נשימה אוסף ילדים למען גילוי סמן מחלה

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה לצורך רכישת דגימות נשימה מילדים. בקצרה, דגימות אוויר מעורב מרוכזים מראש צינורות sorbent לפני ניתוח גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית. ניתן לזהות סמנים ביולוגיים נשימה של מחלות זיהומיות, שאינן זיהומיות בשיטה זו אוסף נשימה.

Abstract

נשימה איסוף וניתוח יכול לשמש כדי לגלות סמנים ביולוגיים נדיף במספר מחלות זיהומיות שאינן זיהומיות, כגון מלריה, שחפת, סרטן ריאות מחלת כבד. פרוטוקול זה מתאר שיטה ישימה עבור דגימה נשימה אצל ילדים וייצוב ואז דגימות נשימה לצורך ניתוח נוסף עם גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS). מטרת שיטה זו היא ליצור פרוטוקול מתוקננת לצורך רכישת דגימות נשימה לצורך ניתוח כימי נוסף, של ילדים בגילאי 4-15 שנים. ראשית, נשימה נדגמים באמצעות דוברת מקרטון מחובר שסתום 2-way, אשר מחובר אל שקית 3 L. נשימה analytes לאחר מכן הועבר צינור desorption תרמית, המאוחסנים ב 4-5 ° C עד הניתוח. טכניקה זו שימש בעבר ללכוד את הנשימה של ילדים עם מלריה לזיהוי סמן נשימה מוצלחת. לאחר מכן, אנחנו בהצלחה החלת טכניקה זו על גדודים ילדים נוספים. היתרון של שיטה זו הוא כי דורש שיתוף מינימלית של המטופל (של ערך מסוים בקרב אוכלוסיות ילדים), תקופה קצרה אוסף, לא דורשת צוות מיומן בו ניתן לבצע באמצעות ציוד נייד הגדרות שדה משאב מוגבל.

Introduction

סמנים ביולוגיים יכולות להניב מידע חיוני על תהליכים ביולוגיים נורמליים ופתולוגיים שעשויים לתרום קלינית לזיהוי המחלה. לאחרונה, יש כבר עניין גובר בהערכה של נשימה שיכללו חומרים נדיפים כמו סמנים ביולוגיים למגוון רחב של מצבי מחלה, כולל זיהום, הפרעות מטבוליות סרטן ¹. והבל הפה מכיל רמות לכימות של תרכובות אורגניות נדיפות (Voc), תרכובות אורגניות נדיפות למחצה, microbially נגזרת חומר (למשל, חומצות גרעין מפני חיידקים ווירוסים). המטרה המרכזית של ניתוח והבל הפה הוא להשיג תובנה המצב של מצב רפואי ו/או חשיפות סביבתיות לא פולשני. ישנן שיטות שונות עבור איסוף וניתוח והבל הפה, בהתאם המרכיבים של עניין. כיום יש אין שיטה אוסף מתוקננת והבל הפה, אשר מסבך ניתוח השוואתי של תוצאות מעבר ללימודים. האחדת נשימה אוסף נהלים חיוני, כמו הליך הדגימה עצמה יש השפעה רבה על התוצאות במורד הזרם של נשימה ניתוחים.

במחקרים רבים, מאחר נשימה נשימה הדגימה הוא המועסקים^2,3. דגימה זו כרוכה השמטת את החלק הראשוני של והבל הפה ("שטח מת"), על מנת ללכוד את האוויר מעדיפים בסוף מחזור נשימה. היתרון של אסטרטגיה זו היא כי מצמצם את רמות VOC אקסוגני (למשל, איכות הסביבה Voc), תוך העשרת עבור Voc אנדוגני, מטופל ספציפי. שיטה זו אינה כוללת השניות הראשונות של נשיפה מאדם בודד לפני איסוף המדגם נשימה. חוקרים אחרים המועסקים חיישן לחץ כדי להפעיל את הדגימה במהלך תקופה מוגדרת מראש של תפוגה^4,5. מכיוון חיישני לחץ דורשים הנדסה מורכבים, שיטה חלופית זו דורשת מכשיר דגימה ייעודי ויקר יחסית.

דגימה נשימה בילדים יכול להיות מאתגר במיוחד. מופעיו היא ילדים צעירים עשויים להיות מסוגלים לשתף פעולה עם פרוטוקולים עבור מרצון נשיפה של אוויר "שטח מת". מסיבה זו, קל יותר להשיג נשימה נשימה מעורבת של ילדים. אזהרה גדולה עם דגימות נשימה נשימה מעורבות זאת, הסיכון של זיהום סביבתי, החומרי. לכן, הכדאיות של אוסף ילדים היא דאגה נהיגה בשטח.

בנוסף, שיטות איסוף, אחסון של דגימות נשימה יכול להשפיע גם על איכות דגימת. הלחות הגבוהה exhalate נשימה, ריכוז נמוך במיוחד (חלקים-לכל-טריליון) נשימה אורגניים נדיפים תרכובות להפוך נשימה דגימות רגישים במיוחד לבעיות הקשורות לאחסון^6,7. למרות הפוטנציאל הגדול של טכניקות בזמן אמת כמו פרוטון העברה התגובה-ספקטרומטריית (PTR-MS), GC-MS עדיין תקן הזהב לניתוח של דגימות נשימה. מאז GC-MS ניתוח דוגמאות הנשימה הוא שיטת מנותק, זה משולב עם ריכוז קדם שיטות כגון צינורות התרמי desorption (TD), מיקרו-מיצוי מעבדתי והתקני מלכודת המחט. לפני קדם ריכוז, דגימות נשימה צריך להיות מאוחסנים באופן זמני בפולימר שקיות⁸. פולימר שקיות פופולריים בשל מחיר מתון שלהם, עמידות טובה יחסית, שימושית. בזמן ייתכן ניתנים לשימוש חוזר בתוך שקיות, זמן ומאמץ נדרשים על מנת להבטיח יעילות ניקוי^7,8. כל סוג תיק מסוים דורש גם נחושה מדעית ושגרות מתוקנן עבור בקרת איכות, שימושית ושחזור.

צינורות TD נמצאים בשימוש נרחב עבור הנשימה ריכוז מראש כי הם ללכוד מספר גדול של שיכללו חומרים נדיפים, יכול להיות מותאם אישית. החומרים סופג בהם אריזה צינורות TD עשוי להיות מותאם כדי שיכללו חומרים נדיפים מסויימת עניין ויישומים מסוימים. TD צינורות באופן משמעותי לשפר את הנוחות של מחקרים סמן נשימה, במיוחד באתרים מרחוק שדה, כי TD צינורות בבטחה לאחסן שיכללו חומרים נדיפים נשימה במשך לפחות שבועיים, בקרבת תחבורה³.

במאמץ לתקנן נשימה בילדים אוסף עבור גילוי סמן, כאן אנו מתארים שיטה פשוטה כדי לאסוף את הנשימה של ילדים צעירים. כדי להמחיש את התוצאות נציג של הפרוטוקולים מיושמים, מוצגים נתונים מבטל את שזוהה מ פוסקת קוהורטה של הילדים (גיל 8-17) שעברו הערכה למחלה ללא אלכוהול חומצת שומן בכבד (אלכוהולי NAFLD). תוצאות מלאות וניתוח של מחקר זה ידווחו בפרסום מאוחר יותר. בעבודה זאת, מדווחים ערכת משנה נתונים כדי להדגים את היישום של פרוטוקול שלנו. בקצרה, הילדים הורו נשוף בדרך כלל באמצעות פייה לשקית פולימר, כאילו "לפוצץ בלון". התהליך חוזר על עצמו 2 - 4 פעמים עד 1 ליטר נשימה נאסף. המדגם הוא לאחר מכן הועבר לתוך צינור TD, המאוחסנים ב 5 ° C לפני ניתוח GC-MS.

Protocol

המחקר אושרה על ידי המוסדיים סקירה הלוח של וושינגטון הספר לרפואה של אוניברסיטת (#201709030). הסכמה מדעת היה המתקבלים הורה או אפוטרופוס לפני ההכללה במחקר. תמונות באיור 2 מרובה עם הסכמת ההורים הודיע בכתב.

1. נשימה סמפלר הרכבה

1. באמצעות כפפות חד פעמיות, לצרף לגלקסיית קרטון הדוגם נשימה, כפי שמוצג משלימה איור 1. צרף באורך קצר של צינורות בקוטר גדול לקיצוניות אחרת של דוגם הנשימה, כפי שמוצג באיור1 משלימה. השתמש לצנרת חדשה עבור כל מטופל.
2. לצרף את מחבר נשימה השסתום תיק דרך הצנרת. לקבלת תמונה של דוגם את הנשימה ואת התיק מחובר, ראה איור 1 .
3. להפוך את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים נגד כיוון השעון כדי לפתוח את השסתום לדחוף את הגבעול של השסתום התיק למטה, כדי לפתוח את הים נאוה הדגימה.
4. לנעול את פתח השסתום, על-ידי הפעלת את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים עם כיוון השעון.
5. לאשר כי השסתום כחול על הדוגם נשימה פתוחה (מקביל עם המחבר).
6. לכתוב החולה מזהה, תאריך ושעה על התווית של השקית פולימר.
7. תנאי TD צינור sorbent לפני הנשימה באמצעות אוסף מומלץ הליכים (זמין של יצרנים בודדים). קאפ ולאחסן desorption תרמי צינורות ב 4-5 מעלות צלזיוס לפני נשימה אוסף כדי למזער את החפצים.

2. נשימה אוסף

1. לבצע הדגמה של נשימה נשיפה לילד באמצעות דוגמאות נשימה (בלי תיק). להסביר לילד כי הם צריכים תנשוף החוצה כאילו הם עושים כאשר "ניפוח בלון" ולהמשיך נושף ככל שהם יכולים בנוחות. ויצאה קרטון בין השפתיים שלך ולנשוף רחוק ככל שאתה יכול.
2. לספק את הילד עם דוגמאות נשימה החדש מצורף תיק ובקש ממנו לנשוף כמו בהפגנה, כמופיע באיור2.
3. סגור את השסתום כחול על המכשיר דוגם נשימה ברגע שהילד סיים נושף. פתח מחדש את השסתום כנדרש לפני נשימות נוספים.
4. חזור על שלב 2.2 ו- 2.3 עד שנאספו לפחות 1 ליטר של נשימה. עבור ילד בריא זה עשוי להימשך 2 נשימות, ועבור נשימות של ילד חולה או צעירים 2 – 4. 1 ליטר נשימה הוא הדרישה המינימלית אנליטית. הערה על התווית התיק כמה נשימות שנאספו מן המטופל. ראה איור משלים 2 תמונה של התיק המכיל כמויות שונות של נשימה.
5. לפני ניתוק השקית. של דוגם הנשימה, הקפד לשחרר את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים על ידי הפעלתו התרחקותו ודחף את הגבעול של השסתום עד קרוב ההתאמה מפרץ צר. ראה איור משלים 3 צילום של השסתום התיק במצב פתוחים וסגורים.
6. לנעול את השסתום התיק נסגר על ידי הפעלת את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים עם כיוון השעון.
7. ניתוק השקית. של דוגם הנשימה.
8. להיפטר פיו, לשים בצד את הדוגם נשימה לניקוי לפני השימוש עם מטופל אחר.

3. נשימה העברת צינורות desorption תרמית

1. הסר את הצינור TD מהמקרר. הסר את הפקקים אחסון לטווח ארוך של הרכבת התחתית sorbent, באמצעות הכלי מיצוי/uncapping צינור שסופק על-ידי היצרן.
2. לצרף את קצה הצינורית sorbent TD מחורץ השקית דגימה באמצעות צינורות. שים לב כי כיוון צינור חשוב, כמו TD צינורות נועדו יש אוויר זורם בכיוון אחד בלבד, החל מסוף מחורץ. שימו לב כי ההעברה של נשימה מהתיק כדי TD נעשה בתוך שעה של אוסף נשימה.
3. להכניס את הקצה השני של הצינור TD הצנרת, אשר מחובר אל משאבה.
4. . תפעילו את המשאבה ולהגדיר לפעול ב- 100 מ ל/דקה 10 דקות.
5. לפתוח את השסתום על התיק על-ידי הפעלת התרחקותו של בורג כנף המחורצים בצד של ההתאמה כניסת ודחף את הגבעול של השסתום עד פתח כניסת ההתאמה. זה מודגם משלימה איור 4, אשר מדגים נשימה העברת לתוך צינור sorbent TD באמצעות משאבה.
6. . הפעל את המשאבה, אשר יפסיק לאחר 10 דקות של אוסף
7. להסיר את הצינור sorbent TD והדק את הפקקים על גבי שני הקצוות באמצעות הכלי מיצוי/uncapping צינור. כמוסות אחסון לטווח ארוך חייב להיות התהדקו בחוזקה על מנת להבטיח חותם צר-דליפה.
8. מקם מדבקה בצד של כיפה אחת כדי לציין שהצינור שימש. על המדבקה, מציינים מספר זיהוי (ID) לימוד סבלני ותאריך.
9. הצב צינור בתוך שקית פלסטיק קטנה sealable מחדש. צינור sorbent החנות ב 4-5 ° C. הקש את שאר הנשימה מהשק ולמחוק את התיק. להקליט את המחקר החולה מזהה, TD טורפדו מספר סידורי, אוסף היום, זמן של אוסף נשימה, זמן של נשימה, והעברת צריכת המזון (זמן של צריכת המזון לפני נשימה אוסף וארוחות הנצרכת).

4. הסביבתית אוסף

1. לאסוף דגימות אויר בסביבה של החולה מיד לאחר איסוף נשימה.
   1. חבר את השקית ליציאה משאבת לשקע באמצעות צינורות, כמופיע באיור5 משלימה.
   2. לדחוף את הגבעול של השסתום התיק עד פתח כניסת ההתאמה עבור הדגימה.
   3. נעל פתח שסתום על-ידי סיבוב עם כיוון השעון את בורג כנף המחורצים בצד כניסת ההתאמה.
2. . תפעילו את המשאבה ולהגדיר לפעול ב- 100 מ ל/דקה במשך 12 דקות. המשאבה תאסוף 1200 מ של אויר.
3. לאחר האחסון המבוקש נאסף, לשחרר את בורג כנף המחורצים בצד של הים מתאים על ידי הפעלתו התרחקותו ודחף את הגבעול של השסתום עד קרוב ההתאמה מפרץ צר.
4. לנעול את השסתום התיק נסגר על-ידי סיבוב עם כיוון השעון את בורג כנף המחורצים בצד כניסת ההתאמה.
5. ניתוק השקית מהמשאבה.
6. בצע את אותם שלבים כמו בסעיף 3. ההבדל היחיד הוא את אוויר הסביבה ש-voc יועבר, לא אלה של נשימה.

5. מדגם וניתוח נתונים

הערה: היו תנאים לצורך ניתוח של דגימות נשימה ואוויר שתוארה לעיל⁹.

1. לנתח את הנתונים שנאספו, לזהות תרכובות chromatograms. השתמש בתוכנות טיפוסי למצוא ולזהות כל התרכובות שזיהה את המכשיר (איור 3 א). לדוגמה, השתמש תכונה deconvolution כדי לזהות תרכובות. לסנן נתונים תוך שימוש בגורם גודל חלון שמירה של 80, סופרת הייטס המוני מסננים ≥100, וכן מתחם מוחלטת מסנן ≥500.
2. השתמש סטנדרטים כימיים כדי לזהות תרכובות דגימות נשימה ואוויר. לחלץ את האזור שיא יון הבסיס של תרכובות של עניין, כגון איזופרן וβ-pinene (איור 4), ולהשוות את רמות שיכללו חומרים נדיפים, נשימה ואוויר.

תוצאות

במחקר שלנו, נשימה דגימות נאספו מ- 10 ילדים (בן 8-17 שנים) בתהליך ההערכה בבית החולים סנט לואיס לילדים. נשימה דוגמאות ודוגמאות הסביבתית (n = 10) נאספו כמתואר לעיל. דוגמאות נותחו באמצעות גז כרומטוגרפיה פאול זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (QToF-GC-MS) ו- desorption תרמית, כפי שתואר לעיל

Discussion

למרות התקדמות ניכרת בחקר הנשימה בעשור האחרון, נהלים סטנדרטיים עבור דגימה וניתוח של נשימה גז שיכללו חומרים נדיפים נשאר לא מוגדר¹⁰. הסיבות העיקריות על היעדר סטנדרטיזציה כבר המגוון של שיטות איסוף נשימה, אשר יש השפעה ישירה על המגוון כימי שנוצר נוכח דוגמה נתון והבל הפה. נשימה exhalate ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Breath bag	SKC	237-03	These are 3 L bags
Cardboard mouthpiece	A-M systems	161902	0.86" OD, 2.00" L
Large diameter tubing	Cole Parmer	95802-11	Silicone Tubing, 1/4"ID x 5/16"OD,
Long-term storage caps	Markes International	C-CF010	Brass storage cap ¼" & PTFE ferrule, pk 10
Male adapter	Charlotte Pipe	2109	Part 1/3 of breath connector (1/2" Universal part No. 436-005)
Male adapter (made from Teflon)	In-house built		Part 3/3 of breath connector (1/4" ID x 1/2" MIP). This part was specially machined from rods made from virgin Teflon
Pump	SKC	220-1000TC-C	Pocket PumpTouch with Charger
Small diameter tubing	Supelco	20533	Teflon tubing  L × O.D. × I.D. 25 ft × 1/4 in. (6.35 mm) × 0.228 in. (5.8 mm)
Thermal desorption tubes	Markes International	C2-CAXX-5314	Tube, inert, TnxTA/Sulficarb, cond/cap, pk 10
Tube capping/uncapping tool	Markes International	C-CPLOK
Two-way ball valve connector	Homewerks Worldwide	VBV-P40-E3B	Part 2/3 of breath connector (1/2")