شارك تلطيخ الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية

Summary

تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة مع لعب دور محوري في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء. ومع ذلك، لا تزال هناك مسائل تقنية في تصور وقياس كمية الأنسجة الدهنية. نقدم هنا بروتوكولا للتسمية بنجاح والكمية مقارنة كثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف الأنسجة الدهنية.

Abstract

الدراسات التي أجريت مؤخرا قد أبرزت الدور الحاسم للأوعية وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء أثناء تطوير السمنة. ولذلك فمن الضروري وضع طريقة سهلة وفعالة لتوثيق التغيرات الدينامية في الأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف نهجاً إيمونوفلوريسسينت تعديل كفاءة المشترك البقع الأوعية الدموية والألياف العصبية في الأنسجة الدهنية. مقارنة بالأساليب التقليدية ووضعت مؤخرا، نهجنا سهلة نسبيا لمتابعة وأكثر كفاءة في وسم الأوعية الدموية والألياف العصبية ذات الكثافة أعلى وأقل الخلفية. وعلاوة على ذلك، دقة أعلى للصور كذلك يسمح لنا بدقة قياس منطقة السفن، ومقدار المتفرعة، وطول الألياف ببرمجيات المصدر المفتوح. وكدليل على استخدام أسلوب لدينا، نحن إظهار تلك الأنسجة الدهنية براون (BAT) يحتوي على كميات أعلى من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بالانسجة الدهنية البيضاء (وات). كذلك تجد أن وات تحت الجلد (سوات) قد بين حدى، المزيد من الأوعية الدموية والألياف العصبية مقارنة بوات البربخيه (أوت). لدينا أسلوب مما يوفر أداة مفيدة للتحقيق في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء.

Introduction

الأنسجة الدهنية مفتاح الأيضية ووظائف الغدد الصماء¹. أنه يوسع بشكل حيوي أو ينكمش استجابة لمختلف المواد الغذائية تؤكد². الأنسجة النشطة إعادة عرض عملية تتكون من خطوات مسارات الفيزيولوجية متعددة بما في ذلك الأوعية والتليف وتشكيل ميكرونفيرونمينتس التهاب المحلية^2،،من³⁴. قد تؤدي بعض المحفزات المادية، مثل التعرض للبرد وممارسة، تتعاطف مع التنشيط، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى تشكيل السفينة دماء جديدة وتعصيب متعاطفة في الأنسجة الدهنية^5،6. ترتبط هذه العمليات إعادة عرض محكم بالنتائج الاستقلابية الجهازية تشمل حساسية الأنسولين، السمة المميزة للنوع 2 من داء السكري². وهكذا تصور هذه التغيرات الباثولوجية مهم جداً لفهم الوضع الصحي لكل الأنسجة الدهنية.

تولد الأوعية هو عملية تشكيل السفينة دماء جديدة. منذ الأوعية الدموية توفير الأوكسجين والمغذيات والهرمونات وعوامل النمو للأنسجة، تولد الأوعية اعتبرت خطوة رئيسية في الأنسجة الدهنية ليعيد البناء، الذي تم توثيقه مع تقنيات مختلفة^{6،7، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}-ومع ذلك، لا تزال هناك أسئلة حول دقة الصور، وكفاءة إيمونوستينينج، وأساليب القياس الكمي لكثافة السفينة. بالمقارنة مع تشكيل السفينة دماء جديدة، تم التقليل تعصيب في الأنسجة الدهنية لفترة طويلة. ومؤخرا، تسنغ et al. ¹⁴ استخدام متقدمة إينترافيتال اثنين-فوتون مجهرية وأثبتت أن adipocytes تكون محاطة بطبقات من الألياف العصبية¹⁴. ومنذ ذلك الحين، بدأ الباحثون نقدر الدور المحوري تعصيب متعاطفة في التنظيم لفسيولوجيا الأنسجة الدهنية. وبالتالي، من المهم وضع نهج عملية وسهلة تعصيب العصب الدهنية الوثيقة.

هنا، لدينا تقرير أسلوب أمثل لتلطيخ المشترك من الأوعية الدموية والألياف العصبية استناداً إلى أن البروتوكولات السابقة. بهذه الطريقة، يمكننا أن نحقق صور واضحة للأوعية الدموية والألياف العصبية دون ضجيج الخلفية. وعلاوة على ذلك، نحصل على قرار عالية بما يكفي لإجراء قياس كمي للكثافات مع برمجيات المصدر المفتوح. باستخدام هذا النهج الجديد، يمكننا بنجاح مقارنة بالهياكل وكثافة الأوعية الدموية والألياف العصبية في مختلف المستودعات الدهنية.

Protocol

جميع الإجراءات التي تتضمن مواضيع الحيوان عليها من مركز علوم الصحة "الحيوانية رعاية اللجنة من جامعة تكساس" في هيوستن (رقم بروتوكول الحيوان: الائتلاف المناهض للحرب-18-0057).

1-كاشف إعداد

1. 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4): جعل ل 1 لبرنامج تلفزيوني 1 x، حل ز 0.2 من بوكل وز 1.44 غ₂هبو₄، 8 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.24 ز خ₂ص₄ في 800 مل ماء المقطر. ضبط درجة الحموضة 7.4 وملء مع الماء المقطر لتحقيق وحدة تخزين نهائي للأم 1
2. بارافورمالدهيد 1% في برنامج تلفزيوني 1 x (1% منهاج عمل بيجين، wt/المجلد): إضافة إلى تحقيق وحدة تخزين نهائي من 50 مل، مل 3.125% 16 منهاج عمل بيجين (انظر الجدول للمواد) لمل 46.875 لبرنامج تلفزيوني 1 x. يخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
   تنبيه: بارافورمالدهيد السامة. ينبغي أن تنفذ جميع الإجراءات تحت غطاء دخان لتجنب استنشاق والجلد الاتصال.
3. بولي سوربات 0.1% 20 (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني 1 x (1 × ببست، ودرجة الحموضة 7.4، المجلد/المجلد): إضافة إلى تحقيق وحدة تخزين نهائي من 50 مل، 0.05 مل من بولي سوربات مل 20 إلى 49، 95 من برنامج تلفزيوني 1 x. دوامة ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
4. أوكتوكسينول 1%-9 (انظر الجدول للمواد) في برنامج تلفزيوني 1 x (1 × برنامج تلفزيوني-تكساس، ودرجة الحموضة 7.4، المجلد/المجلد): لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 10 مل، إضافة 0.1 مل من أوكتوكسينول-9 إلى 9.9 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. دوامة ومخزن عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
5. أزيد الصوديوم 2% (wt/المجلد): إضافة لإنتاج 10 مل أزيد الصوديوم 2%، 0.2 جم أزيد الصوديوم إلى 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني. يخلط جيدا وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
6. والغليسيرول 90% في برنامج تلفزيوني 1 x (المجلد/المجلد): لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 10 مل، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1 x إلى 9 مل الجلسرين. دوامة وتخزين في درجة حرارة الغرفة (RT) لاستخدامها في وقت لاحق.

2-ديسيكشن الحيوانات وجمع الأنسجة الدهنية

1. استخدام الفئران الذكور C57BL/6J عمرها 6 في الأسبوع. تخدير الفئران مع إيسوفلوراني (4 – 5% لتحريض ثم 1%-2% للصيانة). بمجرد تخديره، إجراء منعكس تو-قرصه لتحديد عمق مخدر، إذا حكمنا من خلال عدم وجود ردود الفعل الدواسة. حالما يتم تخديره عميق من الفئران، تشريح الفئران بعد البروتوكول ك منشور مسبقاً¹⁵.
2. تعقيم مقص حادة والجراحية منطقة الصدر (لا حاجة لحلاقة الشعر). فتح الصدر بقطع الحجاب الحاجز والاضلاع على طول السطح الأفقي مع حجم ~ 2 سم باستخدام مقص غير حادة. المشبك العلم الصدر مع هيموستات وتعكس ذلك بوضع هيموستات على رأسه.
3. إجراء شق صغير في البطين الأيسر (~0.5 سم) مع مقص آيريس. إدراج إبرة نضح مقلوب الزيتون من خلال موقع شق والمشبك تلميح إبرة في المكان مع هيموستات. إرفاق الإبرة حقنه 50 مل تحتوي على بارافورمالدهيد تثبيت الحل (1% منهاج عمل بيجين، ودرجة الحموضة 7.4).
4. فتح اتريوم الحق بقطع المقطع مع مقص آيريس كمنفذ التروية. بدء التروية بلطف ودفع باستمرار حقنه بمعدل التروية قريبة من 10 مل/دقيقة وقف دفع عندما يكون واضحا أي الدم السائل الخروج من المآخذ. وينبغي أن تتطلب العملية برمتها ~ 5 دقيقة.
   تنبيه: تنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء دخان لمنع التسمم من منهاج عمل بيجين.
5. تشريح الأنسجة الدهنية البيضاء والبنى من الفئران. استخدام مقص لقطع عينات الأنسجة إلى قطع صغيرة من قطع حوالي 5 × 5 × 3 مم³. نقل قطع صغيرة مع ملاقط معقمة الأنسجة تضمين أشرطة الكاسيت مع وضع العلامات المناسبة عينات الأنسجة على أشرطة الكاسيت.
6. تزج الأشرطة التضمين يحتوي على عينات الأنسجة إلى الحل التثبيت (1% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x، الرقم الهيدروجيني 7.4) في 4 درجات مئوية عن ح 24-48.
   ملاحظة: الحل التثبيت ووقت التثبيت تختلف استناداً إلى أحجام من الأنسجة^16،،من¹⁷¹⁸.
7. تغسل العينات مع الطازجة 1 × المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني ثلاث مرات (0.5 مل/الغسيل).
   تنبيه: تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء دخان. بارافورمالدهيد النفايات ينبغي التعامل معها بشكل صحيح وفقا لإجراءات التخلص من النفايات الخطرة.
   ملاحظة: ويمكن تخزين الأنسجة في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية لمزيد من المعالجة.

3-جسم الحضانة

1. قطع عينات الأنسجة الثابتة إلى حوالي 2 مم³ مكعبات مع مقص معقم. ل permeabilization، نقل العينات إلى 1.5 مل أنبوب يحتوي على 1 مل 1 × برنامج تلفزيوني-تكساس (1% أوكتوكسينول-9 في برنامج تلفزيوني 1 x، انظر الجدول للمواد، درجة الحموضة 7.4) وتدوير بلطف الأنابيب في RT 1 ح 18 لفة في الدقيقة.
2. بعناية إزالة 1 × برنامج تلفزيوني-تكساس بالطموح. تغسل العينات 3 x بإضافة برنامج تلفزيوني 1 x مباشرة في نفس الأنابيب (لا حاجة لتغيير الأنابيب). أثناء كل غسل، عكس الأنابيب عدة مرات.
3. لحظر، إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت حظر (جدول المواد) للعينات واحتضان في RT ح 2 مع تناوب لطيف.
4. إعداد 0.4 مل من محلول جسم الأولية، تمييع 2 ميكروليتر لمكافحة--اندوموسين (العلامة للأوعية الدموية) ⁵ (1: 200) و 2 ميكروليتر من مكافحة – تيروزين hydroxylase (TH، العلامة للألياف العصبية) ⁵ (1: 200, 1 ميكروغرام/مل) الأجسام المضادة ("الجدول للمواد" للحصول على معلومات جسم) إلى 396 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر. دوامة وتدور وصولاً إلى استرداد وحدة التخزين.
5. للاحتضان جسم الأولى، بعناية إزالة المخزن المؤقت حظر من قطع الأنسجة. إضافة 100 ميكروليتر من الحل الأساسي جسم إعدادها في الخطوة 3.4 في أنابيب واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: قد تختلف الوقت تمييع وحضانة جسم بين الأجسام المضادة المختلفة. من المستحسن إضافة أزيد الصوديوم 0.02 في المائة إلى حل جسم لمنع نمو الميكروبات. إعداد 0.4 مل من محلول جسم الأولية مع أزيد الصوديوم، إضافة 4 ميكروليتر من الأجسام المضادة (ميكروليتر 1 لكل) و 4 ميكروليتر من أزيد الصوديوم 2% إلى 392 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر.
6. جمع الحل جسم الأولية لإعادة الاستخدام بعناية إذا رغبت في ذلك. تغسل العينات مع 1 x PBST (الرقم الهيدروجيني 7.4، 100 ميليلتر/يغسل) ثلاث مرات (30 دقيقة في كل) مع تناوب لطيف 18 لفة في الدقيقة.
7. لإعداد حل جسم الثانوية، ميكروليتر 2 مخفف من فلوروفوري (موجه طول 495 نانومتر) مترافق الماعز المضادة IgG (1: 200) و 2 ميكروليتر من فلوروفوري (موجه طولها 650 nm) مترافق أرنب المضادة IgG (1: 200) (انظر الجدول للمواد) إلى 396 ميكروليتر من المخزن المؤقت لحظر. دوامة وتدور بإيجاز لجمع جميع السائل.
   ملاحظة: حماية العينات من الضوء أثناء الإجراءات التالية.
8. للاحتضان جسم الثانية، إزالة المخزن المؤقت يغسل الماضي من العينات. إضافة 100 ميكروليتر من حل جسم الثانوية في الأنابيب واحتضان في RT ح 2 مع تناوب لطيف 18 لفة في الدقيقة.
9. بعناية إزالة الحل جسم الثانوية. تغسل العينات 3 x 1 x PBST (الرقم الهيدروجيني 7.4، كل 30 دقيقة) مع تناوب لطيف 18 لفة في الدقيقة.
   ملاحظة: عدم إعادة استخدام هذا الحل جسم الثانوية، كما أنها قد تكون ملوثة بكميات ضئيلة من الأجسام المضادة الابتدائي بالانسجة.
10. لإزالة البصرية، تزج العينات في 1 مل والغليسيرول 90% وتبقى العينات عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى تصبح شفافة.
    ملاحظة: مدة الغمر يعتمد على نوع النسيج والحجم. نموذجياً, يحتاج مكعب³ مم 2 من الأنسجة الدهنية البيضاء الحضانة بين عشية وضحاها، بينما نفس حجم البنى احتياجات عينة الأنسجة الدهنية لفترة أطول.
11. التقيد عازل سيليكون إلى الشريحة لإنشاء بئر لتصوير حجم. وبدلاً من ذلك، إرفاق عدة طبقات من شريط شفاف للشرائح وقطع مربع من الوسط إنشاء بئر (الشكل 2).
    ملاحظة: ضبط عمق جيدا لتتناسب مع حجم العينة. ويستخدم في هذا البروتوكول، على عمق 1 ملم جيدا.
12. نقل العينات إلى البئر وملء مع المتوسطة التركيب بعناية (انظر الجدول للمواد). تكمن زلة غطاء على السطح وختم زوايا بكشف الغطاء مع متوسط اللزوجة العالية (انظر الجدول للمواد). واسمحوا تصاعد علاج متوسطة 24 ساعة في RT في الظلام.
    ملاحظة: تأكد من أن ترك أي مسافة بين العينة وكشف الغطاء. تجنب فقاعات تحت بكشف الغطاء. تجنب وضع الضغط المفرط على العينات.

4. الحصول على الصور

1. الحصول على الصور Z-المكدس (الرجوع إلى الخطوات 4.2 إلى 4.7) بهدف 20 x مجهر/برنامج [كنفوكل].
2. بدء تشغيل النظام. انقر فوق علامة التبويب <التكوين> وتنشيط ليزر الأرجون والليزر 633 زناد. انقر فوق علامة التبويب <اكتساب>. في لوحة الخطوط <المرئية> الليزر، حرك مربعات التمرير كثافة المناظرة في اختيار خطوط الليزر 488 نانومتر و 633 نانومتر. في البداية، يمكن تعيين الكثافة إلى 20% – 30%. حدد مرآة ديتشوريك ثلاثية 488/561/633. تنشيط في بمتس بالنقر فوق خانات الاختيار <النشط>، اختيار PMT1 لانبعاث متحمس 488 نانومتر الليزر و PMT3 لأن الليزر 633 نانومتر. تعيين نطاق الطول الموجي إلى 500-550 نيوتن متر ل PMT1 و 650 750nm ل PMT3. حدد بسودوكولور لاستخدامها لعرض الصور بالنقر فوق المستطيل الملون بجوار كل PMT مزدوجة واختيار لون من القائمة المنبثقة.
3. انقر فوق <لايف> التحقق من صورة العينات. استخدم مقبض z-موقف لتحديد ئرة تركيز داخل منطقة س وص للفائدة. ضبط سطوع الصور بضبط كثافة الليزر، وكسب الذكية والإزاحة. لكل قناة الأسفار، نفذ هذا التكيف في إطار وضع العرض <كلوت> (سريعة تبدو أعلى الجدول). انقر فوق الزر <كلوت> للدخول في وضع كلوت، الذي يتم عرض كسل مشبعة باللون الأزرق للمساعدة في تحديد مستوى السطوع المناسبة. انقر مرتين فوق الزر <كلوت> للعودة إلى وضع العرض بسيودوكولور.
   ملاحظة: قد تختلف القيم العددية للإعداد بين كل تجربة.
4. أثناء المسح، أدر ض-موقف عكس اتجاه عقارب الساعة تحريك خطة التركيز على نهاية واحدة من حجم الاهتمام وثم انقر على السهم <نهاية> لتعيين موضع نهاية المسح الضوئي. ثم أدر ض-الموقف اتجاه عقارب الساعة لتحريك الطائرة من التركيز عن طريق العينة إلى الطرف الآخر من حجم الفائدة، وثم انقر على السهم <بدء> لتعيين موضع بدء المسح الضوئي.
   ملاحظة: للمقارنة بين العينات المختلفة، تحديد وحدة التخزين Z نفسها لعينات مختلفة.
5. قم بضبط حجم z-الخطوة 3 ميكرومتر. تغيير جودة الصورة عن طريق تحديد شكل 1024 × 1024، سرعة 100 هرتز، وخط متوسط 2.
6. حدد <ابدأ > الشروع في اقتناء صورة z-المكدس.
7. لإسقاط الحد الأقصى من المكدس الصورة المكتسبة، انقر فوق علامة التبويب <عملية> وثم حدد <3D الإسقاط> <أداة>، وأدخل <الحد الأقصى> في القائمة الأسلوب بدون تغييرات إلى X، Y وتعيين زهير <عتبة> إلى 0. انقر فوق <تطبيق>. سوف تكون مكدسة حدة الأقصى Z-وحدة التخزين في صورة ثنائية الأبعاد التي سيتم عرضها (الشكل 4 أ).

5-تحليل شبكات الألياف العصبية والأوعية الدموية

1. تحليل 2D الصور عن طريق برمجيات المصدر المفتوح (انظر الجدول للمواد)¹⁹
   1. افتح الصور مكدسة في البرنامج. ضبط سفينة القطر وكثافة حتى تحديد كافة هياكل السفن يمكن أن يكون بشكل صحيح (الشكل 4 باء).
   2. حدد تشغيل تحليل وتصدير البيانات وفقا لإرشادات البرنامج.
2. تحليل 3D صور عن طريق البرمجيات المرخصة (انظر الجدول للمواد)
   1. فتح البيانات الخام للصور مع البرنامج. ضبط العتبة ومعلمات أخرى حتى يتم تحديد هياكل السفن في كل طبقة من z-وحدة التخزين بشكل صحيح (أرجع إلى دليل المستخدم لمزيد من التفاصيل في البرنامج) (الشكل 4).
   2. تحليل الأحرف قطاعات مختارة، وتصدير البيانات التالية بتوجيه البرنامج.

النتائج

وجمعت المنطقة البعيدة من الأنسجة الدهنية البيضاء البربخيه (أوت)، ومنطقة وسطى من دورسولومبار تحت الجلد بيضاء الأنسجة الدهنية (سوات)، ومنطقة وسطى من النسيج الدهني البنى إينتيرسكابولار (BAT). يتم الإشارة إلى المواقع لجمع هذه الأنسجة في الشكل 1.

Discussion

إعادة عرض الأنسجة الدهنية يرتبط ارتباطاً مباشرا بالتقلبات الأيض أثناء السمنة التنمية^1،2. الأوعية وتعصيب متعاطفة كلاهما ضروري لعملية إعادة عرض ديناميكية^2،12. ولذلك، وضع نهج المطبقة لتصور الأوعية الدموية الجديدة، فضلا عن الأل...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	805-545-180	Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Lot: 121944
Amira 6.0	Thermo Fisher Scientific		Licensed software
Angio tool	National Institutes of Health		Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody	R&D research system	AF4666	Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody	Pel Freez Biologicals	P40101-150	Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9020-000
Cytoseal 280	Thermo Fisher Scientific	8311-4	High-viscosity medium
Glycerol	Fisher	G33-500
Paraformaldehyde,16%	TED PELLA	170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep	INVITROGEN	P24744	Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965	Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer	Thermo Fisher Scientific	37527X3
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes	Thermo Fisher Scientific	22-272416
Triton Χ-100	Sigma-Aldrich	X100	Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries	VWR	10136-084
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Generic term: Polysorbate 20