JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Формирование новой крови судна и симпатической иннервации играть решающую роль в реконструкции жировой ткани. Однако остаются технические вопросы в визуализации и количественном измерении жировой ткани. Здесь мы представляем протокол успешно ярлык и количественно сравнить плотностью кровеносных сосудов и нервных волокон в различных жировых тканях.

Аннотация

Недавние исследования выявили важную роль по ангиогенез и симпатической иннервации в жировой ткани реконструкции в ходе развития ожирения. Таким образом необходим простой и эффективный метод для документирования динамичные изменения в жировой ткани. Здесь мы описываем модифицированных immunofluorescent подход, который эффективно совместно пятна кровеносных сосудов и нервных волокон в жировых тканях. Наш подход по сравнению с традиционными и недавно разработанных методов, и относительно легко следовать и более эффективным в маркировке кровеносных сосудов и нервных волокон с более высокой плотностью и меньше фона. Кроме того более высокое разрешение изображений далее позволяет нам точно измерить площадь судов, количество ветвления, а длина волокон с открытым исходным кодом. В качестве демонстрации с помощью нашего метода мы покажем что коричневая жировая ткань (BAT) содержит большее количество кровеносных сосудов и нервных волокон, по сравнению с белой жировой ткани (Ват). Мы также найти, что среди WATs, подкожной Ват (спецназ) имеет более кровеносных сосудов и нервных волокон, по сравнению с эпидидимальных Ват (eWAT). Наш метод таким образом служат полезным инструментом для изучения ремоделирования жировой ткани.

Введение

Жировая ткань имеет ключ, метаболические и эндокринные функции1. Она динамически расширяет или сжимает в ответ на различные питательные подчеркивает2. Активный ткани, remodeling процесс состоит из нескольких физиологические пути/шаги включая ангиогенеза, фиброза и формирование местных воспалительных микросреды2,3,4. Некоторые физические раздражители, как холодная воздействием и упражнения, могут вызвать Симпатическая активация, которая в конечном итоге приводит к образованию новой крови судна и симпатической иннервации в жировых тканях5,6. Эти процессы ремоделирования, тесно связаны с системных метаболических исходов, включая чувствительность инсулина, отличительной чертой 2 диабета типа2. Таким образом визуализация этих патологических изменений очень важно для понимания здоровое состояние всей жировой ткани.

Ангиогенез-это процесс формирования новой крови судна. Так как кровеносные сосуды обеспечивают кислорода, питательных веществ, гормонов и факторов роста тканей, ангиогенез считается ключевым шагом в жировой ткани реконструкции, которая документально с различными методами6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Однако, остаются вопросы о разрешение изображений, эффективности иммуноокрашивания и методы для количественного определения плотности судна. По сравнению с корабля Нью кроветворения, долгое время была недооценена иннервации в жировой ткани. Недавно Цзэн и др. 14 используется расширенный прижизненной микроскопии двух фотонов и продемонстрировал, что адипоцитов окружены слоя нервных волокон14. С тех пор исследователи начали ценить ключевую роль симпатической иннервации в регуляции физиологии жировой ткани. Таким образом развитие простой и практический подход к документ жировой нервной иннервации имеет важное значение.

Здесь мы приводим оптимизированный метод для совместного окрашивания кровеносных сосудов и нервных волокон, основанный на наших предыдущих протоколов. С помощью этого метода мы можем добиться четких изображений кровеносных сосудов и нервных волокон без шумной фона. Кроме того мы получаем резолюции, что является достаточно высоким для выполнения количественных измерений плотности с открытым исходным кодом. С помощью этого нового подхода, мы успешно можно сравнить структуры и плотностью кровеносных сосудов и нервных волокон в различных жировых депо.

протокол

Все процедуры, содержащие животных темы были одобрены центра науки здоровья животного благосостояния Комитет из университета Техаса в Хьюстоне (животных протокол номер: AWC-18-0057).

1. Реагент подготовка

  1. 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4): сделать 1 Л ПБС, распустить 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4и 0,24 г х2PO4 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 и заполнить с дистиллированной водой для достижения окончательного объемом 1 л.
  2. 1% параформальдегида в однократном ПБС (1% PFA, wt/vol): для достижения окончательный объем 50 мл, добавить 3,125 мл 16% PFA (см. Таблицу материалы) до 46,875 мл ПБС. Хорошо перемешать и хранить при 4 ° C для последующего использования.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Параформальдегида является токсичным. Все процедуры должны осуществляться под зонт избегать вдыхания и контакт с кожей.
  3. Полисорбат 20 (см. таблицу материалов) 0,1% в однократном ПБС (1 x PBST, рН 7,4, vol/vol): для достижения окончательный объем 50 мл, добавляют 0,05 мл Полисорбат 20 для 49.95 мл ПБС. Вортекс и хранить при 4 ° C до 1 месяца.
  4. 1% octoxynol-9 (см. Таблицу материалы) в однократном ПБС (1 x PBS-TX, рН 7,4, vol/vol): для достижения окончательный объём 10 мл, добавить 0,1 мл octoxynol-9 до 9,9 мл ПБС. Вортекс и хранить при 4 ° C до 1 месяца.
  5. Азид натрия 2% (wt/vol): производить 10 мл 2% Азид натрия, добавить азид натрия 0,2 г в 10 мл ПБС. Хорошо перемешать и хранить при 4 ° C для последующего использования.
  6. 90% глицерина в однократном ПБС (vol/vol): для достижения окончательный объём 10 мл, добавить 1 мл ПБС 9 мл глицерина. Вортекс и хранить при комнатной температуре (RT) для последующего использования.

2. животных Ddissection и жировой ткани коллекции

  1. Использование 6 week-old мышей C57BL/6J-самцов. Анестезировать мышей с изофлюрановая (4 – 5% для индукции затем 1%-2% за обслуживание). Как только под наркозом, выполняют мыс щепотка рефлекс для определения глубины анестезии, судя по отсутствием педалей рефлексов. Как только мышей глубоко наркоз, вскрыть мышей после протокол как ранее опубликованные15.
  2. Стерилизуйте тупыми ножницами и хирургические области груди (не нужно брить волосы). Откройте сундук путем сокращения диафрагмы и ребра вдоль боковой поверхности с размером ~ 2 см, тупыми ножницами. Флаг груди с кровоостанавливающий зажим и отражать его, поставив кровоостанавливающий над головой.
  3. Сделать небольшой надрез в левый желудочек (~0.5 см) с диафрагмой ножницами. Вставьте иглу оливковое накренилась перфузии через сайт разрез и кончик иглы на месте с кровоостанавливающий зажим. Прикрепите иглу в шприц 50 мл, содержащие параформальдегида фиксации раствор (1% PFA, рН 7,4).
  4. Откройте правого предсердия, раздел резки ножницами Ирис как перфузии. Запустить перфузии, нежно и непрерывно нажимать шприц со скоростью перфузии близко к 10 мл/мин остановить нажав когда жидкость, выход на выходе ясно любой крови. Весь процесс должен требовать ~ 5 мин.
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Выполните эти шаги под зонт для предотвращения токсичности из PFA.
  5. Вскрыть белых и коричневых жировых тканях от мышей. Используйте ножницы, чтобы разорвать на мелкие кусочки куски примерно 5 х 5 х 3 мм3образцы тканей. Перенесите небольшие куски стерилизовать пинцетом в ткани, встраивание кассеты с надлежащей маркировки образцы тканей на кассетах.
  6. Погружать внедрения кассеты, содержащие образцы тканей в фиксации раствор (1% ПФА в однократном ПБС, рН 7,4) при 4 ° C для 24-48 ч.
    Примечание: Решение фиксации и фиксация времени меняться в зависимости от размеров тканей16,17,18.
  7. Стирайте образцы с свежий 1 x PBS буфера, три раза (0,5 мл/мыть).
    ОСТОРОЖНОСТЬЮ: Выполните этот шаг под вытяжного шкафа. Параформальдегида отходы должны обрабатываться правильно согласно процедуры утилизации опасных отходов.
    Примечание: Ткани могут храниться в однократном ПБС на 4 ° C для дальнейшей обработки.

3. Антитело инкубации

  1. Вырежьте образцы фиксированных тканей кубиками примерно 2 мм3 стерилизованные ножницами. Для permeabilization, передача образцов в 1,5 мл, содержащих 1 мл 1 x PBS-TX (1% octoxynol-9 в однократном ПБС, см. таблицу для материалов, рН 7,4) и аккуратно поверните трубы в РТ за 1 час при 18 об/мин.
  2. Осторожно удалите 1 x PBS-TX путем аспирации. Стирать образцы 3 x, добавляя ПБС непосредственно в же трубы (не надо менять трубы). При каждой стирке Инвертируйте трубы несколько раз.
  3. Для блокировки, добавить 0,5 мл блокировки буфера (Таблица материалов) для образцов и проинкубируйте 2 ч с нежным вращение в рт.
  4. Подготовить 0,4 мл раствора первичного антитела, развести 2 мкл анти - endomucin (маркер кровеносных сосудов) 5 (1: 200) и 2 мкл анти-тирозин гидроксилазы (TH, маркер нервных волокон) 5 (1: 200, 1 мкг/мл) антител (таблица материалов антитела сведения) в 396 мкл блокировки буфера. Вортекс и отжима вплоть до восстановления тома.
  5. Для первой инкубации антитела осторожно удалите блокирующий буфер из кусков ткани. Добавьте 100 мкл основное антитело раствором, приготовленным на шаге 3.4 в пробирки и Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
    Примечание: Время разжижения и инкубации антитела может варьироваться среди различных антител. Рекомендуется для добавления азид натрия 0,02% раствор антител для предотвращения микробного роста. Подготовить 0,4 мл раствора первичного антитела с азид натрия, добавьте 4 мкл антител (1 мкл каждого) и 4 мкл азид натрия 2% в 392 мкл блокировки буфера.
  6. Тщательно Соберите решение основное антитело для повторного использования при необходимости. Стирать образцы с 1 x PBST (рН 7,4, 100 мкл/мыть) три раза (по 30 мин.) с нежным вращения на 18 об/мин.
  7. Для приготовления раствора вторичного антитела, разбавленного 2 мкл Флюорофор (волна длина 495 нм) конъюгированных анти коза IgG (1: 200) и 2 мкл Флюорофор (волны длиной 650 Нм) конъюгированных анти кролик IgG (1: 200) (см. Таблицу материалы) в 396 мкл Блокирующий буфер. Вортекс и спин кратко, чтобы собрать все жидкости.
    Примечание: Защите образцы от света во время следующих процедур.
  8. Для второго Антитело инкубации удалите последний буфер мыть из образцов. Добавить 100 мкл раствора вторичное антитело в пробирки и проинкубируйте 2 h на RT с нежным вращения на 18 об/мин.
  9. Осторожно удалите раствор вторичных антител. Стирать образцы 3 x с 1 x PBST (рН 7,4, 30 мин) с нежным вращения на 18 об/мин.
    Примечание: Не использовать это решение вторичные антитела, как она может быть загрязнена следовые количества первичных антител, принесенные в тканях.
  10. Для оптических Распродажа погружать образцы в 1 мл 90% глицерина и держать образцы на 4 ° C в темноте до тех пор, пока они становятся прозрачными.
    Примечание: Продолжительность погружения зависит от типа ткани и размера. Как правило 2 мм куб3 белой жировой ткани должен ночи инкубации, то время как те же размера коричневый жировой ткани образец потребности больше.
  11. Придерживайтесь силиконовые изолятор на слайд для создания хорошо для тома воображения. Кроме того, приложите несколько слоев прозрачной лентой к слайдам и вырежьте квадрат из середины для создания хорошо (рисунок 2).
    Примечание: Отрегулируйте глубину хорошо подогнать размер выборки. В этом протоколе используется 1 мм Глубина скважины.
  12. Тщательно передавать образцы в колодец и заполнить его с монтажа средней (см. Таблицу материалы). Положите крышку выскальзования на поверхности и уплотнение углов скольжения обложки с высокой вязкости (см. Таблицу материалы). Пусть для монтажа средних лечения 24 h на RT в темноте.
    Примечание: Убедитесь, что нет места между образцом и крышка выскальзования. Избегайте пузырей под крышку выскальзования. Избегайте чрезмерного давления на образцы.

4. образ приобретение

  1. Приобрести Z-стек изображений (см. шаги 4.2 – 4,7) с целью 20 x Конфокальный микроскоп/программного обеспечения.
  2. Запустите систему. Нажмите на вкладку <Configuration> и активировать Аргонового лазера и HeNe 633 лазер. Щелкните на вкладке <приобретать>. В панели <Visible> лазерной линии, вверх соответствующий ползунок интенсивности выбрать лазерные линии 488 нм и 633 нм. Первоначально интенсивность можно установить до 20 – 30%. Выберите зеркало 488/561/633 тройной dichoric. Активируйте ПМТС, нажав на <активных> чекбоксов, выбор PMT1 для выбросов возбуждается 488 нм лазер и PMT3 для этого из 633 нм лазер. Установите диапазон волны до 500 – 550 Нм для PMT1 и 650-750nm для PMT3. Выберите psudocolor использоваться для отображения изображения двойным щелчком цветной прямоугольник рядом с каждой ПЛТ и выбрать цвет из всплывающего меню.
  3. Нажмите на <Live> проверить изображения образцов. Используйте ручку позиции z для выбора плоскости фокуса в регионе XY интерес. Настройте яркость изображения, Настройка интенсивности лазера, смарт-усиление и смещение. Для каждого канала флуоресценции выполнения этой регулировки под режим отображения <QLUT> (быстрый взгляд вверх таблица). Нажмите на кнопку <QLUT>, чтобы войти в QLUT режим, в котором насыщенных пикселей отображаются синим цветом для помощи установление надлежащих яркости. Нажмите дважды на кнопку <QLUT>, чтобы вернуться в режим отображения псевдоцветном.
    Примечание: Численные значения параметра могут различаться в каждом эксперименте.
  4. Во время сканирования, поверните ручку позиции Z против часовой стрелки для перемещения план фокус к одному концу объема интерес и нажмите кнопку <конец> стрелки для задания сканирования конечное положение. Затем поверните ручку Z-позиции по часовой стрелке, чтобы переместить плоскости фокуса через образец на другом конце тома интерес и нажмите на <Begin> стрелки для задания сканирования begin позицию.
    Примечание: Для сравнения между различными образцами Определите объем же Z для разных выборок.
  5. Отрегулируйте размер z шаг 3 µm. изменения качества изображения, выбрав формат 1024 x 1024, скорость 100 Гц и линии в среднем 2.
  6. Выберите <Пуск > начать приобретение z стек изображений.
  7. Для максимальной проекция стека полученное изображение, нажмите на вкладку <процесс> и <инструмент>, выберите <3D проекции> и введите <максимум> в списке метод без изменений для X, Y и Z. набор <Пороговое значение> 0. Нажмите на <применяются>. Максимальная интенсивность Z-тома будут уложены в 2D изображение, которое будет показан (рис. 4A).

5. анализ кровеносных сосудов и нервных волокон сетей

  1. Анализ 2D фото через открытым исходным кодом (см. таблицу материалы)19
    1. Откройте стек изображений в программном обеспечении. Отрегулируйте диаметр сосуда и интенсивности , пока не все конструкции судна могут быть правильно выбран (рис. 4B).
    2. Выберите запустить анализ и экспорт данных, следуя инструкциям программного обеспечения.
  2. Анализ 3D фото через лицензированного программного обеспечения (см. таблицу материалы)
    1. Откройте исходные данные изображений с помощью программного обеспечения. Отрегулируйте порог и других параметров до несущей конструкции судна в каждом слое z-тома правильно выбранных (обратитесь к руководству пользователя для деталей в программное обеспечение) (рис. 4 c).
    2. Анализ отобранных сегментов символов и экспортировать данные после указания программного обеспечения.

Результаты

Были собраны дистальной эпидидимальных белой жировой ткани (eWAT), медиальной регионом дорсально подкожной белой жировой ткани (спецназ) и медиальной региона межлопаточной коричневая жировая ткань (BAT). Места для сбора этих тканей, указаны на рисунке 1.

...

Обсуждение

Ремоделирование жировой ткани непосредственно связан с метаболической dysregulation во время развития ожирения1,2. Ангиогенез и симпатической иннервации, так необходимых для динамических ремоделирования процесс2,12. Таким образ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения (НИЗ) Грант R01DK109001 (к.с.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch805-545-180Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch711-605-152Lot: 121944
Amira 6.0Thermo Fisher ScientificLicensed software
Angio toolNational Institutes of HealthOpen source software
https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibodyR&D research systemAF4666Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibodyPel Freez BiologicalsP40101-150Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D = 0.17 mmZeiss474030-9020-000
Cytoseal 280Thermo Fisher Scientific8311-4High-viscosity medium
GlycerolFisherG33-500
Paraformaldehyde,16%TED PELLA170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deepINVITROGENP24744Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965Mounting medium
SEA BLOCK Blocking BufferThermo Fisher Scientific37527X3
Sodium azideSigma-AldrichS2002-100G
Tissue Path IV Tissue CassettesThermo Fisher Scientific22-272416
Triton Χ-100Sigma-AldrichX100Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseriesVWR10136-084
Tween-20Sigma-AldrichP1379Generic term: Polysorbate 20

Ссылки

  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigations. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  3. Sun, K., et al. Endotrophin triggers adipose tissue fibrosis and metabolic dysfunction. Nature Communication. 5, 3485 (2014).
  4. Zhao, Y., et al. Divergent functions of endotrophin on different cell populations in adipose tissue. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 311 (6), E952-E963 (2016).
  5. Zhao, Y., et al. Transient Overexpression of VEGF-A in Adipose Tissue Promotes Energy Expenditure via Activation of the Sympathetic Nervous System. Molecular and Cellular Biology. , (2018).
  6. Xue, Y., et al. Hypoxia-independent angiogenesis in adipose tissues during cold acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
  7. Chen, S., et al. LncRNA TDRG1 enhances tumorigenicity in endometrial carcinoma by binding and targeting VEGF-A protein. BBA Molecular Basis of Disease. 1864 (9 Pt B), 3013-3021 (2018).
  8. Sun, K., et al. Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (15), 5874-5879 (2012).
  9. During, M. J., et al. Adipose VEGF Links the White-to-Brown Fat Switch With Environmental, Genetic, and Pharmacological Stimuli in Male Mice. Endocrinology. 156 (6), 2059-2073 (2015).
  10. Elias, I., et al. Adipose tissue overexpression of vascular endothelial growth factor protects against diet-induced obesity and insulin resistance. Diabetes. 61 (7), 1801-1813 (2012).
  11. Sung, H. K., et al. Adipose vascular endothelial growth factor regulates metabolic homeostasis through angiogenesis. Cell Metabolism. 17 (1), 61-72 (2013).
  12. Cao, Y. Angiogenesis and vascular functions in modulation of obesity, adipose metabolism, and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 18 (4), 478-489 (2013).
  13. Sun, K., et al. Brown adipose tissue derived VEGF-A modulates cold tolerance and energy expenditure. Molecular Metabolism. 3 (4), 474-483 (2014).
  14. Zeng, W., et al. Sympathetic neuro-adipose connections mediate leptin-driven lipolysis. Cell. 163 (1), 84-94 (2015).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
  16. Berry, R., et al. Imaging of adipose tissue. Methods in Enzymology. 537, 47-73 (2014).
  17. Jiang, H., Ding, X., Cao, Y., Wang, H., Zeng, W. Dense Intra-adipose Sympathetic Arborizations Are Essential for Cold-Induced Beiging of Mouse White Adipose Tissue. Cell Metabolism. 26 (4), 686-692 (2017).
  18. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  19. Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS One. 6 (11), e27385 (2011).
  20. An, Y. A., et al. Angiopoietin-2 in white adipose tissue improves metabolic homeostasis through enhanced angiogenesis. eLife. 6, (2017).
  21. Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены