Rapida valutazione della tossicità dei composti chimici utilizzando gli embrioni di pesce zebra

Riepilogo

Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L'esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.

Abstract

Il pesce zebra è un organismo modello di vertebrato ampiamente utilizzato per la malattia e la scoperta di farmaci basati sul fenotipo. Il pesce zebra genera molti figli, ha embrioni trasparenti e rapido sviluppo esterno. Gli embrioni di pesce zebra possono quindi essere utilizzati anche per la rapida valutazione della tossicità dei farmaci preziosi e disponibili in piccole quantità. Nel presente articolo, viene descritto un metodo per lo screening efficiente della tossicità dei composti chimici utilizzando embrioni post-fecondazione di 1-5 giorni. Gli embrioni sono monitorati da stereomicroscopiper per studiare i difetti fenotipici causati dall'esposizione a diverse concentrazioni di composti. Vengono inoltre determinate concentrazioni letali semimassi (LC₅₀) dei composti. Il presente studio ha richiesto 3-6 mg di un composto inibitore, e l'intero esperimento richiede circa 8-10 h per essere completato da un individuo in un laboratorio con strutture di base. Il protocollo attuale è adatto per testare qualsiasi composto per identificare effetti tossici o fuori bersaglio intollerabili del composto nella fase iniziale della scoperta di farmaci e per rilevare sottili effetti tossici che possono essere persi nella coltura cellulare o in altri modelli animali. Il metodo riduce i ritardi procedurali e i costi dello sviluppo di farmaci.

Introduzione

Lo sviluppo di farmaci è un processo costoso. Prima che un singolo composto chimico è approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e L'Agenzia europea dei medicinali (EMA) diverse migliaia di composti sono sottoposti a un costo di oltre un miliardo di dollari¹. Durante lo sviluppo preclinico, la maggior parte di questo costo è necessaria per la sperimentazione animale². Per limitare i costi, i ricercatori nel campo dello sviluppo di farmaci hanno bisogno di modelli alternativi per lo screening di sicurezza dei composti chimici³. Pertanto, nella fase iniziale dello sviluppo del farmaco, sarebbe molto utile utilizzare un metodo in grado di valutare rapidamente la sicurezza e la tossicità dei composti in un modello adatto. Ci sono diversi protocolli che sono stati utilizzati per lo screening della tossicità di composti chimici che coinvolgono modelli di coltura animale e cellulare, ma non c'è un unico protocollo che viene convalidato ed è in uso comune^4,5. I protocolli esistenti che utilizzano il pesce zebra variano in lunghezza e sono stati utilizzati da singoli ricercatori che hanno valutato la tossicità in base al loro requisito di convenienza^6,7,8^{,9, 10} del sistema ^{, 11 Del} sistema di ^{, 12}.

Nel recente passato, il pesce zebra è emerso come un modello conveniente per la valutazione della tossicità dei composti chimici durante lo sviluppo embrionale^6,7. Il pesce zebra ha molti vantaggi integrati per la valutazione dei composti chimici¹³. Anche gli esperimenti su larga scala sono suscettibili, in quanto una femmina di pesce zebra può deporre lotti di 200-300 uova, che si sviluppano rapidamente ex vivo, non hanno bisogno di alimentazione esterna fino a una settimana e sono trasparenti. I composti possono essere aggiunti direttamente nell'acqua, dove possono (a seconda della natura del composto) diffuso attraverso il chorion, e dopo la schiusa, attraverso la pelle, branchie e bocca delle larve. Gli esperimenti non richiedono abbondanti quantità di composti chimici¹⁴ a causa delle piccole dimensioni dell'embrione. Lo sviluppo di embrioni di pesce zebra esprimono la maggior parte delle proteine necessarie per ottenere il normale risultato dello sviluppo. Pertanto, un embrione di pesce zebra è un modello sensibile per valutare se un potenziale farmaco può disturbare la funzione di una proteina o di una molecola di segnalazione che è significativa dal punto di vista dello sviluppo. Gli organi del pesce zebra diventano funzionali tra 2-5 dpf¹⁵, e composti tossici durante questo periodo delicato di sviluppo embrionale inducono difetti fenotipici nelle larve di pesce zebra. Questi cambiamenti fenotipici possono essere facilmente rilevati utilizzando un semplice microscopio senza tecniche invasive¹¹. Gli embrioni di pesce zebra sono ampiamente utilizzati nella ricerca tossicologica a causa della loro complessità biologica molto maggiore rispetto allo screening farmacologico in vitro utilizzando modelli di coltura cellulare^16,17.  Come vertebrato, la composizione genetica e fisiologica del pesce zebra è paragonabile agli esseri umani e quindi le tossicità dei composti chimici sono simili tra il pesce zebra e gli esseri umani^{8,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22}. Il pesce zebra è quindi uno strumento prezioso nella fase iniziale della scoperta di farmaci per la valutazione della tossicità e della sicurezza dei composti chimici.

Nel presente articolo, forniamo una descrizione dettagliata del metodo utilizzato per valutare la sicurezza e la tossicità dei composti inibitori dell'andrasi (CA) carbonico utilizzando embrioni di pesce zebra post-5 giorni (dpf) da un singolo ricercatore. Il protocollo prevede l'esposizione degli embrioni di pesce zebra a diverse concentrazioni di composti inibitori chimici e lo studio della mortalità e dei cambiamenti fenotipici durante lo sviluppo embrionale. Alla fine dell'esposizione ai composti chimici, viene determinata la dose LC₅₀ della sostanza chimica. Il metodo consente a un individuo di effettuare uno screening efficiente di 1-5 composti di prova e richiede circa 8-10 h a seconda dell'esperienza della persona con il metodo (Figura 1). Ciascuno dei passaggi necessari per valutare la tossicità dei composti è descritto nella Figura 2. La valutazione della tossicità degli inibitori della CA richiede 8 giorni e include l'impostazione di coppie di accoppiamento (giorno 1); raccolta di embrioni da serbatoi di riproduzione, pulizia e trasferimento a 28,5 gradi centigradi (giorno 2); distribuzione degli embrioni nei pozzi di una piastra di 24 pozze e aggiunta di composti inibitori CA diluiti (giorno 3); l'analisi fenotipica e l'imaging delle larve (giorno 4-8) e la determinazione della dose di LC₅₀ (giorno8).  Questo metodo è rapido ed efficiente, richiede una piccola quantità del composto chimico e solo strutture di base del laboratorio.

Protocollo

La struttura centrale del pesce zebra della Tampere University ha un'autorizzazione di stabilimento concessa dal National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Tutti gli esperimenti che utilizzano embrioni di pesce zebra sono stati effettuati secondo il governo provinciale della Finlandia orientale, il Dipartimento sociale e sanitario del protocollo di unità di servizio regionale di Tampere - LSLH-2007-7254/Ym-23.

1. Impostazione dei serbatoi di accoppiamento per il pesce zebra durante la notte

1. Mettere 2-5 pesci zebra maschi adulti e 3-5 pesci zebra femminile adulti in serbatoi di accoppiamento durante la notte. (L'allevamento è indotto al mattino dal ciclo automatico del buio e della luce durante la notte).
2. Impostare diverse croci per ottenere abbastanza embrioni per valutare la tossicità di più di due composti chimici. Per la valutazione della tossicità, ogni concentrazione ha bisogno di un minimo di 20 embrioni²³.
3. Per evitare di maneggiare lo stress per gli animali, lasciare riposare gli animali per 2 settimane prima di utilizzare gli stessi individui per l'allevamento.

2. Raccolta di embrioni e preparazione di piastre per l'esposizione ai composti chimici

1. Raccogliere gli embrioni, il giorno successivo prima di mezzogiorno, utilizzando un colino a maglie fini e trasferirli su un piatto Petri contenente mezzo embrionale E3 [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄e 0,1% w/v Metilene Blue].
2. Rimuovere i detriti utilizzando una pipetta Pasteur di plastica (ad esempio, cibo e rifiuti solidi). Esaminare ogni lotto di embrioni sotto lo stereoscopio per rimuovere gli embrioni non fecondati/morti (identificati dal loro aspetto opaco).
3. Conservare gli embrioni a 28,5 gradi centigradi in un'incubatrice. Esaminare gli embrioni, la mattina successiva, sotto uno stereomicroscopio e rimuovere eventuali embrioni malsani o morti. Inoltre, sostituire il vecchio supporto E3 con un supporto E3 fresco.
   N.B.:Gli embrioni di pesce zebra sono sempre mantenuti a 28,5 gradi centigradi in condizioni di laboratorio.
4. Trasferire con attenzione 1 embrione in ogni pozzetto di una piastra di 24 pozze contenente abbastanza mezzo E3 per coprire gli embrioni.

3. Preparazioni della soluzione di riserva di composti chimici e distribuzione di composti diluiti nei pozzi

1. Estrarre le fiale contenenti composti inibitori immagazzinati a 4 gradi centigradi.
   NOTA: A seconda delle proprietà del composto, questi vengono memorizzati a temperature diverse.
2. Pesare i composti utilizzando un equilibrio analitico che può pesare alcuni milligrammi (mg) del composto con precisione.
3. Preparare almeno 250 l (100 mM) di soluzione di riserva per ogni composto in un solvente appropriato (ad esempio, acqua E3 o solfuro dimetilo (DMSO), in base alle proprietà di solubilità dei composti.
   NOTA: I passaggi precedenti possono essere eseguiti un giorno prima dell'inizio dell'esperimento in un momento conveniente e memorizzati a 4 gradi centigradi).
4. Effettuare diluizioni seriali delle soluzioni di stock (ad es., 10 M, 20 M, 50 M, 100 M, 150 M, 300 m e 500 M) utilizzando l'acqua E3 in tubi di centrifuga da 15 mL.
   NOTA: Le concentrazioni e il numero di diluizioni seriali variano da un composto all'altro a seconda dei loro livelli di tossicità.
5. Dalla 24 piastra contenente embrioni, rimuovere l'acqua E3 dai pozzi utilizzando una pipetta Pasteur e una pipetta da 1 mL (contenente 1 dpf embrioni) una riga alla volta.
6. Distribuire 1 mL di ogni diluente in ogni pozzo (a partire da una concentrazione più bassa e da quella più alta) nei pozze di 24 pozze.
7. Impostare un gruppo di controllo dallo stesso lotto di embrioni e aggiungere la quantità corrispondente di diluente.
8. Etichettare le piastre di 24 pozze con il nome e la concentrazione del composto e mantenere le piastre a 28,5 gradi centigradi in un'incubatrice.

4. Analisi fenotipica e imaging degli embrioni utilizzando uno stereomicroscopio

1. Esaminare gli embrioni sotto uno stereomicroscopio per i parametri 24 h dopo l'esposizione ai composti chimici.
   1. Si notino i parametri come la mortalità, la schiusa, il battito cardiaco, l'utilizzo del sacco del tuorlo, lo sviluppo della vescica, il movimento del pesce, l'edema pericardio e la forma del corpo²³.
   2. Prendi le larve esposte a ogni concentrazione del composto e deporrele lateralmente in una piccola piastra Petri contenente il 3% di cellulosa metilico ad alto peso molecolare utilizzando una sonda metallica.
      NOTA: Il 3% di cellulosa metilica (alta molecolare con) è un liquido viscoso necessario per incorporare il pesce con un orientamento richiesto per l'esame microscopico. Per orientare il pesce in questo liquido, è necessaria una sonda metallica.
   3. Scattare le immagini utilizzando lo stereomicroscopio collegato a una fotocamera. Salva le immagini in una cartella separata ogni giorno fino alla fine dell'esperimento.
   4. Inserisci tutte le osservazioni in una tabella ogni giorno in una tabella online o su un foglio stampato.
   5. Se i composti sono neurotossici, le larve da 4 a 5 dpf possono mostrare un modello di nuoto alterato, fare una registrazione di tali modifiche catturando un breve video (30 s a 1 min) delle larve che presentano un modello di movimento anormale.
   6. Dopo 5 giorni di esposizione ai composti chimici, notare la concentrazione alla quale la metà degli embrioni muore per calcolare la concentrazione letale massima 50 (LC₅₀) di ciascuna sostanza chimica.
      NOTA: L'LC₅₀ è la concentrazione alla quale il 50% degli embrioni muore alla fine di 5 giorni di esposizione a un composto chimico. Utilizzare un minimo di 20 embrioni per testare la tossicità di ogni concentrazione di un composto²³.
   7. Costruire una curva per la mortalità degli embrioni per tutte le concentrazioni utilizzando un programma adatto.

Risultati

La parte critica della valutazione della tossicità è la sperimentazione di diverse concentrazioni di uno o più composti chimici in un singolo esperimento. All'inizio, selezionare i composti per la valutazione della tossicità, il numero di concentrazioni da testare per ogni composto e, di conseguenza, creare un grafico (Figura 3). Abbiamo usato un colore univoco per ogni composto per organizzare gli esempi (Figura 3). L'uso di...

Discussione

Il test di tossicità in vitro con cellule coltivate è in grado di rilevare la sopravvivenza e gli studi morfologici delle cellule fornendo informazioni limitate sulla tossicità indotta dal composto di prova. Il vantaggio dello screening della tossicità dei composti chimici che utilizzano embrioni di pesce zebra è la rapida individuazione di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente in un intero animale durante lo sviluppo embrionale in un organismo modello pertinente. Circa il 70% dei geni umani che codif...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Nunc	Thermo Scientific
Balance (Weighing scale)	KERN	PLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)	Mettler Toledo	AB104-S/PH
CaCl2	JT.Baker	RS421910024
Disecting Probe	Thermo Scientific	17-467-604
DMSO	Sigma Aldrich, Germany	D4540
Falcon tubes 15 mL	Greiner bio-one	188271
High molecular weight methylcellulose	Sigma Aldrich, Germany	M0262
Incubator for zebrafish larvae	Termaks	B8000
KCL	Merck	1.04936.0500
Methyl Blue	Sigma Aldrich, Germany	28983-56-4
MgSO4	Sigma Aldrich, Germany	M7506
Microcentrifuge tubes	Starlab	S1615-5500
NaCl	VWR Chemicals	27810.295
Paraffin Histoplast IM	Thermo Scientific	8331
Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171
Petri dish	Thermo Scientific	101R20
Petri plates	Sarstedt	82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)	Thermo Scientific	4641230N, 4641210N
Plates 24-Well	Thermo Scientific	142485
Steriomicroscope/Camera	Zeiss	Stemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)	Fisherbrand	11569914
Zebrafish AB strains	ZIRC	ZL1