아이 들 질병 바이오 마커 발견에서 호흡 컬렉션

요약

이 프로토콜에는 아이 들에서 호흡 샘플의 수집을 위한 간단한 방법을 설명합니다. 간단히, 혼합된 공기의 샘플 미리 매 튜브 가스 크로마토그래피-질량 분석 분석 이전에 집중 된다. 전염 성 및 비 전염 성 질환의 바이오 마커 호흡이 호흡 컬렉션 메서드를 사용 하 여 확인할 수 있습니다.

초록

전염 성 및 비 전염 성 질병, 말라리아, 결핵, 폐암, 간 질환. 등의 수에서 휘발성 biomarkers를 발견 하는 데 사용 수 호흡 수집 및 분석 이 프로토콜 아이 들에 있는 호흡을 샘플링 한 다음 호흡 가스 크로마토그래피-질량 분석 (GC-MS)와 추가 분석을 위해 샘플을 안정화 재현할 수 방법을 설명 합니다. 이 방법의 목표는 4-15 세 어린이에서 더 화학 분석을 위한 호흡 샘플의 수집을 위한 표준화 된 프로토콜 설정. 첫째, 호흡 3 L 가방에 연결 된 2-방향 밸브에 연결 된 골 판지 마우스 피스를 사용 하 여 샘플링 됩니다. 호흡 analytes 열 탈 착 튜브를 전송 그리고 분석까지 4-5 ° C에 저장 됩니다. 이 기술은 이전 성공적인 호흡 바이오 마커 식별에 대 한 말라리아와 어린이의 호흡을 캡처하는 데 사용 되었습니다. 그 후, 우리가 성공적으로 추가 소아 동료에이 기술을 적용 했습니다. 이 방법의 장점은 (소아과 인구에 있는 특정 값)의 환자의 부분에 최소한의 협력을 요구 한다, 짧은 컬렉션 기간, 훈련된 직원을 필요로 하지 않습니다을 휴대용 장치에 수행할 수 있습니다. 리소스 제한 필드 설정입니다.

서문

바이오 마커 임상 식별 질병에 공헌할 지도 모른다 정상 및 병 적인 생물 학적 과정에 대 한 유용한 정보를 얻을 수 있습니다. 최근, 질병 상태, 감염, 대사 장애, 암 ¹등의 다양 한 생체로 호흡 휘발성의 평가에 관심을 증가 되었습니다. Exhaled 호흡에 휘발성 유기 화합물 (Voc), 세미 휘발성 유기 화합물, 및 microbially 파생된 자료 (예를 들면, 박테리아 및 바이러스 핵 산)의 정량 수준을 포함 되어 있습니다. Exhaled 호흡 분석의 중앙 목표 비 접촉 의료 조건 또는 환경 노출의 상태에 대 한 통찰력을 얻을 것입니다. 수집의 성분에 따라 exhaled 호흡을 분석 하기 위한 다양 한 방법이 있다. 현재 연구에서 결과의 비교 분석을 복잡 하 게 없는 표준화 exhaled 호흡 수집 방법이입니다. 숨 결 수집 절차 표준화 샘플링 절차 자체는 다운스트림 호흡 분석 결과에 상당한 영향을 필수적, 이다.

많은 연구에서 늦게 호흡 호흡 샘플링은 고용된^2,3. 이 샘플링 우선적으로 호흡 사이클의 끝에 공기를 캡처하기 위해 exhaled 호흡 ("죽은 공간")의 초기 부분을 삭제 하는 작업이 포함 됩니다. 이 전략의 장점은 내 생, 환자 관련 Voc에 대 한 풍부 하는 동안 그것은 exogenous 휘발성 유기 화합물 (예: 환경 Voc) 수준을 최소화 이다. 이 메서드는 호흡 샘플을 수집 하기 전에 개인에서 증발 기의 처음 몇 초를 제외 합니다. 다른 조사는 샘플링 만료^4,5의 미리 정의 된 단계를 활성화 하는 압력 센서를 고용 했다. 압력 센서에 필요한 복잡 한 엔지니어링,이 대체 메서드를 전용 하 고 상대적으로 비용이 많이 드는 샘플링 장치를 필요 합니다.

소아 호흡 샘플링 특히 도전적 일 수 있다입니다. 주요 관심사는 어린이 수 있습니다 하지 프로토콜 "죽은 공간" 공기의 자발적인 증발 기에 대 한 협력 이다. 이러한 이유로, 아이 들에서 혼합된 호흡 호흡을 얻기 쉽습니다. 그러나, 혼합된 호흡 호흡 샘플 주요 주의할 환경 및 소재 오염 위험입니다. 따라서, 소아 컬렉션의 타당성은 분야에서 운전 관심사입니다.

또한, 수집 방법, 호흡 샘플의 저장 또한 샘플 품질을 좌우할 수 있다. Exhalate 호흡에 휘발성 유기 호흡 화합물 게 숨 샘플 저장^6,7에 관련 된 문제에 특히 취약의 매우 낮은 농도 (부분 당 조) 높은 습도. 양성자 이전 반응 질량 분석 (PTR-MS) 같은 실시간 기법의 중대 한 잠재력에도 불구 하 고 GC-MS 분석의 호흡 샘플에 대 한 황금 표준 남아 있습니다. 숨 샘플의 GC-MS 분석 오프 라인 기술 이므로, 열 탈 착 (TD) 튜브, 단단한 단계 마이크로-추출, 및 바늘 트랩 장치 등 사전 농도 방법 결합 이다. 사전 농도, 이전 숨 샘플 폴리머 가방⁸에 일시적으로 저장 될 필요가 있다. 폴리머 가방은 됩니다 그들의 적당 한 가격, 상대적으로 좋은 내구성 및 재사용. 가방을 다시 사용할 수 있습니다, 하는 동안 시간과 노력은 효율적인 청소^7,8을 확인 해야 합니다. 각 특정 가방 종류는 또한 품질 관리, 재사용, 및 복구에 대 한 경험적으로 결정 하 고 표준화 된 절차를 요구 한다.

그들은 휘발성의 많은 수를 캡처하고 사용자 지정할 수 있습니다 때문에 TD 튜브 호흡 사전 집중을 위해 널리 사용 됩니다. TD 튜브 포장에 사용 된 흡수 성 물자는 특정 응용 프로그램 및 관심의 특정 대상 휘발성에 맞게 수 있습니다. TD 튜브 실질적으로 호흡 바이오 마커 연구, 특히 필드에 원격 사이트의 편의 개선, TD 튜브 안전 하 게 하기 때문에 적어도 2 주 동안 숨을 휘발성 저장 하 고 쉽게 전송³.

바이오 마커 발견을 위한 소아 호흡 컬렉션을 표준화 하기 위해, 여기 우리가 어린 아이에서 호흡을 수집 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 구현 된 프로토콜의 대표적인 결과 설명 하기 위해 드 식별된 데이터 어린이 (8-17 세)의 온-가 일대에서 선물 된다 무 알콜 지방산 간 질병 (NAFLD)에 대 한 평가 받고. 전체 결과 본이 연구의 분석은 나중에 발행물에서 보고 됩니다. 이 작품에서는, 우리는 우리의 프로토콜의 응용 프로그램을 설명 하는 데이터의 하위 집합을 보고 합니다. "풍선 불고." 마치 어린이 폴리머 가방에 마우스 피스를 통해 정상적으로 배출 하도록 지시는 간단 하 게, 호흡의 1 L 수집 될 때까지 프로세스는 2-4 회 반복 됩니다. 샘플은 다음 TD 튜브로 전송 하 고 GC-MS 분석 하기 전에 5 ° C에 저장.

프로토콜

연구는 제도적 검토 보드의 워싱턴 대학의과 대학 (#201709030)에 의해 승인 되었습니다. 동의 부모 또는 법적 보호자 사전 연구에 포함 하기에서 얻은 했다. 그림 2 에 있는 사진 정보 보호자 동의서와 함께 재현.

1. 호흡 샘플러 어셈블리

1. 일회용 장갑을 사용 하 여, 연결 판지 피스 호흡 샘플러 보충 그림 1에서 보듯이. 추가 그림 1에서 보듯이 호흡 샘플러의 다른 극치에 대 직경 배관의 짧은 길이 연결 합니다. 새로운 튜브를 사용 하 여 각 환자에 대 한.
2. 가방 밸브 튜브를 통해 호흡 커넥터를 연결 합니다. 호흡 샘플러와 가방 연결의 사진 그림 1 을 참조 하십시오.
3. 밸브를 잠금 해제를 시계 반대 방향으로 피팅 입구 측면 널드 나사를 설정 샘플링에 대 한 피팅 입구를 열고, 가방 밸브의 줄기를 밀어.
4. 시계 방향으로 피팅 입구 측면 널드 나사를 선회 하 여 밸브 열기를 잠급니다.
5. 호흡 샘플러에 파란색 밸브 개방 확인 (병렬 커넥터와).
6. 폴리머 가방 레이블에 환자 ID, 날짜 및 시간을 작성 합니다.
7. 호흡 컬렉션을 사용 하 여 이전 조건 TD 매 튜브 권장 절차 (개별 제조 업체에서 사용 가능). 모자와 유물을 최소화 하기 위해 숨 컬렉션 이전 4-5 ° C에서 열 탈 착 튜브를 저장 합니다.

2. 호흡 컬렉션

1. (가방) 없이 숨 샘플러를 사용 하 여 아이 게 호흡 증발 기의 데모를 수행 합니다. 그들이 할 때 "풍선 폭파" 하 고 그들이 편안 하 게 할 수 있는 만큼 밖으로 호흡을 계속 하는 처럼 그들은 밖으로 호흡 한다 아이 게 설명 한다. 당신의 입술 사이 골 판지 떠 넣고 가능한 멀리 당신이 수 있는 배출.
2. 가방에 연결 된 새로운 호흡 샘플러와 아이 제공 하 고 그림 2에서 볼 수 있듯이, 데모에서 배출 하도록 요청.
3. 아이가 밖으로 호흡 완료 되 자 마자 숨 샘플러 장치에 파란 밸브를 닫습니다. 추가 exhalations 전에 필요에 따라 밸브를 다시 엽니다.
4. 2.2 및 2.3 단계를 반복 하 여 호흡의 적어도 1 L 수집 되었습니다. 건강 한 아이 대 한 2 exhalations를 걸릴 수 있습니다이 아 프 거 나 어린 아이 2-4 exhalations에 대 한. 호흡의 1 L 최소 분석 요구 사항입니다. 가방에 참고 얼마나 많은 호흡 환자에서 수집 된 레이블. 호흡의 다른 볼륨을 포함 한 가방 사진 추가 그림 2 를 참조 하십시오.
5. 호흡 샘플러에서 가방을 분리 하기 전에 널드 풉니다 반시계 선회 하 여 피팅 입구 측에 확인 하 고 닫기 입구 피팅까지 밸브의 줄기를 밀어. 개방 및 폐쇄 위치에서 가방 밸브의 사진 보충 그림 3 을 참조 하십시오.
6. 시계 방향으로 피팅 입구 측면 널드 나사를 선회 하 여 폐쇄 가방 밸브를 잠급니다.
7. 호흡 샘플러에서 가방을 분리 합니다.
8. 마우스 피스 처분 하십시오 그리고 다른 환자와 함께 사용 하기 전에 청소를 위해 호흡 샘플러를 치워.

3. 호흡 전송 열 탈 착 튜브를

1. 냉장고에서 TD 튜브를 제거 합니다. 제조업체에서 제공한 튜브 상한/uncapping 도구를 사용 하 여 매 관의 장기 저장 뚜껑을 제거 합니다.
2. 튜브를 사용 하 여 샘플링 가방에 TD 매 튜브의 홈된 끝을 연결 합니다. Note 튜브 방향에 중요 한, TD로 튜브는 홈된 끝에서 시작 하는 한 방향 으로만 흐르는 공기를가지고 하도록 설계 되었습니다. 유의 하십시오 TD 가방에서 호흡의 전송 호흡 컬렉션의 1 시간 안에 이루어져야 한다.
3. 펌프에 연결 된 튜브에 TD 튜브의 다른 쪽 끝을 삽입 합니다.
4. 펌프를 켜고 10 분 동안 100 mL/min에서 실행 하도록 설정.
5. 측면 입구 피팅 널드 나사를 반시계 선회 하 여 가방에 밸브를 열고 오픈 입구 피팅까지 밸브의 줄기를 밀어. 이것은 보충 그림 4에 펌프를 사용 하 여 TD 매 관으로 호흡 전송에에서 나와 있습니다.
6. 컬렉션의 10 분 후에 중지 됩니다 펌프를 시작 합니다.
7. TD 매 튜브를 제거 하 고 튜브 상한/uncapping 도구를 사용 하 여 양쪽 끝에 모자를 조입니다. 장기 저장 모자는 단단히 누출 단단한 물개를 지키기 위하여 강화 해야 합니다.
8. 튜브를 사용을 한 뚜껑의 끝에는 스티커를 놓습니다. 스티커에 환자 연구 식별 (ID) 번호 및 날짜를 표시 합니다.
9. 작은 다시 sealable 비닐 봉투에 튜브를 배치 합니다. 4-5 ° c.에 게 매 관 부 숨의 나머지를 누르고 가방을 삭제. 환자 연구 기록 ID, TD 튜브 일련 번호, 수거일, 호흡 컬렉션의 시간, 호흡 전송, 및 음식 섭취 (호흡 수집 및 소비 하는 식사 하기 전에 음식 섭취 량의 시간)의 시간.

4. 대기 컬렉션

1. 호흡 컬렉션 직후 환자의 환경에서 주위 공기 샘플을 수집 합니다.
   1. 연결 가방 펌프 출구 포트에 튜브를 사용 하 여 추가 그림 5에서 볼 수 있듯이.
   2. 오픈 샘플링 입구 피팅까지 가방 밸브의 줄기를 밀어.
   3. 시계 방향으로 돌려 입구 피팅 측면 널드 나사 밸브 오픈을 잠급니다.
2. 펌프를 켜고 12 분 100 mL/min에서 실행 하도록 설정. 펌프 주변 공기의 1200 mL를 모을 것 이다.
3. 요청된 볼륨을 수집 후 반시계 선회 하 여 피팅 입구 측면 널드 풉니다 그리고 가까운 입구 피팅까지 밸브의 줄기를 밀어.
4. 시계 방향으로 돌려 입구 피팅 측면 널드 나사 폐쇄 가방 밸브를 잠급니다.
5. 펌프에서 가방을 분리 합니다.
6. 섹션 3에서 동일한 단계를 따릅니다. 유일한 차이점은 아니라 그 호흡에서 그 주변 공기 Voc 옮겨질 것 이다.

5. 샘플 및 데이터 분석

참고: 호흡과 공기 샘플의 분석을 위한 조건 되었습니다⁹위에서 설명한.

1. 수집 된 데이터를 분석 하 고는 chromatograms에 화합물을 감지. 일반적인 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 찾아서 악기 (그림 3A)에 의해 감지 모든 화합물을 식별. 예를 들어 deconvolution 기능을 사용 하 여 화합물을 식별. 80의 보존 창 크기 요소를 사용 하 여 데이터를 필터링, 대량 하이츠 필터 ≥100 계산, 그리고 복합 절대 영역 필터 ≥500 계산.
2. 호흡과 공기 샘플 정체성 화합물 화학 기준을 사용 하 여. 관심,이 소프 렌, β-피 넨 (그림 4) 등의 화합물의 기본 이온 피크 영역을 추출 하 고 공기 호흡에 휘발성의 레벨을 비교.

결과

우리의 연구에서 호흡 샘플 10 어린이 (8-17 세)에서 수집 된 St. 루이 아동 병원에서 평가 겪고 있습니다. 숨 샘플 및 주변 공기 샘플 (n = 10) 위에서 설명한 대로 수집 했다. 샘플 가스 착 색 인쇄기 4 중 극 시간의 비행 질량 분석 (GC-QToF-MS) 및 열 탈 착를 사용 하 여 앞에서 설명한⁹로 분석 되었다. 배경 오염 물질의 제거 후, 구현된 프로토콜 혼합된 exhal...

토론

지난 10 년간 호흡 연구에서 상당한 진행에도 불구 하 고 샘플링 및 호흡 가스 휘발성의 분석에 대 한 표준화 된 사례에는 정의 되지 않은¹⁰남아 있다. 표준화의이 부족에 대 한 주요 이유는 다양 한 결과 화학 다양성을 어떤 주어진된 exhaled 호흡 샘플에 존재에 직접적인 영향을 미칠 호흡 수집 방법 되었습니다. Exhalate 호흡 매우 다양 한 농도⁶에서 휘발성 유기 화...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")