子) 向孩子进行呼气演示。向孩子解释, 他们应该像 "吹气球" 时那样呼气, 尽可能舒服地继续呼气。把纸板喉舌夹在嘴唇之间, 尽可能地呼气。
2. 为孩子提供一个新的呼吸采样器连接到一个袋子, 并要求他们呼气, 如图 2所示。
3. 孩子一呼吸完毕, 就关闭呼吸采样器装置上的蓝阀。在额外呼气之前, 根据需要重新打开阀门。
4. 重复步骤2.2 和 2.3, 直到收集到至少1升的呼吸。对于健康的孩子, 这可能需要2次呼气, 对于生病或更小的孩子, 可能需要2-4 次呼气。1 l 呼吸是最低限度的分析要求。在袋子标签上注意从病人那里收集了多少次呼吸。有关包含不同呼吸量的袋子的照片, 请参见补充图 2 。
5. 在从呼吸采样器上分离袋子之前, 请确保将其逆时针转动, 并将阀门的阀杆向上推, 以关闭进气接头, 从而松开进气接头一侧的滚花拇指螺钉。有关在打开和关闭位置的袋阀的照片, 请参见补充图 3 。
6. 顺时针转动进口管接头一侧的滚花拇指螺钉, 将包阀锁定。
7. 从呼吸采样器中拆下袋子。
8. 在与其他病人一起使用之前, 将喉舌放在一边, 以便清洗呼吸采样器。

3. 呼吸转移到热解接管

1. 从冰箱中取出 td 管。使用制造商提供的管材封盖工具, 取下吸附剂管的长期储存盖。
2. 使用管道将 td 吸附剂管的槽端连接到取样袋上。请注意, 管方向很重要, 因为 td 管的设计仅让空气向一个方向流动, 从沟槽端开始。请注意, 从袋子到 td 的呼吸转移应在呼吸收集后1小时内完成。
3. 将 td 管的另一端插入连接到泵的管道中。
4. 打开泵, 设置为以 100 mL/min 运行10分钟。
5. 通过逆时针旋转进气道接头一侧的滚花拇指螺钉打开袋子上的阀门, 然后向下推阀门的阀杆打开进气道接头。这在补充图 4中得到了说明, 它演示了使用泵将呼吸转移到 td 吸附剂管中。
6. 启动泵, 收集10分钟后将停止。
7. 使用管封盖工具卸下道明吸附剂管, 并将瓶盖拧紧两端。必须牢固地拧紧长期储存盖, 以确保密封密封不安全。
8. 在一顶瓶盖的末端贴上标签, 表示已使用管。在贴纸上, 注明患者学习识别 (id) 号和日期。
9. 将管子放入一个可重新密封的小塑料袋中。将吸附剂管存放在4–5°c。按下其余的呼吸出的袋子和丢弃袋。记录患者学习 id、td 管序列号、收集日、呼吸收集时间、呼吸转移时间和食物摄入量 (呼吸收集前的食物摄入量和进食时间)。

4. 环境空气收集

1. 呼吸采集后, 立即收集患者环境中的环境空气样本。
   1. 使用管道将袋子连接到泵出口端口, 如补充图 5所示。
   2. 向下推袋阀的阀杆, 打开进气管接头进行取样。
   3. 通过顺时针转动进气管接头一侧的滚花拇指螺钉将阀门锁定打开。
2. 打开泵, 以 100 mL/min 的速度运行12分钟。该泵将收集1200毫升的环境空气。
3. 收集所需的体积后, 将其逆时针转动, 并将阀门的阀杆向上推, 以关闭进气道接头, 从而松开进口管接头一侧的滚花拇指螺钉。
4. 通过顺时针转动进气配件一侧的滚花拇指螺钉, 将包阀锁定。
5. 把袋子从泵上拆下来。
6. 按照第3节中的步骤执行相同的操作。唯一不同的是, 环境空气中的挥发性有机化合物将被转移, 而不是那些从呼吸。

5. 样本和数据分析

注: 呼吸和空气样品的分析条件已在^前面描述9。

1. 分析收集到的数据并检测色谱图中的化合物。使用典型的软件程序查找和识别仪器检测到的所有化合物 (图 3 a)。例如, 使用反卷积特征来识别化合物。过滤数据使用保留窗口大小系数 80, 质量高度过滤器≥100计数, 和复合绝对面积过滤器≥500计数。
2. 使用化学标准来识别呼吸和空气样本中的化合物。提取有关化合物 (如异戊烯和β-pinene) 的碱性离子峰面积 (图 4), 并比较呼吸和空气中挥发物的含量。

结果

在我们的研究中, 从圣路易斯儿童医院接受评估的10名儿童 (8-17) 采集了呼吸样本。如上文所述, 采集了呼吸样本和环境空气样本 (n = 10)。如前面所述, 使用气相色谱四极飞行时间质谱 (gc-qtof-ms) 和热解吸法对样品进行了分析。在去除背景污染物后, 已实施的协议在每个混合呼气样品中平均产生311种挥发性有机化合物 (vocs)。平均而言, 与环境对照相比, ...

讨论

尽管在过去十年中在呼吸研究方面取得了相当大的进展, 但对呼吸气体挥发物进行取样和分析的标准化做法仍未确定¹⁰。缺乏标准化的一个主要原因是呼吸收集方法的多样性, 这直接影响到任何特定呼气样本中由此产生的化学多样性。呼气液含有广泛的挥发性有机化合物, 浓度千差万别.因此, 改变收集方法不仅改变了特定样品中可能存在的化合物的丰度, 也改变了...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")