利用斑马鱼胚胎对化合物毒性的快速评价

摘要

斑马鱼胚胎用于评估化合物的毒性。它们从外部发展，对化学品敏感，能够检测细微的型型变化。实验只需要少量的化合物，直接添加到含有胚胎的板中，使测试系统高效且经济高效。

摘要

斑马鱼是一种广泛使用的脊椎动物模型生物体，用于疾病和表型药物发现。斑马鱼产生许多后代，具有透明的胚胎和快速的外部发育。因此，斑马鱼胚胎也可用于快速评估珍贵和小批量药物的毒性评估。本文介绍了一种利用1-5天受精后胚胎有效筛选化合物毒性的方法。胚胎通过立体显微镜进行监测，以调查因接触不同浓度化合物而导致的型板状缺陷。也确定了化合物的半最大致命浓度（LC_50）。本研究需要3-6毫克的抑制剂化合物，整个实验大约需要8-10小时，由一个人在实验室有基本设施完成。目前的规程适用于测试任何化合物，以识别该化合物在药物发现的早期阶段的不可容忍的毒性或脱靶效应，并检测细胞培养或其他动物模型中可能遗漏的细微毒性影响。该方法减少了药物开发的程序性延迟和成本。

引言

药物开发是一个昂贵的过程。在单一化合物获得美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准之前，对数千种化合物进行筛选，费用超过10亿^美元。在临床前开发期间，大部分费用是动物试验2需要^的。为了限制成本，药物开发领域的研究人员需要替代模型来对化合物进行安全筛选3。因此，在药物开发的早期阶段，使用一种能以合适的模型快速评估化合物的安全性和毒性的方法是非常有益的。有几个协议已经用于涉及动物和细胞培养模型的化合物的毒性筛选，但没有一个协议被验证，并共同使用4，5。使用斑马鱼的现有协议长度不同，个别研究人员根据其便利性要求6、7、8、9^评估毒性。^10,11,12.

近段时间，斑马鱼已成为评估胚胎发育6、7号过程中化合物毒性的便捷模型。斑马鱼在评价^化合物13方面有许多内在优势。即使是大规模的实验也是可以的，因为斑马鱼雌性可以产下200-300个卵子，这些卵子在外发育迅速，不需要外部喂养长达一周，而且透明。化合物可以直接添加到水中，在那里它们可以（取决于化合物的性质）通过幼虫扩散，孵化后，通过幼虫的皮肤，刺和嘴。由于胚胎体积小，实验不需要大量的^{化合物14。}开发斑马鱼胚胎表达实现正常发育结果所需的大部分蛋白质。因此，斑马鱼胚胎是一个敏感的模型，用于评估潜在的药物是否会干扰具有发育意义的蛋白质或信号分子的功能。斑马鱼的器官在2-5 dpf¹⁵之间发挥作用，在这个胚胎发育的敏感时期有毒的化合物会导致斑马鱼幼虫的表型缺陷。这些型状变化可以很容易地检测使用简单的显微镜没有侵入性^技术11。斑马鱼胚胎被广泛用于毒理学研究，因为它们的生物复杂性比使用细胞培养模型16、17的体外药物筛选要复杂得多。 作为一种脊椎动物，斑马鱼的遗传和生理组成与人类相当，因此斑马鱼和人类之间的化合物毒性^{相似。20,21,因此，}斑马鱼是药物发现早期评估化合物毒性和安全性的宝贵工具。

在本文中，我们详细介绍了单个研究人员使用1-5天后受精（dpf）斑马鱼胚胎评估碳氢合酶（CA）抑制剂化合物的安全性和毒性的方法。该协议涉及将斑马鱼胚胎暴露于不同浓度的化学抑制剂化合物中，并研究胚胎发育过程中的死亡率和样型变化。在接触化合物结束时，确定该化学品的LC₅₀剂量。该方法允许个人对1-5种测试化合物进行有效筛选，并根据需要使用该方法的人的经验需要8-10小时（图1）。图2概述了评估化合物毒性所需的每个步骤。CA抑制剂的毒性评估需要8天，包括建立交配对（第1天）;从繁殖罐中收集胚胎，清洗并转移到28.5°C培养箱（第2天）;将胚胎分配到24孔板的井中，并加入稀释的CA抑制剂化合物（第3天）;幼虫的型板分析和成像（第4-8天），以及LC₅₀剂量（第8天）的测定。 该方法快速高效，需要少量的化合物和实验室的基本设施。

研究方案

坦佩雷大学的斑马鱼核心设施拥有国家动物实验委员会（ESAVI/7975/04.10.05/2016）颁发的机构授权。所有使用斑马鱼胚胎的实验都按照东芬兰省政府、坦佩雷地区服务部社会和卫生部协议——LSLH-2007-7254/Ym-23进行。

1. 设置夜间斑马鱼交配罐

1. 将2-5只成年雄性斑马鱼和3-5只成年雌性斑马鱼放入交配池过夜。（在早晨由自动黑暗和光循环诱导过夜）。
2. 设置几个十字架，以获得足够的胚胎来评估两种以上化合物的毒性。为了评估毒性，每个浓度至少需要20个^胚胎23个。
3. 为了避免处理动物的压力，让动物休息2周，然后使用相同的个体进行繁殖。

2. 收集胚胎和准备板以接触化合物

1. 收集胚胎，第二天中午前，使用细网滤网，并移植到含有E3胚胎培养基[5.0 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂， 0.33 mM MgSO_4，和0.1% w/v甲基蓝] 。
2. 使用塑料巴斯德移液器清除碎屑（例如食品和固体废物）。在立体显微镜下检查每批胚胎，以取出未受精/死亡的胚胎（由其不透明外观识别）。
3. 将胚胎保持在28.5°C的培养箱中。第二天早上，在立体显微镜下检查胚胎，取出任何不健康或死亡的胚胎。此外，用新鲜的 E3 介质替换旧的 E3 介质。
   注:斑马鱼胚胎在实验室条件下始终保持在28.5°C。
4. 小心地将1个胚胎移植到含有足够E3介质的24孔板的每个孔中，以覆盖胚胎。

3. 化合物库存溶液的制剂和稀释化合物在井中的分布

1. 拿出储存在4°C处的含有抑制剂化合物的瓶。
   注:根据化合物的特性，这些储存在不同的温度下。
2. 使用可精确称量几毫克（毫克）的分析平衡来称称化合物。
3. 根据化合物的溶解度特性，在适当的溶剂中为每个化合物（例如E3水或二甲基硫酸盐（DMSO）制备至少250μL（100 mM）的库存溶液。
   注:上述步骤可在实验开始前一天在方便的时候完成，并储存在4°C）。
4. 在 15 mL 离心管中使用 E3 水对库存溶液进行连续稀释（例如，10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、300 μM 和 500 μM）。
   注:连续稀释的浓度和数量因化合物的不同而不同，具体取决于其毒性水平。
5. 从含有胚胎的24个孔板中取出E3水，使用巴斯德移液器和1mL移液器（包含1个dpf胚胎）一次一排。
6. 将每口井中每口稀释剂的1 mL（从较低开始，移动到更高浓度）分配到24孔板的孔中。
7. 从同一批胚胎中设置一个对照组，并添加相应数量的稀释剂。
8. 将24孔板标上化合物的名称和浓度，并将板保持在28.5°C的培养箱中。

4. 使用立体显微镜对胚胎进行体形分析和成像

1. 在接触化合物后24小时，在立体显微镜下检查胚胎的参数。
   1. 注意参数，如死亡率，孵化，心跳，使用蛋黄袋，游泳膀胱发展，鱼的运动，心包水肿，和身体^{的形状23。}
   2. 将接触于化合物每种浓度的幼虫，用金属探针侧身放在含有3%高分子量甲基纤维素的小培养皿中。
      注:3%甲基纤维素（高分子带）是嵌入鱼类所需的粘性液体，具有进行显微检查所需的方向。为了将鱼定向到这种液体中，需要一个金属探头。
   3. 使用连接到相机的立体显微镜拍摄图像。每天将图像保存在单独的文件夹中，直到实验结束。
   4. 每天在联机表中或打印的工作表中输入表中的所有观测值。
   5. 如果化合物是神经毒性的，4到5 dpf幼虫可能显示改变的游泳模式，通过捕捉显示异常运动模式的幼虫的短视频（30秒至1分钟）来记录这种变化。
   6. 接触化合物5天后，注意一半的胚胎死亡浓度，以计算每种化学品的半最大致命浓度50（LC_50）。
      注:LC₅₀是50%的胚胎在接触化合物5天后死亡的浓度。使用至少20个胚胎来测试每个浓度^化合物23的毒性。
   7. 使用合适的程序构建胚胎所有浓度的死亡率曲线。

结果

毒性评价的关键部分是在一个实验中测试一种或多种化合物的不同浓度。在开始时，选择用于评估毒性的化合物，测试每种化合物的浓度数量，并据此制作一个图表（图3）。我们为每个化合物使用独特的颜色来组织样品（图3）。使用耐溶剂标记和在板的底部或侧面的标签是重要的，以避免以后的混合。 如果化合物诱导接触不...

讨论

使用培养细胞进行体外毒性试验，可以检测细胞的生存和形态学研究，提供有关试验化合物引起的毒性的有限信息。利用斑马鱼胚胎对化合物进行毒性筛选的优点是，在相关模型生物体胚胎发育过程中，可快速检测整个动物的化学诱导型态变化。大约70%的蛋白质编码人类基因在斑马鱼基因组^中具有正交对应物。控制信号转导和发育的遗传途径在人和斑马^鱼26

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well plates	Nunc	Thermo Scientific
Balance (Weighing scale)	KERN	PLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)	Mettler Toledo	AB104-S/PH
CaCl2	JT.Baker	RS421910024
Disecting Probe	Thermo Scientific	17-467-604
DMSO	Sigma Aldrich, Germany	D4540
Falcon tubes 15 mL	Greiner bio-one	188271
High molecular weight methylcellulose	Sigma Aldrich, Germany	M0262
Incubator for zebrafish larvae	Termaks	B8000
KCL	Merck	1.04936.0500
Methyl Blue	Sigma Aldrich, Germany	28983-56-4
MgSO4	Sigma Aldrich, Germany	M7506
Microcentrifuge tubes	Starlab	S1615-5500
NaCl	VWR Chemicals	27810.295
Paraffin Histoplast IM	Thermo Scientific	8331
Pasteur pipette	Sarstedt	86.1171
Petri dish	Thermo Scientific	101R20
Petri plates	Sarstedt	82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)	Thermo Scientific	4641230N, 4641210N
Plates 24-Well	Thermo Scientific	142485
Steriomicroscope/Camera	Zeiss	Stemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)	Fisherbrand	11569914
Zebrafish AB strains	ZIRC	ZL1