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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Zebrafisch-Embryonen werden zur Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen verwendet. Sie entwickeln sich extern und reagieren empfindlich auf Chemikalien, was den Nachweis subtiler phäotypischer Veränderungen ermöglicht. Das Experiment benötigt nur eine geringe Menge an Verbindung, die direkt auf die Platte mit Embryonen zugesetzt wird, was das Testsystem effizient und kostengünstig macht.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch ist ein weit verbreiteter Wirbeltiermodellorganismus für die Krankheit und phänotypbasierte Arzneimittelentdeckung. Der Zebrafisch erzeugt viele Nachkommen, hat transparente Embryonen und eine schnelle äußere Entwicklung. Zebrafisch-Embryonen können daher auch für die schnelle Bewertung der Toxizität der Medikamente verwendet werden, die wertvoll sind und in kleinen Mengen erhältlich sind. In diesem Artikel wird ein Verfahren zum effizienten Screening der Toxizität chemischer Verbindungen mit 1-5-Tage-Embryonen nach der Befruchtung beschrieben. Die Embryonen werden durch Stereomikroskop überwacht, um die phänotypischen Defekte zu untersuchen, die durch die Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Verbindungen verursacht werden. Halbmaximale tödliche Konzentrationen (LC50) der Verbindungen werden ebenfalls bestimmt. Die vorliegende Studie erforderte 3-6 mg einer Inhibitorverbindung, und das ganze Experiment dauert etwa 8-10 h, um von einer Person in einem Labor mit grundlegenden Einrichtungen abgeschlossen werden. Das aktuelle Protokoll eignet sich zum Testen jeder Verbindung, um unerträgliche toxische oder zielferne Wirkungen der Verbindung in der frühen Phase der Arzneimittelentdeckung zu identifizieren und subtile toxische Wirkungen zu erkennen, die in der Zellkultur oder anderen Tiermodellen übersehen werden können. Die Methode reduziert Verfahrensverzögerungen und Kosten der Arzneimittelentwicklung.

Einleitung

Die Arzneimittelentwicklung ist ein teurer Prozess. Bevor eine einzige chemische Verbindung von der Food and Drug Administration (FDA) und der Europäischen Arzneimittel-Agentur (EMA) zugelassen wird, werden mehrere tausend Verbindungen zu einem Preis von über einer MilliardeDollar1 gescreent. Während der präklinischen Entwicklung wird der größte Teil dieser Kosten für dieTierversuche2 benötigt. Um die Kosten zu begrenzen, benötigen Forscher auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung alternative Modelle für das Sicherheitsscreening chemischer Verbindungen3. Daher wäre es in der frühen Phase der Arzneimittelentwicklung sehr vorteilhaft, eine Methode zu verwenden, die die Sicherheit und Toxizität der Verbindungen in einem geeigneten Modell schnell bewerten kann. Es gibt mehrere Protokolle, die für das Toxizitätsscreening von chemischen Verbindungen mit Tier- und Zellkulturmodellen verwendet wurden, aber es gibt kein einziges Protokoll, das validiert ist und häufig verwendet wird4,5. Vorhandene Protokolle mit Zebrafischen variieren in der Länge und wurden von einzelnen Forschern verwendet, die die Toxizität nach ihrer Bequemlichkeit Anforderung 6,7,8,9 , 10 , 11 , 12.

In der jüngsten Vergangenheit hat sich der Zebrafisch als ein bequemes Modell für die Bewertung der Toxizität chemischer Verbindungen während der embryonalen Entwicklung6,7herauskristallisiert. Der Zebrafisch hat viele eingebaute Vorteile für die Bewertung chemischer Verbindungen13. Selbst groß angelegte Experimente sind möglich, da ein Zebrafischweibchen Chargen von 200-300 Eiern legen kann, die sich ex vivoschnell entwickeln, bis zu einer Woche keine externe Fütterung benötigen und transparent sind. Die Verbindungen können direkt in das Wasser hinzugefügt werden, wo sie (je nach Art der Verbindung) durch die Chorion und nach dem Schlüpfen, durch die Haut, Kiemen und Mund von Larven diffundieren können. Die Experimente erfordern aufgrund der geringen Größe des Embryos keine großen Mengen chemischer Verbindungen14. Die Entwicklung von Zebrafischembryonen drückt die meisten Proteine aus, die erforderlich sind, um das normale Entwicklungsergebnis zu erzielen. Daher ist ein Zebrafisch-Embryo ein empfindliches Modell, um zu beurteilen, ob ein potenzielles Medikament die Funktion eines Proteins oder Signalmoleküls stören kann, das entwicklungssignifikant ist. Die Organe der Zebrafische werden zwischen 2-5 dpf15funktionsfähig, und Verbindungen, die während dieser sensiblen Phase der embryonalen Entwicklung giftig sind, induzieren phänotychen defekte Zebrafischlarven. Diese phäotypischen Veränderungen lassen sich mit einem einfachen Mikroskop ohne invasive Techniken leicht erkennen11. Zebrafisch-Embryonen werden in der toxikologischen Forschung aufgrund ihrer viel größeren biologischen Komplexität im Vergleich zum In-vitro-Arzneimittel-Screening mit Zellkulturmodellen16,17weit verbreitet.  Als Wirbeltier ist die genetische und physiologische Zusammensetzung von Zebrafischen mit dem Menschen vergleichbar und daher sind die Toxizitäten chemischer Verbindungen zwischen Zebrafischen und Menschen ähnlich8,18,19, 20 , 21 , 22. Zebrafisch ist somit ein wertvolles Instrument in der frühen Phase der Arzneimittelentdeckung zur Bewertung der Toxizität und Sicherheit der chemischen Verbindungen.

In diesem Artikel enthalten wir eine detaillierte Beschreibung des Verfahrens zur Bewertung der Sicherheit und Toxizität von Kohlensäureanhydrase (CA)-Inhibitorverbindungen unter Verwendung von 1-5-Tage-Zebrafischembryonen (dpf) von einem einzigen Forscher. Das Protokoll beinhaltet die Exposition von Zebrafischembryonen gegenüber verschiedenen Konzentrationen chemischer Inhibitorverbindungen und die Untersuchung der Mortalität und der phänotypischen Veränderungen während der embryonalen Entwicklung. Am Ende der Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen wird die LC 50-Dosis der Chemikalie bestimmt. Das Verfahren ermöglicht es einem Individuum, effizientes Screening von 1-5 Testverbindungen durchzuführen und dauert etwa 8-10 h, abhängig von der Erfahrung der Person mit der Methode (Abbildung 1). Jeder der Schritte, die zur Beurteilung der Toxizität der Verbindungen erforderlich sind, ist in Abbildung 2dargestellt. Die Bewertung der Toxizität von CA-Inhibitoren erfordert 8 Tage und umfasst die Einrichtung von Paarungspaaren (Tag 1); Entnahme von Embryonen aus Zuchttanks, Reinigung und Übertragung in 28,5 °C Brutkasten (Tag 2); Verteilung der Embryonen in die Brunnen einer 24-Well-Platte und Zugabe von verdünnten CA-Hemmerverbindungen (Tag 3); phätagische Analyse und Bildgebung von Larven (Tag 4-8) und Bestimmung der LC50-Dosis (Tag8).  Diese Methode ist schnell und effizient, erfordert eine kleine Menge der chemischen Verbindung und nur grundlegende Einrichtungen des Labors.

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Protokoll

Die Zebrafisch-Kernanlage an der Universität Tampere verfügt über eine Betriebsgenehmigung des National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Alle Experimente mit Zebrafischembryonen wurden nach Angaben der Provinzregierung Ostfinnlands, sozial- und gesundheitspolitische Abteilung des Protokolls der RegionalService Unit von Tampere, LSLH-2007-7254/Ym-23, durchgeführt.

1. Einrichten von Übernacht-Zebrafisch-Mating Tanks

  1. Platz 2-5 erwachsene männliche Zebrafische und 3-5 erwachsene weibliche Zebrafische in Paarungsbecken über Nacht. (Die Züchtung wird morgens durch einen automatischen Dunkel- und Lichtzyklus über Nacht induziert).
  2. Richten Sie mehrere Kreuze ein, um genügend Embryonen für die Beurteilung der Toxizität von mehr als zwei chemischen Verbindungen zu erhalten. Für die Bewertung der Toxizität benötigt jede Konzentration mindestens 20 Embryonen23.
  3. Um den Umgang mit Stress für die Tiere zu vermeiden, lassen Sie die Tiere 2 Wochen ruhen, bevor Sie dieselben Individuen für die Zucht verwenden.

2. Sammlung von Embryonen und Vorbereitungsplatten für die Exposition gegenüber chemischen Verbindungen

  1. Sammeln Sie die Embryonen am nächsten Tag vor Mittag mit einem Feinnetzsieb und übertragen Sie sie auf eine Petrischale mit E3-Embryomedium [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4und 0,1% w/v Methylenblau].
  2. Entfernen Sie Denreste mit einer Pasteur-Kunststoffpipette (z. B. Lebensmittel und feste Abfälle). Untersuchen Sie jede Charge von Embryonen unter dem Stereomikroskop, um die unbefruchteten/toten Embryonen zu entfernen (identifiziert durch ihr undurchsichtiges Aussehen).
  3. Bewahren Sie die Embryonen bei 28,5 °C in einem Inkubator auf. Untersuchen Sie die Embryonen am nächsten Morgen unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie alle ungesunden oder toten Embryonen. Ersetzen Sie auch das alte E3 Medium durch frisches E3 Medium.
    HINWEIS:Zebrafischembryonen werden unter Laborbedingungen immer bei 28,5 °C gehalten.
  4. Übertragen Sie vorsichtig 1 Embryo in jeden Brunnen einer 24-Well-Platte, die genügend E3-Medium enthält, um die Embryonen zu bedecken.

3. Zubereitungen der Lagerlösung chemischer Verbindungen und Verteilung von verdünnten Verbindungen in die Brunnen

  1. Nehmen Sie die Fläschchen mit Inhibitorverbindungen heraus, die bei 4 °C gespeichert sind.
    HINWEIS: Je nach Eigenschaften der Verbindung werden diese bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert.
  2. Wiegen Sie die Verbindung(en) mit einem analytischen Gleichgewicht, das ein paar Milligramm (mg) der Verbindung genau wiegen kann.
  3. Bereiten Sie für jede Verbindung mindestens 250 l (100 mM) Der Stammlösung in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. E3-Wasser oder Dimethylsulfoxid (DMSO) auf der Grundlage der Löslichkeitseigenschaften der Verbindungen vor.
    ANMERKUNG: Die oben genannten Schritte können einen Tag vor Beginn des Experiments zu einem günstigen Zeitpunkt durchgeführt und bei 4 °C gespeichert werden).
  4. Machen Sie serielle Verdünnungen der Lagerlösungen (z. B. 10 m, 20 m, 50 m, 100 M, 150 M, 300 m und 500 m) mit E3-Wasser in 15 ml Zentrifugenrohren.
    ANMERKUNG: Die Konzentrationen und die Anzahl der seriellen Verdünnungen variieren je nach Toxizität von einer Verbindung zur anderen.
  5. Entfernen Sie aus der 24 Brunnenplatte, die Embryonen enthält, E3-Wasser aus den Brunnen mit einer Pasteurpipette und einer 1 ml Pipette (mit 1 dpf-Embryonen) eine Reihe nach der anderen.
  6. 1 ml jedes Verdünnungsverdünnungsguts in jedem Brunnen (von niedriger ergehend und in höhere Konzentration) in die Brunnen der 24-Well-Platte verteilen.
  7. Richten Sie eine Kontrollgruppe aus derselben Charge von Embryonen ein, und fügen Sie die entsprechende Menge an Verdünnungsmittel hinzu.
  8. 24-Well-Platten mit dem Namen und der Konzentration der Verbindung beschriften und die Platten bei 28,5 °C in einem Inkubator aufbewahren.

4. Phänotypische Analyse und Bildgebung der Embryonen mit einem Stereomikroskop

  1. Untersuchen Sie die Embryonen unter einem Stereomikroskop auf Parameter 24 h nach Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen.
    1. Beachten Sie die Parameter wie Sterblichkeit, Schlüpfen, Herzschlag, Verwendung von Eigelbsack, Schwimmen Blase Entwicklung, Bewegung der Fische, Perikardödem, und Form des Körpers23.
    2. Nehmen Sie die Larven, die jeder Konzentration der Verbindung ausgesetzt sind, und legen Sie sie seitlich in einer kleinen Petrischale, die 3% hochmolekulare Methylcellulose enthält, mit einer Metallsonde.
      ANMERKUNG: Die 3% Methylcellulose (hochmolekular mit) ist eine viskose Flüssigkeit, die für die Einbettung der Fische mit einer erforderlichen Ausrichtung für die mikroskopische Untersuchung benötigt wird. Zur Orientierung der Fische in dieser Flüssigkeit wird eine Metallsonde benötigt.
    3. Nehmen Sie die Bilder mit Stereomikroskop an einer Kamera befestigt. Speichern Sie die Bilder jeden Tag bis zum Ende des Experiments in einem separaten Ordner.
    4. Geben Sie alle Beobachtungen in einer Tabelle jeden Tag entweder in einer Onlinetabelle oder auf einem gedruckten Blatt ein.
    5. Wenn die Verbindungen neurotoxisch sind, können die 4 bis 5 dpf Larven veränderte Schwimmmuster zeigen, machen Sie eine Aufzeichnung solcher Veränderungen entweder durch die Aufnahme eines kurzen (30 s bis 1 min) Video der Larven, die abnormale Bewegungsmuster aufweisen.
    6. Beachten Sie nach 5 Tagen Exposition gegenüber den chemischen Verbindungen die Konzentration, bei der die Hälfte der Embryonen stirbt, um die halbmaximale tödliche Konzentration 50 (LC50) jeder Chemikalie zu berechnen.
      ANMERKUNG: Der LC50 ist die Konzentration, bei der 50% der Embryonen am Ende von 5 Tagen der Exposition gegenüber einer chemischen Verbindung sterben. Verwenden Sie mindestens 20 Embryonen, um die Toxizität jeder Konzentration einer Verbindung zu testen23.
    7. Konstruieren Sie eine Kurve für die Sterblichkeit von Embryonen für alle Konzentrationen mit einem geeigneten Programm.

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Ergebnisse

Der entscheidende Teil der Bewertung der Toxizität ist die Prüfung verschiedener Konzentrationen einer oder mehrerer chemischer Verbindungen in einem einzigen Experiment. Wählen Sie zu Beginn die Verbindungen für die Bewertung der Toxizität, die Anzahl der zu testenden Konzentrationen für jede Verbindung aus, und erstellen Sie dementsprechend ein Diagramm (Abbildung 3). Wir haben für jede Verbindung eine eindeutige Farbe verwendet, um die Proben zu org...

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Diskussion

In-vitro-Toxizitätstests mit kultivierten Zellen können Überlebens- und morphologische Studien der Zellen erkennen, die begrenzte Informationen über die durch die Testverbindung induzierte Toxizität liefern. Der Vorteil des Toxizitätsscreenings chemischer Verbindungen mit Zebrafischembryonen ist der schnelle Nachweis chemisch induzierter phänotischer Veränderungen bei einem ganzen Tier während der embryonalen Entwicklung in einem relevanten Modellorganismus. Ungefähr 70% der proteinkodierenden menschli...

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Offenlegungen

Die Autoren berichteten über keinen möglichen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Die Arbeit wurde durch Stipendien der Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), der Finnischen Kulturstiftung (AA, MH), der Akademie Finnlands (SP, MP), der Orion Farmos Foundation (MH), der Tampere Tuberculosis Foundation (SP, MH und MP) und Der Jane and Aatos Erkko Foundation (SP und MP) unterstützt. ). Wir danken unseren italienischen und französischen Mitarbeitern, Prof. Supuran und Prof. Winum, für die Bereitstellung von Kohlensäure-Anhydrase-Inhibitoren für die Sicherheits- und Toxizitätsbewertung für Anti-TB- und Anti-Krebs-Medikamente-Entwicklungszwecke. Wir danken Aulikki Lehmus und Marianne Kuuslahti für die technische Unterstützung. Wir danken auch Leena Mäkinen und Hannaleena Piippo für ihre Hilfe bei der Zebrafischzucht und -sammlung von Embryonen. Wir danken Harlan Barker aufrichtig für die kritische Bewertung des Manuskripts und aufschlussreiche Kommentare.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesNuncThermo Scientific
Balance (Weighing scale)KERNPLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT.BakerRS421910024
Disecting ProbeThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, GermanyD4540
Falcon tubes 15 mLGreiner bio-one188271
High molecular weight methylcelluloseSigma Aldrich, GermanyM0262 
Incubator for zebrafish larvaeTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Methyl BlueSigma Aldrich, Germany28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, GermanyM7506
Microcentrifuge tubesStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemicals27810.295
Paraffin Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteur pipette Sarstedt86.1171
Petri dishThermo Scientific101R20 
Petri platesSarstedt82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)Thermo Scientific4641230N, 4641210N  
Plates 24-WellThermo Scientific142485
Steriomicroscope/CameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB strainsZIRC   ZL1 

Referenzen

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