שיתוף צביעת כלי הדם, סיבי עצב ברקמת שומן

Summary

היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי לשחק תפקיד מרכזי ב שיפוץ רקמת שומן. עם זאת, נותרו בעיות טכניות ב להמחיש ומדידת באופן כמותי את רקמת שומן. כאן אנו מציגים פרוטוקול בהצלחה תווית ולהשוות באופן כמותי את הצפיפויות של כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן שונות.

Abstract

מחקרים שנעשו לאחרונה הראו את תפקיד קריטי של אנגיוגנזה, העצבוב סימפטית ב רקמת שומן שיפוץ במהלך הפיתוח של השמנת יתר. לפיכך, פיתוח שיטה נוחה ויעילה לתעד את השינויים הדינמיים של רקמת שומן הכרחי. כאן, אנו מתארים בגישה immunofluorescent ששונה זה ביעילות משותפת כתמי כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן. לעומת שיטות מסורתיות שפותח לאחרונה, הגישה שלנו היא יחסית קלה ויעילה יותר תיוג כלי הדם, סיבי עצב עם צפיפות גבוהה יותר ורקע פחות. יתר על כן, הרזולוציה גבוהה יותר של תמונות נוספות מאפשר לנו למדוד במדויק את האזור של ספינות, כמות הסתעפות, ואת אורך הסיבים על ידי תוכנת קוד פתוח. בתור הדגמה באמצעות השיטה שלנו, אנו מראים שאת רקמת שומן חום (בת) מכיל כמויות גבוהות יותר של כלי הדם, סיבי עצב לעומת שומן לבן (וואט). אנחנו עוד יותר מצאו כי בקרב WATs, וואט תת עורית (ימ מ) יש יותר כלי דם, סיבי עצב בהשוואה וואט epididymal (eWAT). השיטה שלנו ובכך מספק כלי שימושי עבור חוקרים רקמת שומן שיפוץ.

Introduction

רקמת שומן בעל מפתח מטבולית ופונקציות אנדוקרינית¹. זה באופן דינמי מתרחבת או מתכווצת בתגובה אחרת מזין מדגיש². הרקמה הפעילה שיפוץ תהליך מורכב מהשלבים מרובים פיזיולוגיים נתיבים/כולל אנגיוגנזה, פיברוזיס, בעיצוב של microenvironments דלקתית מקומית^2,3,4. כמה לגירויים פיזיים, כגון חשיפה קר ופעילות גופנית, עלול לעורר ההפעלה סימפטי, מה שמוביל בסופו של דבר היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי רקמות adipose^5,6. תהליכי שיפוץ אלה קשורות בחוזקה מערכתית תוצאות מטבולית כולל הרגישות לאינסולין, סימן ההיכר של סוג 2 סוכרת². לפיכך, ויזואליזציה של שינויים פתולוגיים אלה חשוב מאוד להבנת מצב תקין של רקמות adipose שלם.

אנגיוגנזה הוא תהליך היווצרות כלי דם חדשים. מאז כלי הדם לספק חמצן, חומרים מזינים, הורמונים, גורמי גדילה לרקמות, אנגיוגנזה נחשב שלב מפתח רקמת שומן שיפוץ, אשר תועד עם טכניקות שונות^{6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. עם זאת, נותרו שאלות על הרזולוציה של תמונות, יעילות של immunostaining, ושיטות על כימות של צפיפות כלי. בהשוואה להיווצרות כלי דם חדשים, העצבוב של רקמת שומן כבר לא העריכה כראוי במשך זמן רב. לאחרונה, Zeng et al. ¹⁴ שימוש מתקדם מיקרוסקופ שני הפוטונים intravital והפגינו adipocytes מוקפים על ידי שכבות של סיבי עצב¹⁴. מאז, החוקרים החלו להעריך את תפקיד מרכזי של אוהדת העצבוב בוויסות של רקמת שומן פיזיולוגיה. לפיכך, פיתוח גישה העצבוב עצב אדיפוז מסמך קל ומעשי חשוב.

כאן, אנו מדווחים על שיטה ממוטב עבור ההכתמה משותפת של כלי הדם, סיבי עצב על סמך הפרוטוקולים הקודמים שלנו. בשיטה זו, ניתן להשיג תמונות ברורות של כלי הדם, סיבי עצב ללא רקע רועש. יתר על כן, אנו משיגים רזולוציה גבוהה מספיק לביצוע מדידה כמותית של צפיפויות עם תוכנת קוד פתוח. באמצעות גישה חדשה זו, בהצלחה ונוכל להשוות את המבנים ואת צפיפות של כלי הדם, סיבי עצב ב מחסני אדיפוז שונים.

Protocol

כל ההליכים המכיל נושאים בעלי חיים אושרו על-ידי החיה רווחה הוועדה של אוניברסיטת טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון (מספר פרוטוקול בעלי חיים: הרפתקאות בטבע-18-0057).

1. מגיב הכנה

1. 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4): כדי להפוך 1 ליטר ל- 1 x PBS, להמיס 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, g 1.44 של Na-₂-HPO-₄ו- 0.24 גר'₂פו ח'₄ ב- 800 מ ל מים מזוקקים. להתאים את ה-pH 7.4 ולאחר מילוי עם מים מזוקקים כדי להשיג נפח סופי של 1 ל'
2. paraformaldehyde 1% ב- PBS 1 x (1% מחברים, wt/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 50 מ ל, להוסיף מ 3.125 ל 16% מחברים (ראה טבלה של חומרים) 46.875 מ של 1 x PBS. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.
   התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. כל ההליכים צריכה להתבצע תחת ברדס fume כדי למנוע שאיפת העור קשר.
3. 0.1% polysorbate 20 (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS 1 x (1 x PBST, pH 7.4, כרך/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 50 מ ל, להוסיף מ 0.05 ל polysorbate מ ל 20 כדי 49.95 של PBS 1 x. מערבולת, חנות ב 4 ° C עד כחודש.
4. 1% octoxynol-9 (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS 1 x (1 x PBS-TX, pH 7.4, כרך/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 10 מ"ל, להוסיף 0.1 מ"ל של octoxynol-9 9.9 מ ל 1 x PBS. מערבולת, חנות ב 4 ° C עד כחודש.
5. אזיד הנתרן 2% (wt/כרך): כדי לייצר 10 מ"ל של אזיד הנתרן 2%, להוסיף 0.2 גר' אזיד הנתרן 10 מ"ל של PBS 1 x. מערבבים היטב ולאחסן ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר.
6. גליצרול 90% ב- PBS 1 x (vol/כרך): כדי להשיג נפח סופי של 10 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של PBS 1 x 9 מ של גליצרול. מערבולת, חנות בטמפרטורת החדר (RT) לשימוש מאוחר יותר.

2. בעלי חיים Ddissection ואוסף רקמת שומן

1. השתמש בת שבוע 6 C57BL/6J עכברים זכרים. עזים ומתנגד העכברים עם איזופלוריין (4% – 5% עבור אינדוקציה ואז 1% – 2% לצורך תחזוקה). ברגע מרדימים, לבצע רפלקס הבוהן-קמצוץ כדי לקבוע את עומק הרדמה, אם לשפוט לפי העדר רפלקסים פדלים. ברגע העכברים הם מרדימים עמוקות, לנתח העכברים בעקבות פרוטוקול שפורסמו בעבר¹⁵.
2. לחטא את המספריים בוטה ואת האזור הכירורגי של בית החזה (אין צורך לגלח את השיער). פתח את התיבה על ידי גזירה את הסרעפת והצלעות לאורך פני השטח לרוחב בגודל של ~ 2 ס מ בעזרת מספריים בוטה. תהדק את הדגל החזה עם עוצר דימום ומשקפים אותה על ידי לשים את עוצר דימום על הראש.
3. עושים חתך קטן לתוך החדר השמאלי (~0.5 ס מ) עם מספריים איריס. המחט של זית שקצהו זלוף דרך החתך, מהדק את מחט במקום עם עוצר דימום. לצרף את המחט מזרק 50 מ ל המכיל paraformaldehyde קיבוע פתרון (1% מחברים, pH 7.4).
4. פתח אטריום ימין על-ידי המקטע גזירה במספריים איריס כמו ששקע זלוף. להתחיל את הטפטוף על ידי בעדינות, ללא הרף דוחף את המזרק בקצב זלוף קרוב 10 מ"ל לדקה תפסיק לדחוף כאשר הנוזל יציאה לשקע היא ברורה של דם. כל התהליך צריך לדרוש ~ 5 דקות.
   התראה: בצע שלבים אלה ברדס fume כדי למנוע רעילות של כדורגלן.
5. לפרק רקמות adipose לבן וחום של העכברים. להשתמש במספריים לפרוץ את דגימות רקמה חתיכות קטנות של חתיכות כ 5 x 5 x 3 מ מ³. העבר של גושים קטנים הפינצטה סטיריליים לתוך הרקמה הטבעה קלטות עם תיוג מתאים של דגימות רקמה על הקלטות.
6. לטבול הקלטות ההטבעה המכיל דגימות רקמה לתוך הפתרון קיבעון (1% מחברים ב- 1 x PBS, pH 7.4) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
   הערה: הפתרון קיבוע והשעה קיבוע משתנים בהתאם בגדלים רקמות^16,17,18.
7. לשטוף את הדגימות עם טרי 1 x מאגר PBS שלוש פעמים (0.5 mL/לשטוף).
   התראה: לבצע שלב זה ברדס fume. הפסולת paraformaldehyde צריך להיות מטופל כראוי על פי הנהלים סילוק פסולת מסוכנת.
   הערה: יכול להיות מאוחסן ברקמות 1 x PBS ב 4 ° C לשם עיבוד נוסף.

3. נוגדן דגירה

1. חותכים את דגימות רקמה קבוע כ 2 מ מ³ קוביות עם המספריים מעוקר. עבור permeabilization, להעביר את הדגימות לתוך צינור 1.5 mL המכיל 1 מ ל 1 x PBS-TX (1% octoxynol-9 ב 1 x PBS, ראה טבלה עבור חומרים, pH 7.4) ולסובב בעדינות את הצינורות-RT עבור h 1-18 סל ד.
2. הסר בזהירות את 1 x PBS-TX על ידי השאיפה. לשטוף את הדגימות 3 x על-ידי הוספת מגניב 1 x ישירות לתוך הצינורות אותו (אין צורך לשנות את הצינורות). במהלך כל כביסה, היפוך הצינורות מספר פעמים.
3. לחסימת, להוסיף 0.5 מ של מאגר חסימה (טבלה של חומרים) הדגימות, תקופת דגירה-RT של 2 h עם סיבוב עדין.
4. כדי להכין 0.4 מ של נוגדן ראשוני פתרון, למהול 2 μL של אנטי - endomucin (דה מרקר של כלי הדם) ⁵ (1:200) ו- 2 μL של אנטי – טירוזין hydroxylase (TH, דה מרקר של סיבי עצב) ⁵ (1:200, µg 1/mL) נוגדנים (טבלה של חומרים למידע נוגדנים) לתוך μL 396 מאגר חסימה. מערבולת, ספין למטה כדי לשחזר אמצעי האחסון.
5. עבור הדגירה נוגדן ראשון, הסר בזהירות המאגר החוסמים חתיכות רקמה. להוסיף 100 μL של נוגדן ראשוני פתרון מוכן בשלב 3.4 לתוך צינורות, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   הערה: דילול נוגדן וזמן הדגירה עשויים להשתנות בין נוגדנים שונים. מומלץ להוסיף 0.02% אזיד הנתרן הפתרון נוגדנים כדי למנוע צמיחת חיידקים. כדי להכין 0.4 מ של נוגדן ראשוני פתרון עם אזיד הנתרן, להוסיף 4 μL של נוגדנים (1 μL של כל אחד) ו- 4 μL של אזיד הנתרן 2% μL 392 מאגר חסימה.
6. בזהירות לאסוף את הפתרון נוגדן ראשוני לשימוש חוזר במידת הצורך. לשטוף את הדגימות עם 1 x PBST (pH 7.4, µL 100/לשטוף) שלוש פעמים (30 דקות כל אחד) עם סיבוב עדין-18 סל ד.
7. הכנת נוגדנים משניים פתרון, שתדללו 2 μL של fluorophore (גל אורך 495 ננומטר) מצומדת עז אנטי איג (1:200), 2 μL של fluorophore (גל באורך 650 ננומטר) מצומדת ארנב אנטי איג (1:200) (ראה טבלה של חומרים) לתוך μL 396 של מאגר חסימה. מערבולת, ספין בקצרה כדי לאסוף את כל הנוזל.
   הערה: להגן על הדגימות אור במהלך ההליכים הבאים.
8. הדגירה הנוגדן השני, להסיר המאגר שטיפת האחרון מדגימות. להוסיף 100 μL של נוגדנים משניים פתרון לתוך צינורות, תקופת דגירה-RT של 2 h עם סיבוב עדין-18 סל ד.
9. הסר בזהירות את הפתרון נוגדנים משניים. לשטוף את הדגימות 3 x 1 x PBST (pH 7.4, 30 דקות) עם סיבוב עדין-18 סל ד.
   הערה: לא חוזר זה פתרון נוגדנים משניים, כמו זה יכול להיות מזוהם עם כמויות זעירות של נוגדנים העיקרי שהביא הרקמות.
10. לאישור אופטי, לטבול את הדגימות ב 1 מ"ל של 90% גליצרול, שומרים את הדגימות ב 4 ° C בחושך עד שהם הופכים לשקופים.
    הערה: משך טבילה תלוי רקמה סוג וגודל. בדרך כלל, קוביה³ 2 מ מ של שומן לבן צריך הדגירה לילה, בעוד באותו גודל חום רקמת שומן מדגם לצרכי יותר.
11. דבקים isolator סיליקון לשקופית כדי ליצור טוב עבור אמצעי הדמיה. לחלופין, לצרף מספר שכבות של השקוף השקופיות ולאחר לגזור ריבוע באמצע כדי ליצור באר (איור 2).
    הערה: להתאים את עומק טוב כדי להתאים לגודל המדגם. ב פרוטוקול זה, משמש לעומק טוב 1 מ מ.
12. בזהירות להעביר את הדגימות לתוך הבאר ולמלא אותה עם המדיום הרכבה (ראה טבלה של חומרים). לשים מכסה על פני השטח. ואטמו את הפינות של תגית כיסוי גבוה צמיגות בינונית (ראה טבלה של חומרים). לתת את התרופה הרכבה בינונית במשך 24 שעות ביממה במלון RT בחשכה.
    הערה: ודא כי אין מקום שנשאר בין מדגם לבין מכסה. להימנע בועות תחת תגית כיסוי. הימנע מהנחת לחץ רב מדי על הדגימות.

4. ייבוא תמונות

1. לרכוש תמונות Z-מחסנית (עיין צעדים 4.2 – 4.7), שמטרתה 20 x מיקרוסקופ קונפוקלי/תוכנה.
2. התחל את המערכת. לחץ על הכרטיסיה <תצורה> ולהפעיל על לייזר ארגון ועל הנה 633 לייזר. לחץ על הכרטיסיה <רכוש>. בחלונית קווי לייזר ' <גלוי>, הזז את המחוונים בעוצמה המתאימה כדי לבחור את קווי לייזר של 488 ננומטר, 633 ננומטר. בתחילה, עוצמות ניתן להגדיר עד 20% – 30%. בחר את המראה dichoric טריפל 488/561/633. הפעל את PMTs על ידי לחיצה על <פעיל> בתיבות הסימון, בחירת PMT1 עבור הפליטה נרגש על ידי 488 ננומטר לייזר PMT3 בשביל זה לייזר nm 633. הגדר טווח אורך הגל 500-550 ננומטר עבור PMT1 ו- 650-750nm עבור PMT3. בחר את psudocolor כדי לשמש עבור תצוגת תמונה כפול לחיצה על המלבן צבעוניים לצד כל PMT ובחירה צבע מהתפריט הנפתח.
3. לחץ על <Live> כדי לבדוק את התמונה של דגימות. השתמש את כפתור z-מיקום כדי לבחור מטוס של מוקד בתוך האזור XY עניין. להתאים את הבהירות של התמונות על-ידי כיוונון עוצמת לייזר, חכם ורווח היסט. בכל אחד מהערוצים פלורסצנטיות, לבצע התאמה זו תחת מצב התצוגה <QLUT> (מהירה נראה את הטבלה). לחץ על לחצן <QLUT> כדי להיכנס למצב QLUT, שבה פיקסלים רווי מוצגים בכחול כדי לסייע ההגדרה של רמת הבהירות המתאים. לחץ פעמיים על לחצן <QLUT> כדי לחזור מצב התצוגה מדומה.
   הערה: ערכים מספריים של הגדרת עשויים להשתנות בין כל ניסוי.
4. בזמן הסריקה, סובב את כפתור Z-מיקום השעון כדי להעביר את התוכנית של המוקד קצה אחד של אמצעי האחסון של עניין ולאחר מכן לחץ על החץ <סוף> כדי להגדיר את המיקום סיום הסריקה. לאחר מכן סובב את כפתור Z-מיקום השעון כדי לעבור למישור המוקד דרך הדגימה הקצה השני של אמצעי האחסון של עניין ולאחר מכן לחץ על החץ <בגין> כדי להגדיר את המיקום בגין סריקה.
   הערה: עבור ההשוואה בין מדגמים שונים, להגדיר באותו Z-אמצעי אחסון עבור מדגמים שונים.
5. להתאים את גודל z-צעד 3 מיקרומטר. לשנות איכות התמונה על-ידי בחירת תבנית של 1024 x 1024, מהירות של 100 הרץ, קו ממוצע של 2.
6. בחר <התחל > ליזום את רכישת התמונה z-מחסנית.
7. עבור תמונה מוקרנת מרבי של הערימה התמונה נרכשת, לחץ על הכרטיסיה <תהליך> ואז <כלי>, בחר <3D הקרנה> הזן <המרבי> ברשימה שיטה ללא שינויים ל- X, Y וערכת צ <הסף> 0. לחץ על <להחיל>. העוצמה המקסימלית של Z-אמצעי האחסון יערמו תמונה דו-ממדית, אשר יוצגו (איור 4A).

5. ניתוח של כלי הדם ושל רשתות סיבי עצב

1. ניתוח של 2D תמונות באמצעות תוכנת קוד פתוח (ראה טבלה של חומרים)¹⁹
   1. פתח את תמונות מוערמות בתוכנה. להתאים את כלי השיט קוטר ועוצמה עד לבחירת כל המבנים קיבול יכול להיות כראוי (איור 4B).
   2. בחרו להפעיל ניתוח , לייצא את הנתונים בעקבות הנחיה של התוכנה.
2. ניתוח של 3D תמונות באמצעות התוכנה מורשה (ראה טבלה של חומרים)
   1. פתח את הנתונים הגולמיים של תמונות עם התוכנה. התאם את הסף ופרמטרים אחרים עד המבנים כלי בכל שכבה של z-אמצעי האחסון נבחרו כראוי (עיין במדריך למשתמש לקבלת פרטים בתוכנה) (איור 4C).
   2. לנתח את התווים שנבחרו מקטעי ולייצא את הנתונים בעקבות ההדרכה של התוכנה.

תוצאות

אזור דיסטלי של רקמת שומן לבן epididymal (eWAT), אזור המדיאלי dorsolumbar לבן רקמת השומן התת עורית (ימ מ) ואזור המדיאלי של רקמת שומן חום interscapular (בת) נאספו. המיקומים לאיסוף רקמות אלו מסומנים באיור1.

Discussion

רקמת שומן שיפוץ מקושר ישירות dysregulation מטבולית במהלך השמנה פיתוח^1,2. אנגיוגנזה העצבוב אוהדת הן חיוניות דינמי שיפוץ תהליך^2,12. לפיכך, פיתוח גישה ישימה להמחיש את כלי דם חדשים, כמו גם סיבי עצב הן חשיבות רבה. שיטות קודמות דווחו לתיעוד ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	805-545-180	Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Lot: 121944
Amira 6.0	Thermo Fisher Scientific		Licensed software
Angio tool	National Institutes of Health		Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody	R&D research system	AF4666	Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody	Pel Freez Biologicals	P40101-150	Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9020-000
Cytoseal 280	Thermo Fisher Scientific	8311-4	High-viscosity medium
Glycerol	Fisher	G33-500
Paraformaldehyde,16%	TED PELLA	170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep	INVITROGEN	P24744	Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965	Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer	Thermo Fisher Scientific	37527X3
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes	Thermo Fisher Scientific	22-272416
Triton Χ-100	Sigma-Aldrich	X100	Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries	VWR	10136-084
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Generic term: Polysorbate 20