Kan damarları ve sinir lifleri yağ dokusu içinde Co boyama

Özet

Yeni kan damarı oluşumu ve sempatik innervasyon yağ dokusu remodeling içinde önemli rol oynarlar. Ancak, görselleştirme ve kantitatif yağ dokusu ölçme teknik sorunlar kalır. Burada başarılı bir şekilde etiketleyin ve kantitatif kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ dokularında yoğunlukları karşılaştırmak için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Son yıllarda yapılan çalışmalarda kritik rolü anjiogenez ve yağ dokusu obezite gelişimi sırasında remodeling içinde sempatik innervasyon sermiştir. Bu nedenle, yağ dokusu dinamik değişiklikleri belgelemek için kolay ve etkin bir yöntem geliştirilmesi gereklidir. Burada, verimli bir şekilde kan damarları ve sinir lifleri yağ dokularında Co lekeleri değiştirilmiş bir immünfloresan yaklaşım tarif. Geleneksel ve son zamanlarda geliştirilen yöntemlerine göre bizim nispeten kolay takip etmek ve kan damarları ve sinir lifleri daha yüksek yoğunlukları ile ve daha az arka plan etiketleme daha etkili bir yaklaşımdır. Ayrıca, daha yüksek çözünürlük görüntülerin daha fazla doğru açık kaynak yazılım tarafından alan kaplar, dallanma miktarı ve elyaf uzunluğu ölçmek için bize izin verir. Bizim yöntemini kullanarak bir gösteri gösterdiğimiz o kahverengi yağ dokusundan (BAT) kan damarları ve sinir lifleri beyaz Yağ dokusundan (WAT) göre daha yüksek miktarda içerir. WATs arasında daha fazla kan damarları ve sinir lifleri epididimal WAT (eWAT) göre subkutan WAT (sWAT) olduğunu bulmak daha ayrıntılı. Bizim yöntem böylece yağ dokusu remodeling soruşturma için yararlı bir araç sağlar.

Giriş

Yağ dokusu tuşu metabolik ve endokrin¹çalışır. Dinamik olarak genişletir veya daraltır yanıt olarak farklı besin²vurguluyor. Süreç modelleme etkin doku birden çok fizyolojik yolları/adımlardan oluşur anjiogenezi, fibrozis ve yerel inflamatuar microenvironments^2,3,4şekillendirme dahil. Soğuk pozlama ve egzersiz, gibi bazı fiziksel uyaranlara sonuçta yeni kan damarı oluşumu ve yağ dokuları^5,6sempatik innervasyon neden sempatik aktivasyon tetikleyebilir. Bu tadilat işlemleri sistemik metabolik sonuçları insülin duyarlılık, tip 2 diyabet²damgasını dahil olmak için sıkıca bağlıdır. Böylece, görsel olarak bu patolojik değişiklikler tüm yağ dokuları sağlıklı durumunu anlamak için çok önemlidir.

Angiogenez yeni kan damarı oluşumu sürecidir. Oksijen, besin, hormonlar ve büyüme faktörleri dokulara kan damarları sağlar beri angiogenez belgelenen farklı teknikler^6,7ile^, yağ dokusu remodeling içinde önemli bir adım olarak kabul edilmiştir ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. ancak, görüntülerin çözünürlüğünü, immunostaining ve damar yoğunluğu miktar için yöntemleri hakkında sorular kalır. Yeni kan damarı oluşumu için karşılaştırıldığında, innervasyon yağ dokusu içinde uzun bir süre için hafife. Son zamanlarda, Tang ve ark. kullanılan ¹⁴ intravital iki fotonlu mikroskobu gelişmiş ve adipositler tarafından sinir lifleri¹⁴katmanları çevrilidir gösterdi. O zamandan beri araştırmacılar sempatik innervasyon yağ dokusu Fizyoloji Yönetmelikte önemli rolü takdir başlamıştır. Bu nedenle, belge adipose sinir innervasyon için kolay ve pratik bir yaklaşım geliştirilmesi önemlidir.

Burada, kan damarları ve sinir lifleri bizim önceki protokollerine dayalı işbirliği boyama için en iyi duruma getirilmiş bir yöntem raporu. Bu yöntemle, kan damarları ve sinir lifleri gürültülü arka plan olmadan net görüntüler elde edebilirsiniz. Ayrıca, açık kaynak yazılım ile yoğunlukları nicel ölçüm gerçekleştirmek için yeterince yüksek bir çözünürlük elde edilir. Bu yeni yaklaşım kullanarak, biz başarıyla yapıları ve kan damarları ve sinir lifleri farklı yağ depoları içinde yoğunlukları karşılaştırabilirsiniz.

Protokol

Tüm yordamları hayvan konular içeren hayvan refahı Komitesi, Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Houston tarafından onaylanmıştır (hayvan iletişim kuralı numarası: AWC-18-0057).

1. reaktif hazırlık

1. 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS, pH 7,4) x: 1 x PBS 1 litre yapmak, NaCl, 8 g, KCl 0.2 g, Na₂HPO₄1,44 g ve KH₂PO₄ 800 mL distile su içinde 0,24 g geçiyoruz. PH 7,4 ve 1 L. son hacmi elde etmek için distile su ile doldurun ayarlayın
2. 1 x PBS (%1 PFA, wt/vol) % 1'paraformaldehyde: 50 mL son hacmi elde etmek için % 16 3.125 mL ekleyin PFA ( Tablo malzemelerigörmek) 46.875 mL 1 x PBS için. İyice karıştırın ve daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın.
   Uyarı: Paraformaldehyde zehirlidir. Tüm yordamları ve inhalasyon önlemek için kişinin cilt duman başlık altında yapılmalıdır.
3. 1 x PBS (x PBST, pH 7.4, vol/vol 1) % 0,1 polysorbate ( malzemelerin tabloyabakınız) 20: 50 mL son hacmi elde etmek için polysorbate 20-49,95 mL 1 x PBS 0.05 mL ekleyin. Girdap ve mağaza 4 ° c ilâ 1 ay için.
4. %1 octoxynol-9 ( Tablo malzemelerigörmek) 1 x PBS (x PBS-TX, pH 7.4, vol/vol 1) içinde: 10 mL son hacmi elde etmek için 1 x PBS için 9.9 mL 0.1 mL octoxynol-9 ekleyin. Girdap ve mağaza 4 ° c ilâ 1 ay için.
5. %2 Sodyum azid (wt/vol): 10 mL % 2 Sodyum azid üretmek için 1 x PBS için 10 mL sodyum azid 0.2 g ekleyin. İyice karıştırın ve daha sonra kullanmak için 4 ° C'de depolayın.
6. 1 x PBS (vol/vol) % 90 gliserol: 10 mL son hacmi elde etmek için 1 mL 1 x PBS 9 mL gliserol ekleyin. Girdap ve mağaza oda sıcaklığında (RT) daha sonra kullanmak için.

2. hayvan Ddissection ve yağ dokusu koleksiyonu

1. 6-hafta-yaşlı C57BL/6J erkek fare kullanın. Fareler isoflurane (% 4-%5 indüksiyon için sonra % 1-%2 için bakım) ile anestezi. Bir kez anestezi, pedal refleksleri eksikliğinden yargılamak anestezik derinlik belirlemek için bir ayak parmağı-çimdik refleks gerçekleştirin. Fareler derin anestezi sonra daha önce yayımlanmış¹⁵protokol sonrası fareler incelemek.
2. Künt makas ve göğüs (saç tıraş gerek yok) cerrahi alan sterilize. Göğüs diyafram ve kaburga ~ 2 cm künt makas kullanarak büyüklüğü ile lateral yüzeyi boyunca keserek açın. Göğüs bayrağı hemostat ile kelepçe ve hemostat kafasına koyarak yansıtmaktadır.
3. Küçük bir insizyon attım sol ventrikül (~0.5 cm) Iris makasla olun. Kesi sitesi aracılığıyla bir perfüzyon zeytin uçlu iğne yerleştirin ve iğne ucu hemostat ile yerde kelepçe. İğne paraformaldehyde fiksasyon solüsyon (%1 PFA, pH 7,4) içeren bir 50 mL şırınga iliştirin.
4. Sağ atrium bölümü kesim tarafından Iris makasla perfüzyon çıkış gibi açın. Perfüzyon tarafından hafifçe başlatın ve sürekli şırınga yakın bir perfüzyon oranda iterek 10 mL/dak çıkış çıkmadan sıvı herhangi bir kan açık olduğunda İtmeyi bırak. Tüm süreç ~ 5 dk istemeniz gerekir.
   Uyarı: Toksisite PFA gelen önlemek için bir duman başlık altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
5. Fareler beyaz ve kahverengi yağ dokulardan incelemek. Doku örnekleri parçalar yaklaşık 5 x 5 x 3 mm³küçük parçalar halinde zarar için makas kullanın. Küçük parçalar sterilize cımbızla kaset kaset üzerinde doku örnekleri uygun etiketleme ile gömme doku içine aktarın.
6. Doku örnekleri fiksasyon solüsyon içeren gömme kaset bırakın (%1 1 x PBS, pH 7.4 PFA) için 24-48 h 4 ° C'de.
   Not: Fiksasyon çözüm ve fiksasyon saat boyutları doku^16,17,18bağlı olarak değişir.
7. Taze 1 PBS arabellek üç x örnekleriyle (0.5 mL/yıkama) yıkayın.
   Uyarı: Bir duman başlık altında bu adımı gerçekleştirin. Paraformaldehyde atık düzgün tehlikeli atık bertaraf yordamlar göre ele alınmalıdır.
   Not: Dokular 1 x PBS 4 ° C'de için daha fazla alay depolanabilir.

3. antikor kuluçka

1. Sabit doku örnekleri steril makasla yaklaşık 2 mm³ küpler halinde kesilmiş. Permeabilization için örnekleri 1 mL 1 içeren bir 1,5 mL tüp içine aktarmak PBS-TX x (%1 octoxynol-9 1 x PBS,'tabloya tablo için malzemeler, pH 7.4 bakınız) ve RT, tüpler 18 rpm'de 1 h için yavaşça döndürün.
2. Dikkatli bir şekilde çıkarın 1 x PBS-TX aspirasyon tarafından. Yıkama örnekleri 3 x 1 x PBS doğrudan aynı tüpler içine (tüpler değiştirmek gerek yok) ekleyerek. Her yıkama sırasında birkaç kez tüpler tersine çevirin.
3. Engelleme, engelleme arabellek (Tablo reçetesi) 0.5 mL örnekleri için ekleyin ve 2 h nazik döndürme için RT kuluçkaya.
4. Anti - endomucin (kan damarlarının marker) ⁵ (1: 200), 2 μL ve anti, 2 μL 0.4 mL birincil antikor çözeltisi hazırlamak için seyreltik — tirozin hidroksilaz (TH, sinir lifleri marker) ⁵ (1: 200, 1 µg/mL) antikorları (malzemeler tablo antikor bilgi için) 396 μL engelleme arabelleği içine. Girdap ve spin recover birimin aşağı.
5. İlk antikor kuluçka için doku parçaları engelleme arabellek dikkatli bir şekilde çıkarın. Birincil antikor çözüm adım 3.4 tüpler içine hazırlanan 100 μL ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya.
   Not: Antikor seyreltme ve kuluçka süresi farklı antikorlar arasında değişebilir. Bu %0.02 sodyum azid mikrobiyal büyüme önlemek için antikor çözüme eklemek için tavsiye edilir. 0.4 mL sodyum azid ile birincil antikor çözeltisi hazırlamak için 4 μL antikor (her 1 μL) ve % 2 Sodyum azid 4 μL engelleme arabellek 392 μL ekleyin.
6. Dikkatle birincil antikor çözüm kullanılmak istenirse toplamak. 1 örnekleriyle yıkama x PBST (pH 7.4, 100 µL/yıkama) üç kez (30 dk her) 18 devirde nazik döndürme.
7. İkincil antikor çözüm, fluorophore (dalga uzunluğu 495 nm) seyreltik 2 μL hazırlanması Birleşik Anti-keçi IgG (1: 200) ve fluorophore (dalga uzunluğu 650 nm) 2 μL Birleşik Anti-tavşan IgG (1: 200) ( Tablo malzemelerigörmek) 396 μL içine engelleme arabellek. Girdap ve kısaca tüm sıvı toplamak için döndür.
   Not: Örnekler aşağıdaki işlemler sırasında ışıktan korumak.
8. İkinci antikor kuluçka için son yıkama arabellek örnekleri kaldırın. İkincil antikor çözeltinin 100 μL tüpler içine ekleyin ve 18 devirde nazik döndürme için 2 h RT kuluçkaya.
9. İkincil antikor çözüm dikkatli bir şekilde çıkarın. Yıkama örnekleri 3 x 1 x PBST (pH 7.4, 30 dk) 18 devirde nazik döndürme.
   Not: Birincil antikorlar tarafından dokulara getirdi eser miktarda kontamine gibi bu ikincil antikor çözüm yeniden değil.
10. Optik geçiş izni için 1 mL % 90 gliserol örneklerinde bırakın ve saydam olana örnekleri 4 ° C'de karanlıkta tut.
    Not: Daldırma süresi doku türü ve boyutu bağlıdır. Genellikle, bir 2 mm³ küp beyaz yağ dokusunun daha uzun aynı boyutu kahverengi yağ dokusu örnek ihtiyaçları ise gecede kuluçka ihtiyacı var.
11. Birim görüntüleme için iyi oluşturmak için silikon İzolatör slayt için uygun. Alternatif olarak, şeffaf bant birkaç kat slaytlara eklemek ve bir kare şeklinde bir kesik orta dışında bir şey oluşturmak için (Şekil 2).
    Not: Kuyu derinliği örnek boyutuna sığacak şekilde ayarlayın. Bu protokol için 1 mm kuyu derinliği kullanılır.
12. Dikkatle örnekleri kuyunun içine aktarmak ve montaj orta ile doldurun ( Tablo malzemelerigörmek). Bir kapak kayma yüzeyi üzerinde yatıyordu ve köşeleri ile yüksek viskozite orta kapak fişinin mühür ( Tablo malzemelerigörmek). RT 24 h montaj orta tedavisini karanlıkta izin.
    Not: Boşluk örnek ve kapak notu arasında kaldı emin olun. Kabarcıklar kapak notu altında kaçının. Aşırı baskı örnekleri üzerinde yerleştirmekten kaçının.

4. resim alma

1. Z-yığın görüntülerle (adımlar 4.2-4.7 bakın) bir confocal mikroskop/yazılım 20 x amacı elde etmek.
2. Sistemi başlatmak. <Yapılandırma> sekmesini ve argon lazer ve Helene 633 lazer etkinleştirin. <Edinme> sekmesini tıklatın. <Visible> lazer çizgileri panelinde karşılık gelen yoğunluk kaydırıcıları 488 lazer satırları seçmek için yukarı taşımak nm ve 633 nm. Başlangıçta, yoğunluklarda %20-%30 için ayarlanabilir. 488/561/633 Üçlü dichoric mirror seçeneini seçin. PMTs PMT1, 633 nm lazer için heyecanlı 488 nm lazer ve PMT3 tarafından emisyon için seçtiğiniz <etkin> onay kutularını tıklatarak etkinleştirin. Dalga boyu aralığı 500-550 nm için PMT1 ve 650-750nm için PMT3 için ayarlayın. Çift renkli dikdörtgen her Devresel_ödeme yanında tıklatın ve açılır menüden bir renk seçme imge göstermek için kullanılacak psudocolor seçin.
3. < Örnekleri görüntüsünü denetlemek içinLiveüzerinde >'yı tıklatın. Z-pozisyon topuzu uçağa odak ilgi XY bölgedeki seçmek için kullanın. Lazer yoğunluğu, akıllı kazanç ve mahsup hesabı ayarlama tarafından görüntü parlaklığını ayarlayın. Her floresans kanal için bu ayarlama <QLUT> (hızlı bakmak kadar tablo) görüntü modu altında gerçekleştirin. Doymuş piksel mavi uygun parlaklık seviyesi ayarı yardım için görüntülendiği QLUT moduna girmek için <QLUT> düğmesini tıklayın. Yalancı görüntü moduna geri dönmek için iki kez <QLUT> düğmesini tıklayın.
   Not: Sayısal değerleri ayarının her deney arasında değişiklik gösterebilir.
4. Tarama sırasında Z-pozisyon topuzu faiz hacmi tek bir amaç için odak planı taşıyın ve sonra tıklatın tarama bitiş konumunu ayarlamak için <son> ok ucu üzerinde için saat yönünün tersine çevirmek. Sonra Z-pozisyon topuzu numune odağı uçak birimin ilgi diğer sonuna gitmek için saat yönü doğrultusunda çevirin ve ardından <Başlangıç> ok ucu üzerinde tarama başlangıç konumunu ayarlamak için tıklatın.
   Not: Farklı örnekleri arasında karşılaştırma için farklı örnekleri için aynı Z hacimli tanımlayın.
5. 3 µm değişiklik 1024 x 1024 bir biçim seçerek görüntü kalitesi, hızı 100 Hz ve satır ortalama 2 z-adım boyuta ayarlayın.
6. Seçin <başlamak > z-yığın resim alma başlatmak için.
7. Maksimum projeksiyon elde edilen görüntü yığını için <işlem> sekmesini ve sonra <Aracı>, <3D projeksiyon> seçin ve <Maksimum> değişiklik yapılmadan Yöntemi listesinde X, girin. Y ve Z. Set <Eşik> 0. <Uygulamaüzerinde >'ı tıklatın. Z biriminin maksimum yoğunluk (Şekil 4A) gösterilecek bir 2B görüntü yığılmış.

5. damar ve sinir lifi Analizi iletişim

1. Analiz 2B görüntüleri açık kaynak yazılımı üzerinden (bakınız tablo reçetesi)¹⁹
   1. Yığın görüntü yazılımı açın. Seçilen tüm damar yapıları düzgün olabilir (Şekil 4B) kadar damar çapı ve yoğunluğunu ayarlayın.
   2. Analizi Çalıştır ' ı seçin ve rehberlik yazılım aşağıdaki veri verin.
2. Analiz 3D görüntüleri lisanslı yazılımı üzerinden (tablo malzemeleri görmek)
   1. Görüntülerin ham veri ile yazılımını açın. Her katman z biriminin gemi yapılarda düzgün seçilene dek eşik ve diğer parametreleri ayarlayın (Ayrıntılar için yazılım için Kullanıcı kılavuzuna bakın) (Şekil 4 c).
   2. Seçili parçaları karakter analiz ve yazılım rehberlik takip veri verme.

Sonuçlar

Distal bölge epididimal beyaz yağ doku (eWAT), medial dorsolumbar subkutan beyaz Yağ dokusundan (sWAT) bölgesinin ve medial interscapular kahverengi yağ dokusundan (BAT) bölgenin toplanmıştır. Bu doku toplamak için konumları Şekil 1' de belirtilmiştir.

Şekil 1: anatomi subkutan beyaz Yağ dokusu...

Tartışmalar

Yağ dokusu remodeling için metabolik bozukluk doğrudan obezite geliştirme^1,2sırasında bağlıdır. Angiogenez ve sempatik innervasyon dinamik remodeling işlemi^2,12için temel etkilenebilir. Bu nedenle, yeni kan damarları gibi sinir lifleri görselleştirmek için uygun bir yaklaşım geliştirilmesi büyük önemi vardır. Önceki yöntemler angiogenez yağ dokusu içinde belgelenmesi için rapor ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	805-545-180	Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Lot: 121944
Amira 6.0	Thermo Fisher Scientific		Licensed software
Angio tool	National Institutes of Health		Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody	R&D research system	AF4666	Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody	Pel Freez Biologicals	P40101-150	Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9020-000
Cytoseal 280	Thermo Fisher Scientific	8311-4	High-viscosity medium
Glycerol	Fisher	G33-500
Paraformaldehyde,16%	TED PELLA	170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep	INVITROGEN	P24744	Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965	Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer	Thermo Fisher Scientific	37527X3
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes	Thermo Fisher Scientific	22-272416
Triton Χ-100	Sigma-Aldrich	X100	Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries	VWR	10136-084
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Generic term: Polysorbate 20