Évaluation rapide de la toxicité des composés chimiques à l'aide d'embryons de poisson zèbre

Résumé

Les embryons de poissons zèbres sont utilisés pour évaluer la toxicité des composés chimiques. Ils se développent à l'extérieur et sont sensibles aux produits chimiques, permettant la détection de changements phénotypiques subtils. L'expérience ne nécessite qu'une petite quantité de composé, qui est directement ajouté à la plaque contenant des embryons, ce qui rend le système de test efficace et rentable.

Résumé

Le poisson zèbre est un organisme modèle vertébré largement utilisé pour la découverte de médicaments à base de phénotypes. Le poisson zèbre génère de nombreuses descendantes, a des embryons transparents et un développement externe rapide. Les embryons de poissons zèbres peuvent donc également être utilisés pour l'évaluation rapide de la toxicité des médicaments qui sont précieux et disponibles en petites quantités. Dans le présent article, une méthode pour le criblage efficace de la toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de 1-5 jours après la fertilisation est décrite. Les embryons sont surveillés par stéréomicroscope pour étudier les défauts phénotypiques causés par l'exposition à différentes concentrations de composés. Des concentrations létales semi-maximales (LC₅₀) des composés sont également déterminées. La présente étude a exigé 3-6 mg d'un composé d'inhibiteur, et l'ensemble de l'expérience prend environ 8-10 h pour être accompli par un individu dans un laboratoire ayant des équipements de base. Le protocole actuel est approprié pour tester n'importe quel composé afin d'identifier les effets toxiques ou hors cible intolérables du composé dans la phase initiale de la découverte de médicaments et de détecter les effets toxiques subtils qui peuvent être manqués dans la culture cellulaire ou d'autres modèles animaux. La méthode réduit les retards procéduraux et les coûts de développement des médicaments.

Introduction

Le développement de médicaments est un processus coûteux. Avant qu'un seul composé chimique ne soit approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) et l'Agence européenne des médicaments (EMA), plusieurs milliers de composés sont examinés à un coût de plus d'un milliard de dollars¹. Pendant le développement préclinique, la plus grande partie de ce coût est nécessaire pour l'expérimentation animale². Pour limiter les coûts, les chercheurs dans le domaine du développement de médicaments ont besoin de modèles alternatifs pour le dépistage de l'innocuité des composés chimiques³. Par conséquent, dans la phase initiale du développement du médicament, il serait très bénéfique d'utiliser une méthode qui peut rapidement évaluer l'innocuité et la toxicité des composés dans un modèle approprié. Il existe plusieurs protocoles qui ont été utilisés pour le dépistage de la toxicité des composés chimiques impliquant des modèles de culture animale et cellulaire, mais il n'y a pas un seul protocole qui est validé et est en usage courant^4,5. Les protocoles existants utilisant le poisson zèbre varient en longueur et ont été utilisés par des chercheurs individuels qui ont évalué la toxicité selon leur exigence de commodité^6,7,8^{,9, 10} Ans et plus ^{, 11} Ans, états-unis ( ^{, 12}.

Dans un passé récent, le poisson zèbre est apparu comme un modèle pratique pour l'évaluation de la toxicité des composés chimiques au cours du développement embryonnaire^6,7. Le poisson zèbre a de nombreux avantages intégrés pour l'évaluation des composés chimiques¹³. Même les expériences à grande échelle sont favorables, car une femelle poisson zèbre peut pondre des lots de 200-300 œufs, qui se développent rapidement ex vivo, n'ont pas besoin d'alimentation externe pour un pas jusqu'à une semaine et sont transparents. Les composés peuvent être ajoutés directement dans l'eau, où ils peuvent (selon la nature du composé) diffuser à travers le chorion, et après l'éclosion, à travers la peau, les branchies et la bouche des larves. Les expériences ne nécessitent pas de quantités abondantes de composés chimiques¹⁴ en raison de la petite taille de l'embryon. Le développement d'embryons de poisson zèbre exprime la plupart des protéines nécessaires pour atteindre les résultats normaux du développement. Par conséquent, un embryon de poisson zèbre est un modèle sensible pour évaluer si un médicament potentiel peut perturber la fonction d'une protéine ou d'une molécule de signalisation qui est significative sur le plan du développement. Les organes du poisson zèbre deviennent fonctionnels entre 2-5 dpf¹⁵, et les composés qui sont toxiques pendant cette période sensible de développement embryonnaire induisent des défauts phénotypiques chez les larves de poissons zèbres. Ces changements phénotypiques peuvent être facilement détectés à l'aide d'un simple microscope sans techniques invasives¹¹. Les embryons de poissons zèbres sont largement utilisés dans la recherche toxicologique en raison de leur complexité biologique beaucoup plus grande par rapport au dépistage in vitro des médicaments à l'aide de modèles de culture cellulaire^16,17.  En tant que vertébré, la composition génétique et physiologique du poisson zèbre est comparable à l'homme et donc les toxicités des composés chimiques sont similaires entre le poisson zèbre et l'homme^{8,18,19, 20} Ans, états-unis ^{, 21} Ans, états-unis ^{, 22}. Le poisson zèbre est donc un outil précieux dans la phase initiale de la découverte de médicaments pour l'évaluation de la toxicité et de la sécurité des composés chimiques.

Dans le présent article, nous fournissons une description détaillée de la méthode utilisée pour évaluer l'innocuité et la toxicité des composés inhibiteurs de l'anhydrase carbonique (CA) à l'aide d'embryons de poisson zèbre post-fertilisation (dpf) de 1 à 5 jours par un seul chercheur. Le protocole consiste à exposer les embryons de poissons zèbres à différentes concentrations de composés inhibiteurs chimiques et à étudier la mortalité et les changements phénotypiques au cours du développement embryonnaire. À la fin de l'exposition aux composés chimiques, la dose lc50 du produit chimique est déterminée. La méthode permet à une personne d'effectuer un dépistage efficace de 1-5 composés d'essai et prend environ 8-10 h en fonction de l'expérience de la personne avec la méthode (Figure 1). Chacune des étapes requises pour évaluer la toxicité des composés est décrite à la figure 2. L'évaluation de la toxicité des inhibiteurs de l'AC nécessite 8 jours, et comprend la mise en place de paires d'accouplement (jour 1); la collecte des embryons dans les réservoirs de reproduction, leur nettoyage et leur transfert dans un incubateur de 28,5 oC (jour 2); la distribution des embryons dans les puits d'une plaque de 24 puits et l'ajout de composés inhibiteurs dilués de l'AC (jour 3); l'analyse phénotypique et l'imagerie des larves (jour 4-8), et la détermination de la dose de LC₅₀ (jour8).  Cette méthode est rapide et efficace, nécessite une petite quantité du composé chimique et seulement des installations de base du laboratoire.

Protocole

L'installation centrale de poisson zèbre de l'Université de Tampere dispose d'une autorisation d'établissement accordée par le National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.05/2016). Toutes les expériences utilisant des embryons de poissons zèbres ont été réalisées selon le gouvernement provincial de finlande orientale, le Département social et de la santé du protocole de l'Unité des services régionaux de Tampere - LSLH-2007-7254/Ym-23.

1. Mise en place de réservoirs d'accouplement de poisson zèbre de nuit

1. Placer 2-5 poissons zèbres mâles adultes et 3-5 poissons zèbres femelles adultes dans des réservoirs d'accouplement pendant la nuit. (La reproduction est induite le matin par cycle automatique sombre et léger pendant la nuit).
2. Mettre en place plusieurs croisements pour obtenir suffisamment d'embryons pour évaluer la toxicité de plus de deux composés chimiques. Pour l'évaluation de la toxicité, chaque concentration a besoin d'un minimum de 20 embryons²³.
3. Pour éviter de manipuler le stress aux animaux, permettre aux animaux de se reposer pendant 2 semaines avant d'utiliser les mêmes individus pour la reproduction.

2. Collecte d'embryons et préparation de plaques pour l'exposition aux composés chimiques

1. Recueillir les embryons, le lendemain avant midi, à l'aide d'une passoire à mailles fines et les transférer sur un plat Petri contenant un milieu embryonnaire E3 [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄, et 0,1% w/v Methylène Blue].
2. Enlever les débris à l'aide d'une pipette Pasteur en plastique (p. ex., nourriture et déchets solides). Examiner chaque lot d'embryons sous le stéréomicroscope pour enlever les embryons non fécondés/morts (identifiés par leur apparence opaque).
3. Conserver les embryons à 28,5 oC dans un incubateur. Examinez les embryons, le lendemain matin, sous un stéréomicroscope et enlevez tous les embryons malsains ou morts. Remplacez également l'ancien milieu E3 par un milieu E3 frais.
   REMARQUE: Les embryons de poissons zèbres sont toujours maintenus à 28,5 oC en laboratoire.
4. Transférer soigneusement 1 embryon dans chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant suffisamment de milieu E3 pour couvrir les embryons.

3. Préparation de la solution courante de composés chimiques et distribution de composés dilués dans les puits

1. Sortez les flacons contenant des composés inhibiteurs stockés à 4 oC.
   REMARQUE: Selon les propriétés du composé, celles-ci sont stockées à des températures différentes.
2. Peser le composé à l'aide d'un équilibre analytique qui peut peser quelques milligrammes (mg) du composé avec précision.
3. Préparer au moins 250 l (100 mm) de solution de bouillon pour chaque composé dans un solvant approprié (p. ex., eau E3 ou sulfoxure de diméthyle (DMSO), en fonction des propriétés de solubilité des composés.
   REMARQUE: Les étapes ci-dessus peuvent être effectuées un jour avant le début de l'expérience à un moment opportun et stockées à 4 oC).
4. Effectuer des dilutions en série des solutions de stock (par exemple, 10 m, 20 M, 50 M, 100 M, 150 M, 300 M et 500 M) à l'aide d'eau E3 dans des tubes centrifugeurs de 15 ml.
   REMARQUE: Les concentrations et le nombre de dilutions en série varient d'un composé à l'autre en fonction de leur niveau de toxicité.
5. Sur les 24 plaques de puits contenant des embryons, retirer l'eau E3 des puits à l'aide d'une pipette Pasteur et d'une pipette de 1 ml (contenant 1 embryon sp) une rangée à la fois.
6. Distribuer 1 ml de chaque diluant dans chaque puits (à partir de plus bas et passer à une concentration plus élevée) dans les puits de 24 puits.
7. Configurez un groupe témoin à partir du même lot d'embryons et ajoutez la quantité correspondante de diluant.
8. Étiqueter les plaques de 24 puits avec le nom et la concentration du composé et les garder à 28,5 oC dans un incubateur.

4. Analyse phénotypique et imagerie des embryons à l'aide d'un stéréomicroscope

1. Examiner les embryons sous un stéréomicroscope pour les paramètres 24 h après l'exposition aux composés chimiques.
   1. Notez les paramètres tels que la mortalité, l'éclosion, le rythme cardiaque, l'utilisation du sac jaune, le développement de la vessie natatoire, le mouvement du poisson, l'œdème péricardique, et la forme du corps²³.
   2. Prenez les larves exposées à chaque concentration du composé et déposez-les latéralement dans un petit plat Petri contenant 3% de cellulose méthyle de poids moléculaire élevé à l'aide d'une sonde métallique.
      REMARQUE: La cellulose méthyle de 3 % (avec un haut moléculaire) est un liquide visqueux nécessaire à l'intégration du poisson avec une orientation requise pour l'examen microscopique. Pour orienter le poisson dans ce liquide, une sonde métallique est nécessaire.
   3. Prenez les images à l'aide d'un stéréomicroscope attaché à une caméra. Enregistrez les images dans un dossier séparé chaque jour jusqu'à la fin de l'expérience.
   4. Entrez toutes les observations dans une table chaque jour, soit dans une table en ligne ou sur une feuille imprimée.
   5. Si les composés sont neurotoxiques, les larves de 4 à 5 dpfs peuvent montrer un modèle de nage altéré, faire un enregistrement de ces changements soit en capturant une courte (30 s à 1 min) vidéo des larves présentant un modèle de mouvement anormal.
   6. Après 5 jours d'exposition aux composés chimiques, notez la concentration à laquelle la moitié des embryons meurent pour calculer la demi-concentration létale maximale 50 (LC₅₀) de chaque produit chimique.
      REMARQUE: Le LC₅₀ est la concentration à laquelle 50% des embryons meurent à la fin de 5 jours d'exposition à un composé chimique. Utilisez un minimum de 20 embryons pour tester la toxicité de chaque concentration d'un composé²³.
   7. Construire une courbe pour la mortalité des embryons pour toutes les concentrations à l'aide d'un programme approprié.

Résultats

La partie essentielle de l'évaluation de la toxicité consiste à tester différentes concentrations d'un ou plusieurs composés chimiques dans une seule expérience. Au début, sélectionnez les composés pour l'évaluation de la toxicité, le nombre de concentrations à tester pour chaque composé, et par conséquent, faire un tableau (Figure 3). Nous avons utilisé une couleur unique pour chaque composé pour organiser les échantillons (

Discussion

Le test de toxicité in vitro à l'aide de cellules cultivées peut détecter la survie et les études morphologiques des cellules fournissant des informations limitées sur la toxicité induite par le composé d'essai. L'avantage du criblage de toxicité des composés chimiques utilisant des embryons de poisson zèbre est la détection rapide des changements phénotypiques induits chimiquement dans un animal entier pendant le développement embryonnaire dans un organisme modèle pertinent. Environ 70 % des gèn...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Nunc	Thermo Scientific
Balance (Weighing scale)	KERN	PLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)	Mettler Toledo	AB104-S/PH
CaCl2	JT.Baker	RS421910024
Disecting Probe	Thermo Scientific	17-467-604
DMSO	Sigma Aldrich, Germany	D4540
Falcon tubes 15 mL	Greiner bio-one	188271
High molecular weight methylcellulose	Sigma Aldrich, Germany	M0262
Incubator for zebrafish larvae	Termaks	B8000
KCL	Merck	1.04936.0500
Methyl Blue	Sigma Aldrich, Germany	28983-56-4
MgSO4	Sigma Aldrich, Germany	M7506
Microcentrifuge tubes	Starlab	S1615-5500
NaCl	VWR Chemicals	27810.295
Paraffin Histoplast IM	Thermo Scientific	8331
Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171
Petri dish	Thermo Scientific	101R20
Petri plates	Sarstedt	82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)	Thermo Scientific	4641230N, 4641210N
Plates 24-Well	Thermo Scientific	142485
Steriomicroscope/Camera	Zeiss	Stemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)	Fisherbrand	11569914
Zebrafish AB strains	ZIRC	ZL1