Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وتستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي لتقييم سمية المركبات الكيميائية. وهي تتطور خارجيا وحساسة للمواد الكيميائية، مما يسمح بالكشف عن التغيرات الفينوتية خفية. تتطلب التجربة فقط كمية صغيرة من المركب، والتي تضاف مباشرة إلى لوحة تحتوي على الأجنة، مما يجعل نظام الاختبار فعالة وفعالة من حيث التكلفة.

Abstract

وسمك الحمار الوحشي هو كائن نموذجي للفقاريات يستخدم على نطاق واسع للمرض واكتشاف المخدرات القائمة على النمط الظاهري. سمك الحمار الوحشي يولد العديد من الذرية، لديه أجنة شفافة والتنمية الخارجية السريعة. وبالتالي، يمكن أيضا استخدام أجنة سمك الحمار الوحشي للتقييم السريع لسمية الأدوية الثمينة والمتاحة بكميات صغيرة. ويرد في هذه المادة وصف لطريقة الفحص الفعال لسمية المركبات الكيميائية باستخدام أجنة ما بعد الإخصاب لمدة تفي بمدة تبعد 1-5 أيام. يتم رصد الأجنة بواسطة مجهر مجسم للتحقيق في العيوب الفينوتية الناجمة عن التعرض لتركيزات مختلفة من المركبات. كما يتم تحديد تركيزات نصف قصوى قاتلة (LC50)من المركبات. تطلبت هذه الدراسة 3-6 ملغ من مركب مثبط، والتجربة بأكملها تستغرق حوالي 8-10 ساعة لإكمالها من قبل فرد في مختبر يحتوي على مرافق أساسية. البروتوكول الحالي مناسب لاختبار أي مركب لتحديد الآثار السمية أو غير المستهدفة التي لا تطاق للمركب في المرحلة المبكرة من اكتشاف المخدرات والكشف عن الآثار السامة الخفية التي قد تفوت في ثقافة الخلية أو غيرها من النماذج الحيوانية. وتقلل هذه الطريقة من التأخيرات الإجرائية وتكاليف تطوير المخدرات.

Introduction

إن تطوير المخدرات عملية مكلفة. قبل أن يتم الموافقة على مجمع كيميائي واحد من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) والوكالة الأوروبية للأدوية (EMA) يتم فحص عدة آلاف من المركبات بتكلفة أكثر من مليار دولار1. خلال التنمية ما قبل السريرية، ومطلوب الجزء الأكبرمن هذه التكلفة لاختبار الحيوان 2. للحد من التكاليف، يحتاج الباحثون في مجال تطوير المخدرات نماذج بديلة لفحص سلامة المركبات الكيميائية3. ولذلك ، في المرحلة المبكرة من تطوير المخدرات ، سيكون من المفيد جدا استخدام طريقة يمكن أن تقيم بسرعة سلامة وسمية المركبات في نموذج مناسب. هناك العديد من البروتوكولات التي تم استخدامها لفحص سمية المركبات الكيميائية التي تنطوي على نماذج زراعة الحيوانات والخلايا ولكنلا يوجد بروتوكول واحد يتم التحقق من صحته وهو في الاستخدام المشترك 4،5. البروتوكولات القائمة باستخدام حمار وحشي تختلف في الطول، وقد استخدمت من قبل الباحثين الفردية الذين قاموا بتقييم السمية وفقا لمتطلبات الراحةالخاصةبهم 6،7،8،9، 10 سنوات , 11 , 12.

في الماضي القريب، ظهرت سمك الحمار الوحشي كنموذج مناسب لتقييم سمية المركبات الكيميائية أثناءالتطور الجنيني 6،7. حمار وحشي لديه العديد من المزايا المضمنة لتقييم المركبات الكيميائية13. حتى التجارب على نطاق واسع قابلة، كما يمكن للأنثى حمار وحشي وضع دفعات من 200-300 البيض، والتي تتطور بسرعة خارج الجسم الحي، لا تحتاج إلى تغذية خارجية لمدة تصل إلى أسبوع وشفافة. يمكن إضافة المركبات مباشرة إلى الماء، حيث يمكن (اعتمادا على طبيعة المجمع) تنتشر من خلال الشيوريون، وبعد الفقس، من خلال الجلد والخياشيم والفم من اليرقات. التجارب لا تتطلب كميات وفيرة من المركبات الكيميائية14 بسبب صغر حجم الجنين. تطوير أجنة حمار وحشي تعبر عن معظم البروتينات اللازمة لتحقيق نتيجة النمو الطبيعي. ولذلك، فإن جنين سمك الحمار الوحشي هو نموذج حساس لتقييم ما إذا كان دواء محتمل يمكن أن يزعج وظيفة البروتين أو جزيء إشارة ذات أهمية التنمية. تصبح أجهزة سمك الحمار الوحشي وظيفية بين 2-5 dpf15، والمركبات التي هي سامة خلال هذه الفترة الحساسة من التطور الجنيني تحفز العيوب الفينوتية في يرقات حمار وحشي. هذه التغييرات phenotypic يمكن الكشف عنها بسهولة باستخدام المجهر بسيطة دون تقنيات الغازية11. وتستخدم على نطاق واسع أجنة حمار وحشي في البحوث السمية بسبب تعقيدها البيولوجي أكبر بكثير بالمقارنة مع فحص المخدرات في المختبر باستخدام نماذج ثقافة الخلايا16،17.  كما الفقاريات، والتركيب الوراثي والفيزيولوجي من حمار وحشي قابلة للمقارنة مع البشر، وبالتالي سمية المركبات الكيميائية متشابهة بين حمار وحشي والبشر8،18،19، 20 , 21 , ٢٢- وبالتالي، فإن سمك الحمار الوحشي أداة قيمة في المرحلة الأولى من اكتشاف المخدرات لتقييم سمية وسلامة المركبات الكيميائية.

في هذه المقالة، نقدم وصفا مفصلا للطريقة المستخدمة لتقييم سلامة وسمية مركبات مثبطات الأنهيدراز الكربونية (CA) باستخدام 1-5 أيام بعد الإخصاب (dpf) أجنة حمار وحشي من قبل باحث واحد. ويشمل البروتوكول تعريض أجنة سمك الحمار الوحشي لتركيزات مختلفة من مركبات المثبطات الكيميائية ودراسة الوفيات والتغيرات الفينوتية أثناء التطور الجنيني. في نهاية التعرض للمركبات الكيميائية، يتم تحديد جرعة LC50 من المادة الكيميائية. الطريقة تسمح للفرد لإجراء فحص فعال من 1-5 مركبات الاختبار ويستغرق حوالي 8-10 ساعة اعتماداعلى تجربة الشخص مع الطريقة (الشكل 1). ويرد في الشكل 2بيان لكل خطوة من الخطوات المطلوبة لتقييم سمية المركبات. يتطلب تقييم سمية مثبطات CA 8 أيام، ويشمل إعداد أزواج التزاوج (اليوم 1)؛ جمع الأجنة من خزانات تربية وتنظيفونقلها إلى حاضنة 28.5 درجة مئوية (اليوم 2)؛ توزيع الأجنة في آبار لوحة 24 بئر وإضافة مركبات مثبطات CA المخففة (اليوم 3)؛ تحليل الفينوتيبيك والتصوير من اليرقات (اليوم 4-8)، وتحديد جرعة LC50 (day8).  هذه الطريقة سريعة وفعالة، ويتطلب كمية صغيرة من المركب الكيميائي والمرافق الأساسية فقط من المختبر.

Protocol

وللمنشأة الأساسية لسمك الحمار الوحشي في جامعة تامبيري إذن بإنشاء من المجلس الوطني للتجارب الحيوانية (ESAVI/7975/04.10.05/2016). وقد أجريت جميع التجارب باستخدام أجنة سمك الحمار الوحشي وفقا لبروتوكول وحدة الخدمات الإقليمية التابعة لحكومة مقاطعة شرق فنلندا، والإدارة الاجتماعية والصحية لوحدة الخدمات الإقليمية في تامبيري ، رقم LSLH-2007-7254/Ym-23.

1. إعداد من بين عشية وضحاها حمار وحشي التزاوج الدبابات

  1. مكان 2-5 سمكة حمار وحشي ذكر الكبار و 3-5 حمار وحشي الإناث الكبار في خزانات التزاوج بين عشية وضحاها. (يتم تحريض تربية في الصباح عن طريق دورة الظلام والضوء التلقائي بين عشية وضحاها).
  2. إعداد العديد من الصلبان للحصول على ما يكفي من الأجنة لتقييم سمية أكثر من اثنين من المركبات الكيميائية. لتقييم السمية، يحتاج كل تركيز إلى ما لا يقل عن 20جنيناً 23.
  3. لتجنب التعامل مع الإجهاد للالحيوانات، والسماح للالحيوانات للراحة لمدة 2 أسابيع قبل استخدام نفس الأفراد للتربية.

2- جمع الأجنة وإعداد اللوحات للتعرض للمركبات الكيميائية

  1. جمع الأجنة، في اليوم التالي قبل الظهر، وذلك باستخدام مصفاة شبكة غرامة ونقلها على طبق بيتري يحتوي على E3 الجنين المتوسطة [5.0 ملكلوريد كلوريد كلوريد كلوريد مأكولات، 0.17 مل ككل، 0.33 مليون متر CaCl 2، 0.33 mM MgSO4،و 0.1٪ ث / ف الميثيلين الأزرق].
  2. إزالة الحطام باستخدام ماصة باستور البلاستيكية (على سبيل المثال، الغذاء والنفايات الصلبة). فحص كل دفعة من الأجنة تحت المجهر المجسم لإزالة الأجنة غير المخصبة / الميتة (التي تم تحديدها من قبل مظهرها غير شفاف).
  3. الحفاظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية في حاضنة. فحص الأجنة، في صباح اليوم التالي، تحت مجهر مجسم وإزالة أي أجنة غير صحية أو ميتة. أيضا، استبدال المتوسطة E3 القديمة مع الطازجة E3 المتوسطة.
    ملاحظة:يتم دائماً الحفاظ على أجنة سمك الحمار الوحشي عند 28.5 درجة مئوية في الظروف المختبرية.
  4. نقل بعناية 1 جنين في كل بئر من لوحة 24 جيدا تحتوي على ما يكفي من E3 المتوسطة لتغطية الأجنة.

3. الاستعدادات لحل مخزون المركبات الكيميائية وتوزيع المركب المخفف في الآبار

  1. إخراج القنينات التي تحتوي على مركبات مثبطة المخزنة في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة:اعتماداً على خصائص المجمع، يتم تخزين هذه في درجات حرارة مختلفة.
  2. وزن المركب (ق) باستخدام التوازن التحليلي الذي يمكن أن تزن بضعة ملليغرام (ملغ) من المجمع بدقة.
  3. إعداد ما لا يقل عن 250 ميكرولتر (100 مل) من محلول المخزون لكل مركب في مذيب مناسب (مثل الماء E3 أو كبريتيد ثنائي الميثيل (DMSO)، استناداً إلى خصائص القابلية للذوبان في المركبات.
    ملاحظة:يمكن القيام بالخطوات المذكورة أعلاه قبل يوم واحد من بدء التجربة في وقت مناسب وتخزينها في 4 درجة مئوية).
  4. جعل التخفيفات التسلسلية لحلول المخزون (على سبيل المثال، 10 ميكرومتر، 20 ميكرومتر، 50 ميكرومتر، 100 ميكرو متر، 150 ميكرو متر، 300 ميكرو متر و 500 ميكرومتر) باستخدام مياه E3 في أنابيب الطرد المركزي 15 مل.
    ملاحظة:تختلف تركيزات وعدد التخفيفات التسلسلية من مركب إلى مركب آخر تبعاً لمستويات سميتها.
  5. من 24 لوحة بئر تحتوي على الأجنة، إزالة المياه E3 من الآبار باستخدام ماصة باستور و1 مل ماصة (تحتوي على 1 ديسيبل الأجنة) صف واحد في وقت واحد.
  6. توزيع 1 مل من كل مخفف في كل بئر (بدءا من أقل والانتقال إلى تركيز أعلى) في الآبار من لوحة 24 جيدا.
  7. إعداد مجموعة تحكم من نفس المجموعة من الأجنة وإضافة الكمية المقابلة من مخفف.
  8. تسمية لوحات 24 جيدا مع اسم وتركيز المجمع والحفاظ على لوحات في 28.5 درجة مئوية في حاضنة.

4. التحليل الفينوتي تصوير الأجنة باستخدام مجهر مجسم

  1. فحص الأجنة تحت مجهر مجسم للمعلمات 24 ساعة بعد التعرض للمركبات الكيميائية.
    1. لاحظ المعلمات مثل الوفيات، الفقس، ضربات القلب، واستخدام كيس صفار البيض، وتطوير المثانة السباحة، وحركة الأسماك، وذمة التامور، وشكل الجسم23.
    2. خذ اليرقات المعرضة لكل تركيز من المجمع ووضعها جانبية في طبق بيتري صغير يحتوي على 3٪ عالية الوزن الجزيئي ميثيل السليلوز باستخدام مسبار معدني.
      ملاحظة:السليلوز الميثيل 3٪ (الجزيئية العالية مع) هو سائل لزج اللازمة لتضمين الأسماك مع التوجه المطلوب للفحص المجهري. لتوجيه الأسماك في هذا السائل، هناك حاجة إلى مسبار معدني.
    3. التقاط الصور باستخدام مجهر مجسم متصل بكاميرا. حفظ الصور في مجلد منفصل كل يوم حتى نهاية التجربة.
    4. أدخل كافة الملاحظات في جدول كل يوم إما في جدول عبر إنترنت أو على ورقة مطبوعة.
    5. إذا كانت المركبات سامة للأعصاب، فإن يرقات 4 إلى 5 ديسيبل قد تظهر نمط السباحة المتغير، وجعل سجل من هذه التغييرات إما عن طريق التقاط قصيرة (30 ق إلى 1 دقيقة) فيديو من اليرقات تظهر نمط حركة غير طبيعية.
    6. بعد 5 أيام من التعرض للمركبات الكيميائية، لاحظ التركيز الذي يموت فيه نصف الأجنة لحساب التركيز المميت الأقصى نصف 50 (LC50)من كل مادة كيميائية.
      ملاحظة:التركيز LC50 هو التركيز الذي يموت فيه 50٪ من الأجنة في نهاية 5 أيام من التعرض لمجمع كيميائي. استخدام ما لا يقل عن 20 جنينا لاختبار سمية كل تركيز مركب23.
    7. بناء منحنى لوفيات الأجنة لجميع التركيزات باستخدام برنامج مناسب.

النتائج

والجزء الحاسم من تقييم السمية هو اختبار تركيزات مختلفة من مركب كيميائي واحد أو مركب كيميائي متعدد في تجربة واحدة. في البداية، حدد المركبات لتقييم السمية، وعدد التركيزات لاختبار لكل مركب، وبناء على ذلك، قم بإجراء مخطط (الشكل3). استخدمنا لون فريد لكل مركب ل?...

Discussion

في اختبار السمية في المختبر باستخدام الخلايا المستزرعة يمكن الكشف عن البقاء على قيد الحياة والدراسات المورفولوجية للخلايا التي توفر معلومات محدودة عن السمية الناجمة عن مركب الاختبار. وميزة فحص سمية المركبات الكيميائية التي تستخدم أجنة سمك الحمار الوحشي هي الكشف السريع عن التغيرات ...

Disclosures

ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم العمل بمنح من مؤسسة سيغريد جوسيليوس (SP, MP), المؤسسة الثقافية الفنلندية (AA, MH), أكاديمية فنلندا (SP, MP), أوريون فارموس مؤسسة (MH), مؤسسة تامبيري للسل (SP, MH وMP) وجين وأتوس إركو مؤسسة (SP وMP ). نشكر متعاونينا الإيطالي والفرنسي، البروفيسور سوبوران، والبروفيسور وينوم، على توفير مثبطات أنهيدراز الكربونية لتقييم السلامة والسمية لأغراض تطوير الأدوية المضادة للسل والسرطان. ونشكر أوليكي ليموس وماريان كوسلاتي على المساعدة التقنية. كما نشكر لينا ماكينن وهانالينا بيبو على مساعدتهما في تربية أسماك الحمار الوحشي وجمع الأجنة. نشكر باخلاص هارلان باركر على التقييم النقدي للمخطوطة والتعليقات الثاقبة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesNuncThermo Scientific
Balance (Weighing scale)KERNPLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT.BakerRS421910024
Disecting ProbeThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, GermanyD4540
Falcon tubes 15 mLGreiner bio-one188271
High molecular weight methylcelluloseSigma Aldrich, GermanyM0262 
Incubator for zebrafish larvaeTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Methyl BlueSigma Aldrich, Germany28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, GermanyM7506
Microcentrifuge tubesStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemicals27810.295
Paraffin Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteur pipette Sarstedt86.1171
Petri dishThermo Scientific101R20 
Petri platesSarstedt82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)Thermo Scientific4641230N, 4641210N  
Plates 24-WellThermo Scientific142485
Steriomicroscope/CameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB strainsZIRC   ZL1 

References

  1. Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
  2. Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).
  3. Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
  4. Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
  5. Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
  6. Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).
  7. Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
  8. Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
  9. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
  10. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
  11. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
  12. Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
  13. Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
  14. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
  15. Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
  16. Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
  17. Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
  18. Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).
  19. Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
  20. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  21. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  22. Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
  23. Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
  24. Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
  25. Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
  26. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  27. Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
  28. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  29. Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved