疾患バイオ マーカーの探索のための子供から息コレクション

要約

このプロトコルでは、子供からの息のサンプルの獲得のための簡単な方法について説明します。簡単に言えば、混合空気のサンプル事前ガスクロマトグラフィー質量分析の前に吸着管に集中しています。感染性と非感染性疾患の呼吸のバイオ マーカーは、この息のコレクション メソッドを使用して識別できます。

要約

息の収集と分析は、感染・非感染症、マラリア、結核、肺癌、肝疾患.など多数の揮発性のバイオ マーカーを発見する使用ことができます。このプロトコルでは、子供たちの息をサンプリングし、採取のガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) と詳細な分析を安定化の再現可能な方法について説明します。このメソッドの目的は、採取 4-15 歳のお子様から、さらに化学分析のための獲得のための標準化されたプロトコルを確立することです。まず、息をサンプリングし、3 L のバッグに接続されている 2 ウェイ バルブに接続されている段ボールのマウスピースを使用します。息 analytes は熱脱離チューブに転送し、解析まで 4-5 ° C で保存します。この手法は、以前成功した息のバイオ マーカーの同定のためマラリア児の息をキャプチャするために使用されています。その後、我々 が追加小児コホートにこの手法を応用.この方法の利点は、それ (小児集団における特定の値) の患者の一部の最小限の協力が必要です、短い回収期間は、訓練を受けたスタッフを必要としないポータブル機器で実行できます。リソースの限られたフィールドの設定。

概要

バイオ マーカーは臨床的に識別可能な病気に貢献するかもしれない正常および病的の生物学的プロセスに関する貴重な情報をもたらすことができます。最近、さまざまな病気の状態、感染症、代謝性疾患、がん¹などのバイオ マーカーとしての息の揮発性物質の評価が注目されています。呼気には、微生物派生材料 (例えば、核酸から細菌、ウイルス)、半揮発性有機化合物揮発性有機化合物 (Voc) の定量化可能なレベルが含まれています。呼気分析の中心的な目標は、非侵襲的医療条件および環境の露出の状態に洞察力を得ることです。収集および興味の成分によって、呼気を分析するさまざまな方法があります。現時点で研究結果の比較分析を複雑にする標準化された呼気コレクション メソッドはありません。サンプリング プロシージャ自体呼吸解析の下流の結果にかなりの効果があり、息コレクション手順の標準化が不可欠です。

多くの研究で後半呼吸息のサンプリングは雇われた^2,3です。このサンプリングは、優先的に呼吸周期の終わりに空気をキャプチャするために呼気 (「デッド スペース」) 最初部分を破棄することを含みます。この方式の利点は、内因性、患者固有の豊かな中外因性 VOC (例えば、環境 Voc) のレベルを最小限に抑えられます。このメソッドは、息のサンプルを収集する前に個人からの呼気の最初の数秒間を除外します。他の研究者は有効期限^4、5の定義済みの段階でサンプリングを有効にする圧力センサーを採用しています。圧力センサーは、複雑な工学を必要とするため、この代替方法には献身的で比較的高価なサンプリング デバイスが必要です。

小児呼吸サンプリングを特に困難になることができます。主な懸念は、幼児が自発的呼気「デッド スペース」空気のためのプロトコルと協力することがないことです。このため、子供たちから混合呼吸息を取得する簡単です。しかし、混合呼吸器呼気と主要な警告は環境や材料の汚染の危険性です。したがって、小児コレクション性はフィールドで運転は問題です。

また、収集方法、息試料の保存することができますもサンプルの質に影響。息 exhalate、揮発性有機化合物作る息採取ストレージ^6,7に関連する問題に特に敏感超低濃度 (兆ごとの部分) で湿度が高い。プロトン移動反応質量分析計 (PTR MS) のようなリアルタイム技術の偉大な潜在性にもかかわらず GC-MS のまま息のサンプルの分析のためのゴールド スタンダードです。呼気のガスクロマトグラフィー質量分析がオフライン手法と、熱脱着 (TD) チューブ、固相マイクロ抽出、ニードル トラップ デバイスなど前濃度方法それ結合されます。前濃度前に呼気をポリマー袋⁸に一時的に保存する必要があります。ポリマー袋は、適度な価格、比較的よい耐久性および再利用性のため人気があります。中袋は再利用、時間と労力が効率的な清掃^7、8を確認しておく必要。各特定の袋タイプも品質管理、再利用性、および回復の経験的に断固としたな、標準化されたプロシージャが必要です。

TD チューブを彼らは揮発性物質の数が多いをキャプチャし、カスタマイズすることができますので、広く息前濃度に使用されます。TD チューブを梱包に使用される吸収性材料は、特定のアプリケーションや興味の特定のターゲットを揮発性物質に適応させること。TD チューブ実質的に息バイオ マーカー研究、特に遠隔地の利便性の向上、TD チューブ安全ので、少なくとも 2 週間の息の揮発性物質を保管、輸送³易い。

バイオ マーカー探索に小児呼吸コレクションを標準化する努力、ここで我々 は幼児から息を収集する簡単な方法をについて説明します。実装プロトコルの代表の結果を示すためには、匿名化したデータを提示する子供 (年齢 8-17) の継続的コホートからアルコールの脂肪酸の肝臓病 (NAFLD) に対する評価を受けています。全結果と本研究の分析より遅い出版物で報告されます。この作業では、プロトコルのアプリケーションを実証するデータのサブセットを報告します。まるで「風船をふくらまして「簡単に言えば、子供を指示し通常マウスピースを介してポリマー袋の中に息を吐き出すに息の 1 L が収集されるまで、プロセスは 2-4 回を繰り返されます。サンプルは TD チューブに転送し、ガスクロマトグラフィー質量分析の前に 5 ° C で保存します。

プロトコル

研究は、制度のレビュー ボードのワシントン大学医学部 (#201709030) によって承認されています。親または研究の包含前に保護者からインフォームド コンセントを得た。図 2の写真は、書面による通知保護者の同意で再現。

1. 息サンプラー アセンブリ

1. 使い捨て手袋を使用すると、補足図 1に示すよう、段ボールのマウスピースを息サンプラーに取り付けます。補足図 1に示すように、息のサンプラーの他の極端に大口径チューブの短い長さを取り付けます。患者ごとに新しいチューブを使用します。
2. チューブを介して袋弁に息コネクタを取り付けます。息サンプラーと接続されているバッグの写真は、図 1を参照してください。
3. 反時計回りにバルブのロックを解除する継ぎ手入口側にローレットつまみを回すと押し袋弁の茎、サンプリング用の継手入口を開くには。
4. 時計回りに継ぎ手入口側にローレットつまみを回すことによって弁の開閉をロックします。
5. 息サンプラーの青いバルブが開いていることを確認 (コネクタと平行)。
6. ポリマー袋のラベルに患者 ID、日付、および時刻を書きます。
7. 条件 TD 吸着管息コレクションを使用する前は、(個々 の製造業者から利用可能) の手順をお勧めします。キャップ、アーチファクトを最小限に抑えるため息コレクション前に 4 ~ 5 ° C で熱脱離チューブを格納します。

2. 息コレクション

1. 子供に呼吸の呼気のデモを実行するには、(袋) なし息サンプラーを使用します。「風船爆破」ときだろうか彼らが快適にできる限り息を吐き続けるような息を取得する必要があります彼らの子供に説明します。あなたの唇とマウスピースを段ボールと限りすることができます息を吐き出します。
2. バッグに接続されている新しい息サンプラーを子供に提供してもらう、デモのように息を図 2に示すよう。
3. 子供が息を吐き終わったすぐに息サンプラー デバイスの青いバルブを閉じます。追加キラーズの前に必要に応じて、バルブを開きます。
4. 息の少なくとも 1 L が収集されるまでは、2.2 と 2.3 の手順を繰り返します。健常児 2 キラーズをかかることがありますこの、病気や若い子 2-4 キラーズ。息の 1 L は、最低限の分析要件です。患者から採取したどのように多くの呼吸バッグのラベルに注意してください。息の異なるボリュームを含む袋の写真の補足図 2を参照してください。
5. 息サンプラーからバッグをデタッチする前にそれを反時計回りに回すことにより継ぎ手入口側にローレットをゆるめます確認し、閉じる入口継手までバルブのステムをプッシュします。オープンおよびクローズ ポジションで袋弁の写真の補足の図 3を参照してください。
6. 袋弁を時計回りに継ぎ手入口側にローレットつまみを回して閉めをロックします。
7. 息サンプラーからバッグをデタッチします。
8. マウスピースの処分し、異なる患者に使用する前に洗浄するため息サンプラーを脇に置きます。

3. 呼吸熱脱離チューブに転送

1. TD チューブを冷蔵庫から取り出します。メーカー提供のチューブ キャップ/コレク ツールを使用して、吸着管の長期的なストレージ ・ キャップを取り外します。
2. チューブを使用してサンプリング バッグに TD の吸着管の溝の端を接続します。管の向きが重要、TD としてチューブ、溝の端から始まってだけ、1 つの方向に流れる空気を持っている設計されて ことに注意してください。息コレクションの 1 時間以内 td バッグから息の転送が行われることに注意してください。
3. TD チューブのもう一方の端をポンプに接続されているチューブに挿入します。
4. ポンプをオンにして、100 mL/min で 10 分間で実行する設定。
5. 入口継手側にローレットつまみを反時計回り回して袋にバルブを開き、開く入口継手にバルブのステムをプッシュします。これは、補足図 4ポンプを使用して TD 吸着管に息転送について説明するに示します。
6. コレクションの 10 分後停止するポンプを起動します。
7. TD 吸着チューブ、チューブ キャップ/コレク ツールを使用して、両端にキャップを締めます。リーク気密シールを確保するために長期的なストレージ ・ キャップをしっかりと締める必要があります。
8. チューブが使用されているを示す 1 つのキャップの端にステッカーを配置します。ステッカーの患者の診療識別 (ID) 番号と日付を示します。
9. 小さな再密封可能なビニール袋にチューブを置きます。4-5 ° C でストア収チューブ袋の中から息の残りの部分を押し、袋を破棄します。患者の診療の記録 ID、TD チューブ シリアル番号、収集日、息コレクションの時間、息転送と摂餌量 (呼吸コレクションおよび消費の食事の前に食物摂取の時間) の時間。

4. 周囲の空気のコレクション

1. 息のコレクションの直後に患者の環境で周囲の空気のサンプルを収集します。
   1. ポンプ排気ポートにバッグを添付する補足の図 5に示すように、チューブを使用します。
   2. 開くサンプリング用入口継手袋弁の茎をプッシュします。
   3. 入口継手側にローレットつまみを時計回りに回してバルブを開くをロックします。
2. ポンプをオンにして、12 分の 100 mL/分で実行する設定。ポンプは、大気の 1,200 mL を収集します。
3. 要求されたボリュームが収集されたあとそれを反時計回りに回すことにより継ぎ手入口側にローレットをゆるめます、閉じる入口継手までバルブのステムをプッシュします。
4. 袋弁を入口継手側にローレットつまみを時計回りに回して閉めをロックします。
5. ポンプからバッグをデタッチします。
6. セクション 3 と同じ手順に従ってください。唯一の違いは、その大気中 VOCs を移管、息からです。

5. サンプルとデータ解析

注: 呼吸と空気のサンプルの分析のための条件がされている⁹で説明しました。

1. 収集したデータを分析し、クロマト グラムの化合物を検出します。典型的なソフトウェア プログラムを使用して検索および計測器 (図 3 a) によって検出されたすべての化合物を識別します。たとえば、化合物を識別するためにデコンボリューション機能を使用します。80 の保存ウィンドウ サイズ係数を使用してデータをフィルター処理、大量ハイツ フィルター ≥100 カウント、および化合物の絶対領域フィルター ≥500 をカウントします。
2. 呼吸と空気サンプルでアイデンティティ化合物化学の標準を使用します。イソプレンおよび β-ピネン (図 4) など、関心の化合物の基本イオン ピーク領域を抽出し、息や空気の揮発性物質のレベルを比較します。

結果

私たちの研究では 10 人の子供 (8-17 歳) から採取した息はセントルイス小児病院での評価を受けています。息と周囲の空気サンプルが (n = 10) 上記のように収集されました。上記⁹におけるガスクロマト グラフ四重極飛行時間質量分析 (GC-QToF-MS) と熱脱着, を使用して行なった。バック グラウンド汚染物質を除去した後実装されたプロトコルは混?...

ディスカッション

最後のディケイド息研究でかなりの進歩にもかかわらずサンプリングと呼吸ガスの揮発性成分分析の標準化されたプラクティス未定義¹⁰のまま。標準化の欠如の主な理由は、任意の与えられた呼気サンプルで現在結果の化学的多様性に直接影響を与える息のコレクション方法の多様性をされています。Exhalate の息には、非常に多様な濃度⁶揮発性有機化合物?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")