Co Färbung Blutgefäße und Nervenfasern im Fettgewebe

Zusammenfassung

New Schiff Blutbildung und sympathische Innervation spielen entscheidende Rolle im Fettgewebe, das umgestaltet. Es bleiben jedoch technische Probleme zu visualisieren und Fettgewebe quantitativ zu messen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um erfolgreich zu kennzeichnen und quantitativ vergleichen die dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in verschiedenen Fettgewebe.

Zusammenfassung

Neuere Studien haben deutlich gemacht, dass die kritische Rolle der Angiogenese und sympathische Innervation im Fettgewebe Umbau bei der Entwicklung von Fettleibigkeit. Daher ist es notwendig, eine einfache und effiziente Methode, um die dynamischen Veränderungen im Fettgewebe dokumentieren zu entwickeln. Hier beschreiben wir einen modifizierten immunofluorescent Ansatz, der effizient Blutgefäße und Nervenfasern in Fettgewebe Co Flecken. Im Vergleich zu traditionellen und neu entwickelte Methoden, ist unser Ansatz relativ einfach zu folgen und effizienter bei der Kennzeichnung der Blutgefäße und Nervenfasern mit höherer Dichte und weniger Hintergrund. Darüber hinaus ermöglicht die höhere Auflösung der Bilder weiter Bereich der Schiffe, die Höhe der Verzweigung und die Länge der Fasern durch open-Source-Software genau zu messen. Als eine Demonstration, die mit unserer Methode zeigen wir, dass diese braune Fettgewebe (BAT) höhere Mengen an Blutgefäßen und Nervenfasern im Vergleich zu weißen Fettgewebe (WAT) enthält. Wir ferner feststellen, dass unter die WATs, subkutane WAT (sWAT) mehr Blutgefäße und Nervenfasern im Vergleich zu epididymal WAT (eWAT) hat. Unsere Methode bietet somit ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Fettgewebe umgestaltet.

Einleitung

Fettgewebe hat Schlüssel metabolische und endokrine Funktionen¹. Es dynamisch erweitert oder verkleinert als Reaktion auf verschiedene Nährstoff betont². Das aktive Gewebe Umbau Prozess besteht aus mehreren physiologischen Wege/Schritte einschließlich der Angiogenese, Fibrose und Gestaltung der lokalen entzündlichen Mikroumgebungen^2,3,4. Einige körperliche Reize, wie kalte Belichtung und Übung können sympathische Aktivierung auslösen, führt letztlich zu neuen Schiff Blutbildung und sympathische Innervation im Fettgewebe^5,6. Diese Umgestaltung Prozesse sind systemische metabolische Ergebnisse einschließlich Insulin-Empfindlichkeit, das Markenzeichen des Typ 2 Diabetes²eng verbunden. Visualisierung dieser pathologischen Veränderungen sind deshalb sehr wichtig für das Verständnis des gesunden Status des gesamten Fettgewebe.

Angiogenese ist der Prozess des neuen Schiffes Blutbildung. Da Blutgefäße Sauerstoff, Nährstoffe, Hormone und Wachstumsfaktoren Gewebe liefern, Angiogenese einen wichtigen Schritt im Fettgewebe, das umgestaltet, galt die mit verschiedenen Techniken^6,7, dokumentiert ist ^{8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13}. jedoch bleiben Fragen über die Auflösung der Bilder, die Effizienz der Immunostaining und Methoden zur Quantifizierung des Schiffes Dichte. Im Vergleich zu New Schiff Blutbildung, ist Innervation im Fettgewebe für eine lange Zeit unterschätzt worden. Vor kurzem, Zeng Et Al. ¹⁴ verwendet erweiterte intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie und gezeigt, dass Schichten von Nervenfasern¹⁴Adipozyten umgeben sind. Seither haben Forscher begonnen, die zentrale Rolle der sympathischen Innervation bei Regulierung der Fettgewebe Physiologie zu schätzen wissen. Daher ist es wichtig, einen einfachen und praktische Ansatz für Dokument adipösen Nerv Innervation zu entwickeln.

Hier berichten wir über eine optimierte Methode für die Co-Färbung von Blutgefäßen und Nervenfasern auf unsere früheren Protokollen basierende. Mit dieser Methode erreichen wir klare Bilder von Blutgefäßen und Nervenfasern ohne lauten Hintergrund. Darüber hinaus erhalten wir eine Resolution, die hoch genug ist für die Durchführung von quantitativen Messung der Dichte mit open-Source-Software. Mithilfe dieses neuen Ansatzes können wir erfolgreich die Strukturen und dichten der Blutgefäße und Nervenfasern in den verschiedenen adipose Depots vergleichen.

Protokoll

Alle Verfahren, die enthalten tierischer Themen von der Animal Welfare Committee der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt worden (tierische Protokollnummer: AWC-18-0057).

(1) Reagenz Vorbereitung

1. 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4): um 1 L 1 X PBS zu machen, auflösen, 8 g NaCl, 0,2 g KCl und 1,44 g Na₂HPO₄0,24 g KH₂PO₄ in 800 mL destilliertem Wasser. Anpassen des pH-Werts 7,4 und füllt mit destilliertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L.
2. 1 % Paraformaldehyd in 1 X PBS (1 % PFA, wt/Vol): um ein finales Volumen von 50 mL zu erreichen, fügen Sie 3,125 mL 16 % PFA (siehe Tabelle der Materialien), 46,875 mL 1 X PBS. Gut mischen und bei 4 ° C für die spätere Verwendung speichern.
   Vorsicht: Paraformaldehyd ist giftig. Alle Verfahren sollten unter einer Abzugshaube nicht einatmen und Hautkontakt durchgeführt werden.
3. 0,1 % Polysorbat 20 (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 X PBS-Puffer (1 x PBST, pH 7,4, Vol/Vol): um ein finales Volumen von 50 mL zu erreichen, fügen Sie 0,05 mL Polysorbat 20, 49,95 mL 1 X PBS. Wirbel und Speicher bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
4. 1 % Octoxynol-9 (siehe Tabelle der Materialien) mit 1 X PBS-Puffer (1 x PBS-TX, pH 7,4, Vol/Vol): zu einem Endvolumen von 10 mL 0,1 mL Octoxynol-9 zu 9,9 mL 1 X PBS hinzufügen. Wirbel und Speicher bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
5. 2 % Natriumazid (wt/Vol): 0,2 g Natriumazid hinzufügen um 10 mL 2 % Natriumazid produzieren, 10 mL 1 X PBS. Gut mischen und bei 4 ° C für die spätere Verwendung speichern.
6. 90 % Glycerin in 1 X PBS (Vol/Vol): um einem Endvolumen von 10 mL zu erreichen, fügen Sie 1 mL 1 X PBS bis 9 mL Glycerin. Wirbel und bei Raumtemperatur (RT) für die spätere Verwendung lagern.

(2) Tier Ddissection und Fettgewebe Sammlung

1. Verwenden Sie 6 Wochen altes Baby C57BL/6J männliche Mäuse. Die Mäuse mit Isofluran (4 – 5 % für die Induktion dann 1 – 2 % für Wartung) zu betäuben. Sobald betäubt, führen Sie einen Zehe-Prise Reflex um die Narkose Tiefe, gemessen an den Mangel an Pedal Reflexe zu bestimmen. Sobald die Mäuse tief betäubt sind, sezieren Sie die Mäuse nach dem Protokoll als zuvor veröffentlichten¹⁵.
2. Sterilisieren Sie die stumpfe Scheren und OP-Bereich der Brust (keine Notwendigkeit, die Haare rasieren). Öffne die Truhe durch das Zwerchfell und Rippen entlang der seitlichen Oberfläche mit einer Größe von ~ 2 cm mit einer stumpfen Schere schneiden. Die Brust-Flagge mit Gefäßklemme Klemme und reflektieren es indem man die Gefäßklemme über den Kopf.
3. Machen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Ventrikel (~0.5 cm), mit der Iris-Schere. Eine Olive-bestückte Perfusion Nadel durch die Schnitt-Website und die Spitze der Nadel mit der Gefäßklemme Klemme. Legen Sie die Nadel auf eine 50 mL Spritze mit Paraformaldehyd Fixierung Lösung (1 % PFA, pH 7.4).
4. Öffnen Sie den rechten Vorhof durch Abschnitt schneiden mit Iris-Schere als Perfusion-Outlet. Die Perfusion durch sanft beginnen und kontinuierlich schieben die Spritze mit einer Perfusion Rate nah an 10 mL/min stoppen drücken, wenn die Flüssigkeit verlassen die Steckdose frei von Blut ist. Der gesamte Prozess sollte ~ 5 min benötigen.
   Vorsicht: Führen Sie diese Schritte unter einem Abzug, Toxizität von PFA zu verhindern.
5. Weißen und braunen Fettgewebe von den Mäusen zu sezieren. Mit einer Schere um die Gewebeproben in kleine Stücke von Brocken ca. 5 x 5 x 3 mm³zu brechen. Übertragen Sie kleine Stücke mit der sterilen Pinzette in das Gewebe einbetten Kassetten mit ordnungsgemäßen Kennzeichnung von Gewebeproben auf den Kassetten.
6. Tauchen die einbettenden Kassetten mit Gewebeproben in die Fixierung-Lösung (1 % PFA mit 1 X PBS-Puffer, pH 7,4) bei 4 ° C für 24 – 48 h.
   Hinweis: Die Fixierung Lösung und Fixierzeit variieren je nach Größe der Gewebe^16,17,18.
7. Waschen Sie die Proben mit frischen 1 x PBS-Puffer drei Zeiten (0,5 mL/Waschgang).
   Vorsicht: Führen Sie diesen Schritt unter einem Abzug. Die Paraformaldehyd Abfall sollte richtig entsprechend Entsorgungsverfahren Sondermüll entsorgt werden.
   Hinweis: Das Gewebe können mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C zur weiteren Verarbeitung gespeichert werden.

3. Antikörper Inkubationszeit

1. Die festen Gewebeproben in ca. 2 mm³ Würfel mit der sterilisierten Schere ausschneiden. Für Permeabilisierung, übertragen die Proben in einem 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL 1 x PBS-TX (1 %-Octoxynol-9 in 1 X PBS, siehe Tabelle für Materialien, pH 7,4) und sanft die Rohre bei RT für 1 h bei 18 u/min drehen.
2. Entfernen Sie vorsichtig die 1 x PBS-TX durch Absaugen. Waschen Sie die Proben 3 X durch Zugabe von 1 X PBS direkt in die gleichen Röhren (keine Notwendigkeit, die Rohre zu ändern). Invertieren Sie bei jedem Waschgang die Röhren mehrmals.
3. Für die Sperrung, die Proben 0,5 mL blockierende Puffer (Table of Materials) hinzu und 2 h mit sanften Drehung bei RT inkubieren.
4. Um 0,4 mL Primärantikörper Lösung vorzubereiten, zu verdünnen, 2 μL des anti - Endomucin (die Markierung der Blutgefäße) ⁵ (1: 200) und 2 μL des anti-Tyrosin Hydroxylase (TH, die Markierung von Nervenfasern) ⁵ (1: 200, 1 µg/mL) Antikörper (Tabelle der Materialien Antikörper Informationen) in 396 μl blocking-Puffer. Wirbel und Spin auf wiederherstellen die Lautstärke.
5. Entfernen Sie für die ersten Antikörper Inkubation vorsichtig den blockierenden Puffer aus Gewebe Brocken. Fügen Sie 100 μl Primärantikörper Lösung in Schritt 3.4 in Röhren vorbereitet und über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
   Hinweis: Die Antikörper Verdünnung und Inkubation Zeit variieren zwischen verschiedenen Antikörpern. Es wird empfohlen, die Antikörperlösung für mikrobielles Wachstum zu verhindern 0,02 % Natriumazid hinzu. Um 0,4 mL Primärantikörper Lösung mit Natriumazid vorzubereiten, fügen Sie 4 μL von Antikörpern (1 μl der einzelnen) und 4 μL von 2 % Natriumazid in 392 μl blocking-Puffer.
6. Sammeln Sie sorgfältig die primären Antikörper-Lösung für die Wiederverwendung, falls gewünscht. Waschen Sie die Proben mit 1 X PBST (pH 7.4, 100 µL/Waschgang) dreimal mit sanften Drehung bei 18 u/min (30 min).
7. Für die Vorbereitung der Sekundärantikörper Lösung, verdünnte 2 μL der Fluorophor (Welle Länge 495 nm) Anti-Ziege IgG (1: 200 konjugierte) und 2 μL der Fluorophor (Welle Länge 650 nm) Anti-Kaninchen-IgG (1: 200 konjugierte) (siehe Tabelle der Materialien) in 396 μL der blockierende Puffer. Wirbel und Spin kurz, um die Flüssigkeit aufzufangen.
   Hinweis: Im Verlauf der folgenden Verfahren schützen Sie die Proben vor Licht.
8. Entfernen Sie für den zweiten Antikörper-Inkubation der letzten Waschpuffer aus Proben. Fügen Sie 100 μL der Sekundärantikörper Lösung in Röhren und 2 h mit sanften Drehung bei 18 u/min bei RT inkubieren.
9. Entfernen Sie vorsichtig die sekundäre Antikörper-Lösung. Waschen Sie die Proben 3 X mit 1 X PBST (pH 7.4, 30 min) mit sanften Drehung bei 18 Umdrehungen pro Minute.
   Hinweis: Wiederverwenden Sie diese sekundäre Antikörper-Lösung nicht, wenn es mit Spuren von Primärantikörpern gebracht durch das Gewebe kontaminiert sein kann.
10. Tauchen Sie für optische Freiraum die Proben in 1 mL 90 % Glycerin und halten Sie die Proben bei 4 ° C im Dunkeln zu, bis sie durchsichtig geworden.
    Hinweis: Die Immersion Dauer hängt von der Gewebetyp und Größe. In der Regel braucht ein 2 mm³ Würfel aus weißen Fettgewebe über Nacht Inkubation, während der gleichen Größe braunen Fettgewebe Probe Bedürfnisse länger.
11. Halten Sie eine Silikon-Isolator zur Folie um einen Brunnen für die Volumen-Bildgebung zu erstellen. Alternativ legen Sie mehrere Schichten von Tesafilm auf Folien und schneiden Sie ein Quadrat aus der Mitte einen Brunnen erstellen (Abbildung 2).
    Hinweis: Stellen Sie die gut Tiefe um die Stichprobengröße zu passen. In diesem Protokoll wird gut 1 mm Tiefe verwendet.
12. Sorgfältig die Proben in den Brunnen zu übertragen und füllen Sie ihn mit dem Montage-Medium (siehe Tabelle der Materialien). Legen Sie ein Deckglas auf der Oberfläche und die Ecken des Deckglases mit hoher Viskosität Medium zu versiegeln (siehe Tabelle der Materialien). Lassen Sie die Montage mittlerer Heilung für 24 h bei RT in der Dunkelheit.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass kein Leerzeichen zwischen der Probe und Deckglas übrig bleibt. Vermeiden Sie Luftblasen unter dem Deckglas. Vermeiden Sie es, übermäßigen Druck auf die Proben.

4. die Bildaufnahme

1. Z-Stapel Bilder (siehe Schritte 4,2-4,7) mit dem Ziel, 20 X einer konfokalen Mikroskop/Software zu erwerben.
2. Starten Sie das System. Klicken Sie auf die Registerkarte "<Konfiguration>" und aktivieren Sie die Argonlaser und HeNe 633 Laser. Klicken Sie auf die Registerkarte "<Acquire>". Im Bereich <sichtbar> Laser Linien bewegen Sie die entsprechende Intensität-Regler zu wählen, die Laser-Linien von 488 nm und 633 nm. Zunächst können die Intensitäten auf 20 – 30 % eingestellt werden. Wählen Sie den dreifachen Dichoric 488/561/633-Spiegel. Die PMTs durch Anklicken den <aktiv> Checkboxen, die Wahl von PMT1 für die Emission von 488 nm Laser und PMT3 begeistert, 633 nm Laser aktiviert. Setzen Sie den Wellenlängenbereich 500 – 550 nm für PMT1 und 650-750nm für PMT3. Wählen Sie die Psudocolor für Bildanzeige verwendet werden, durch Doppelklick auf das farbige Rechteck neben jedem PMT und wählen Sie eine Farbe aus dem Einblendmenü aus.
3. Klicken Sie auf <Live>, um das Bild der Proben zu überprüfen. Verwenden Sie die Z-Position Regler, um eine Fokusebene in der XY-Region von Interesse wählen Sie. Stellen Sie die Helligkeit der Bilder durch die Laserintensität, intelligent Gain und Offset-tuning. Führen Sie für jeden Kanal Fluoreszenz diese Einstellung unter den Anzeigemodus <QLUT> (Quick Look Up Table). Klicken Sie auf die <QLUT>-Taste, um den QLUT Modus in der gesättigten Pixel blau zugunsten die Einstellung der entsprechenden Helligkeitsstufe angezeigt werden. Klicken Sie zweimal auf die Schaltfläche <QLUT> Pseudofarben Anzeigemodus zurück.
   Hinweis: Die numerischen Werte der Einstellung kann unter jedem Experiment variieren.
4. Während des Scannens, Drehknopf die Z-Position gegen den Uhrzeigersinn zu bewegen den Plan des Fokus auf ein Ende des Bandes von Interesse und klicken Sie auf die Pfeilspitze <Ende> Scan Endposition festgelegt. Dann drehen Sie den Z-Position Regler im Uhrzeigersinn, um die Fokusebene durch die Probe an das andere Ende des Bandes von Interesse zu bewegen und klicken Sie dann auf die Pfeilspitze <Begin> Scan Begin Position einstellen.
   Hinweis: Definieren Sie für den Vergleich zwischen verschiedenen Proben die gleichen Z-Lautstärke für verschiedene Proben.
5. Passen Sie die Z-Schritt Größe 3 µm. Ändern der Bildqualität durch Auswählen eines Formats von 1024 x 1024, Geschwindigkeit von 100 Hz und Linie Durchschnitt von 2.
6. Wählen Sie <starten > , die Z-Stapel-Bildaufnahme zu initiieren.
7. Für maximale Projektion des Stapels erfasste Bild, klicken Sie auf der Registerkarte <Prozess> und <Werkzeug> Wählen Sie <3D-Projektion> und geben Sie <maximale> in der Methodenliste unverändert auf X, Y und Z. Set <Schwelle> 0. Klicken Sie auf <Anwendung>. Die maximale Intensität des Z-Volumes werden in ein 2D-Bild gestapelt (Abb. 4A) wird angezeigt.

5. Analyse der Blutgefäße und Nerven Glasfasernetze

1. Analyse der 2D Bilder über open-Source-Software (siehe Tabelle der Materialien)¹⁹
   1. Öffnen Sie die gestapelten Bilder in die Software. Passen Sie Schiffs Durchmesser und Intensität , bis alles, was die Schiff Strukturen richtig sein können (Abbildung 4 b) ausgewählt.
   2. Wählen Sie Analyse ausführen und exportieren Sie die Daten nach Anleitung der Software.
2. Analyse der 3D Bilder über die lizenzierte Software (siehe Tabelle der Materialien)
   1. Öffnen Sie die raw-Daten der Bilder mit der Software. Die Schwelle und andere Parameter einstellen, bis die Schiff Strukturen in jeder Schicht des Z-Volumens richtig ausgewählt sind (siehe Benutzerhandbuch für Details in der Software) (Abbildung 4).
   2. Analysieren Sie die ausgewählten Segmenten Charaktere und exportieren Sie die Daten nach der Anleitung der Software.

Ergebnisse

Die distalen Region epididymal weißen Fettgewebe (eWAT), mediale Region des Dorsolumbar subkutane weißen Fettgewebes (sWAT) und medialen Region Interskapuläre braunen Fettgewebe (BAT) wurden gesammelt. Die Standorte für die Erhebung dieser Gewebe sind in Abbildung 1angegeben.

Abbildung 1: Anatomie des sub...

Diskussion

Fettgewebe Umbau knüpft direkt an metabolischen Dysregulation bei Adipositas Entwicklung^1,2. Angiogenese und sympathische Innervation sind unerlässlich für die dynamische umgestaltet Prozess^2,12. Daher eines anwendbaren Ansatzes um die Bildung neuer Blutgefäße sowie Nervenfasern zu visualisieren sind von großer Bedeutung. Bisherige Methoden zur Dokumentation von Angiogenese im Fettgewebe berichtet. ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	805-545-180	Lot: 116969
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Lot: 121944
Amira 6.0	Thermo Fisher Scientific		Licensed software
Angio tool	National Institutes of Health		Open source software https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Anti-mouse endomucin antibody	R&D research system	AF4666	Lot: CAAS0115101
Anti-tyrosine hydroxylase antibody	Pel Freez Biologicals	P40101-150	Lot: aj01215y
Cover glasses high performance, D = 0.17 mm	Zeiss	474030-9020-000
Cytoseal 280	Thermo Fisher Scientific	8311-4	High-viscosity medium
Glycerol	Fisher	G33-500
Paraformaldehyde,16%	TED PELLA	170215
Press-to-Seal Silicone Isolator with Adhesive, eight wells, 9 mm diameter, 1.0 mm deep	INVITROGEN	P24744	Silicone isolator
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36965	Mounting medium
SEA BLOCK Blocking Buffer	Thermo Fisher Scientific	37527X3
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002-100G
Tissue Path IV Tissue Cassettes	Thermo Fisher Scientific	22-272416
Triton Χ-100	Sigma-Aldrich	X100	Generic term: octoxynol-9
Tube rotator and rotisseries	VWR	10136-084
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Generic term: Polysorbate 20