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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Los embriones de pez cebra se utilizan para evaluar la toxicidad de los compuestos químicos. Se desarrollan externamente y son sensibles a los productos químicos, lo que permite la detección de cambios fenotípicos sutiles. El experimento sólo requiere una pequeña cantidad de compuesto, que se añade directamente a la placa que contiene embriones, haciendo que el sistema de prueba sea eficiente y rentable.

Resumen

El pez cebra es un organismo modelo de vertebrados ampliamente utilizado para la enfermedad y el descubrimiento de fármacos basados en fenotipos. El pez cebra genera muchos vástagos, tiene embriones transparentes y un rápido desarrollo externo. Por lo tanto, los embriones de pez cebra también pueden utilizarse para la evaluación rápida de la toxicidad de los medicamentos que son preciosos y están disponibles en pequeñas cantidades. En el presente artículo, se describe un método para el cribado eficiente de la toxicidad de los compuestos químicos utilizando embriones postfecatización de 1-5 días. Los embriones son monitoreados por estereomicroscopio para investigar los defectos fenotípicos causados por la exposición a diferentes concentraciones de compuestos. También se determinan las concentraciones letales medias máximas (LC50) de los compuestos. El presente estudio requirió 3-6 mg de un compuesto inhibidor, y todo el experimento toma alrededor de 8-10 h para ser completado por un individuo en un laboratorio que tiene instalaciones básicas. El protocolo actual es adecuado para probar cualquier compuesto para identificar efectos tóxicos o fuera del objetivo intolerables del compuesto en la fase temprana del descubrimiento de fármacos y para detectar efectos tóxicos sutiles que pueden perderse en el cultivo celular u otros modelos animales. El método reduce los retrasos procesales y los costos del desarrollo de medicamentos.

Introducción

El desarrollo de medicamentos es un proceso costoso. Antes de que un solo compuesto químico sea aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) varios miles de compuestos se examinan a un costo de más de mil millones de dólares1. Durante el desarrollo preclínico, la mayor parte de este costo es necesaria para las pruebas con animales2. Para limitar los costos, los investigadores en el campo del desarrollo de fármacos necesitan modelos alternativos para el control de seguridad de los compuestos químicos3. Por lo tanto, en la fase temprana del desarrollo del fármaco, sería muy beneficioso utilizar un método que puede evaluar rápidamente la seguridad y toxicidad de los compuestos en un modelo adecuado. Existen varios protocolos que se han utilizado para el cribado de toxicidad de compuestos químicos que involucran modelos decultivo animal y celular, pero no hay un solo protocolo que se valide y sea de uso común 4,5. Los protocolos existentes que utilizan peces cebra varían en longitud y han sido utilizados por investigadores individuales que evaluaron la toxicidad según su requisito de conveniencia6,7,8,9, 10 , 11 , 12.

En el pasado reciente, el pez cebra ha surgido como un modelo conveniente para la evaluación de la toxicidad de los compuestos químicos durante el desarrollo embrionario6,7. El pez cebra tiene muchas ventajas incorporadas para la evaluación de compuestos químicos13. Incluso los experimentos a gran escala son susceptibles, ya que una hembra de pez cebra puede poner lotes de 200-300 huevos, que se desarrollan rápidamente exvivo, no necesitan alimentación externa hasta por una semana y son transparentes. Los compuestos se pueden añadir directamente en el agua, donde pueden (dependiendo de la naturaleza del compuesto) difundir a través del coro, y después de la eclosión, a través de la piel, branquias y boca de larvas. Los experimentos no requieren cantidades copiosas de compuestos químicos14 debido al pequeño tamaño del embrión. El desarrollo de embriones de pez cebra expresan la mayoría de las proteínas necesarias para lograr el resultado normal del desarrollo. Por lo tanto, un embrión de pez cebra es un modelo sensible para evaluar si un fármaco potencial puede perturbar la función de una proteína o molécula de señalización que es significativa desde el desarrollo. Los órganos del pez cebra se vuelven funcionales entre 2-5 dpf15,y los compuestos que son tóxicos durante este período sensible de desarrollo embrionario inducen defectos fenotípicos en larvas de peces cebra. Estos cambios fenotípicos se pueden detectar fácilmente utilizando un microscopio simple sin técnicas invasivas11. Los embriones zebrafish son ampliamente utilizados en la investigación toxicológica debido a su complejidad biológica mucho mayor en comparación con el cribado in vitro de fármacos utilizando modelos de cultivo celular16,17.  Como vertebrado, la composición genética y fisiológica del pez cebra es comparable a lade los seres humanos y, por lo tanto, las toxicidades de los compuestos químicos son similares entre los peces cebra y los humanos 8,18,19, 20 , 21 , 22. Zebrafish es, por lo tanto, una herramienta valiosa en la fase temprana del descubrimiento de fármacos para la evaluación de la toxicidad y la seguridad de los compuestos químicos.

En el presente artículo, proporcionamos una descripción detallada del método utilizado para evaluar la seguridad y toxicidad de los compuestos inhibidores de la anhidrasa carbónica (CA) utilizando embriones de pez cebra post fecundación (dpf) de 1-5 días por un solo investigador. El protocolo consiste en exponer embriones de pez cebra a diferentes concentraciones de compuestos inhibidores químicos y estudiar la mortalidad y los cambios fenotípicos durante el desarrollo embrionario. Al final de la exposición a los compuestos químicos, se determina la dosis DE LC50 del producto químico. El método permite a un individuo llevar a cabo un cribado eficiente de 1-5 compuestos de prueba y toma alrededor de 8-10 h dependiendo de la experiencia de la persona con el método (Figura1). Cada uno de los pasos necesarios para evaluar la toxicidad de los compuestos se describe en la Figura2. La evaluación de la toxicidad de los inhibidores de CA requiere 8 días, e incluye la creación de pares de apareamiento (día 1); recogida de embriones de tanques de cría, limpiándolos y transfiriéndolos a la incubadora de 28,5oC (día 2); distribución de los embriones en los pocillos de una placa de 24 pocillos y adición de compuestos inhibidores de CA diluidos (día 3); análisis fenotípico e imágenes de larvas (día 4-8) y determinación de la dosis de LC50 (día8).  Este método es rápido y eficiente, requiere una pequeña cantidad del compuesto químico y sólo las instalaciones básicas del laboratorio.

Protocolo

La instalación central de pez cebra de la Universidad de Tampere cuenta con una autorización de establecimiento otorgada por la Junta Nacional de Experimentos Animales (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Todos los experimentos con embriones de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con el Gobierno Provincial de Finlandia Oriental, Departamento De Servicios Sociales y de Salud del Protocolo de la Unidad de Servicios Regionales de Tampere, LSLH-2007-7254/Ym-23.

1. Configuración de tanques de apareamiento de pez cebra durante la noche

  1. Coloque 2-5 peces cebra macho adultos y 3-5 peces cebra hembra adultos en tanques de apareamiento durante la noche. (La cría es inducida por la mañana por el ciclo automático de oscuridad y luz durante la noche).
  2. Establecer varios cruces para obtener suficientes embriones para evaluar la toxicidad de más de dos compuestos químicos. Para la evaluación de la toxicidad, cada concentración necesita un mínimo de 20 embriones23.
  3. Para evitar manejar el estrés a los animales, deje que los animales descansen durante 2 semanas antes de usar los mismos individuos para la cría.

2. Colección de embriones y placas de preparación para la exposición a los compuestos químicos

  1. Recoger los embriones, al día siguiente antes del mediodía, utilizando un colador de malla fina y transferirlos a una placa de Petri que contenga un medio embrionario E3 [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4y 0,1% p/v de azul de metileno].
  2. Retire los residuos con una pipeta Pasteur de plástico (por ejemplo, alimentos y residuos sólidos). Examine cada lote de embriones bajo el estereomicroscopio para eliminar los embriones no fecundados/muertos (identificados por su aspecto opaco).
  3. Mantener los embriones a 28,5 oC en una incubadora. Examine los embriones, a la mañana siguiente, bajo un estereomicroscopio y retire cualquier embrión insalubre o muerto. Además, sustituya el antiguo medio E3 por un medio E3 fresco.
    NOTA: Los embriones de pez cebra siempre se mantienen a 28,5 oC en condiciones de laboratorio.
  4. Transfiera cuidadosamente 1 embrión a cada pocil de una placa de 24 pocillos que contenga suficiente medio E3 para cubrir los embriones.

3. Preparaciones de la solución de stock de compuestos químicos y distribución de compuestos diluidos en los pozos

  1. Sacar los viales que contienen compuestos inhibidores almacenados a 4 oC.
    NOTA: Dependiendo de las propiedades del compuesto, estos se almacenan a diferentes temperaturas.
  2. Pesar el compuesto (s) utilizando una balanza analítica que puede pesar unos pocos miligramos (mg) del compuesto con precisión.
  3. Preparar al menos 250 ml (100 ml) de solución en stock para cada compuesto en un disolvente adecuado (por ejemplo, agua E3 o sulfóxido de dimetil (DMSO), basado en las propiedades de solubilidad de los compuestos.
    NOTA: Los pasos anteriores se pueden hacer un día antes del inicio del experimento en un momento conveniente y se almacenan a 4 oC).
  4. Realizar diluciones en serie de las soluciones de stock (p. ej., 10 m, 20 m, 50 m, 100 m, 150 m, 300 m y 500 m) utilizando agua E3 en tubos centrífugos de 15 ml.
    NOTA: Las concentraciones y el número de diluciones en serie varían de un compuesto a otro compuesto dependiendo de sus niveles de toxicidad.
  5. De los 24 embriones que contienen 24 pocillos, retire el agua E3 de los pozos utilizando una pipeta Pasteur y una pipeta de 1 ml (que contenga 1 dpf embriones) una fila a la vez.
  6. Distribuir 1 ml de cada diluyente en cada pocal (empezando por una concentración más baja y pasando a mayor concentración) en los pozos de la placa de 24 pocillos.
  7. Configure un grupo de control a partir del mismo lote de embriones y agregue la cantidad correspondiente de diluyente.
  8. Etiquetar las placas de 24 pocillos con el nombre y la concentración del compuesto y mantener las placas a 28,5 oC en una incubadora.

4. Análisis fenotípico e imágenes de los embriones utilizando un estereomicroscopio

  1. Examine los embriones bajo un estereomicroscopio para los parámetros 24 h después de la exposición a los compuestos químicos.
    1. Tenga en cuenta los parámetros tales como mortalidad, eclosión, latidos del corazón, utilización del saco de yema, desarrollo de la vejiga de natación, movimiento de los peces, edema pericárdico, y la forma del cuerpo23.
    2. Tome las larvas expuestas a cada concentración del compuesto y ponerlas lateralmente en una pequeña placa de Petri que contenga 3% de celulosa metilde alto peso molecular utilizando una sonda de metal.
      NOTA: La celulosa metimeta del 3% (alta molecular con) es un líquido viscoso necesario para incrustar al pez con la orientación necesaria para el examen microscópico. Para orientar a los peces en este líquido, se necesita una sonda de metal.
    3. Tome las imágenes usando estereomicroscopio conectado a una cámara. Guarde las imágenes en una carpeta independiente cada día hasta el final del experimento.
    4. Introduzca todas las observaciones de una tabla cada día en una tabla en línea o en una hoja impresa.
    5. Si los compuestos son neurotóxicos, las larvas de 4 a 5 dpf pueden mostrar un patrón de natación alterado, hacer un registro de tales cambios ya sea mediante la captura de un corto (30 s a 1 min) video de las larvas que exhiben un patrón de movimiento anormal.
    6. Después de 5 días de exposición a los compuestos químicos, observe la concentración en la que la mitad de los embriones mueren para calcular la concentración letal mediamáxima 50 (LC50)de cada producto químico.
      NOTA: La LC50 es la concentración en la que el 50% de los embriones mueren al final de 5 días de exposición a un compuesto químico. Utilizar un mínimo de 20 embriones para probar la toxicidad de cada concentración de un compuesto23.
    7. Construir una curva para la mortalidad de embriones para todas las concentraciones utilizando un programa adecuado.

Resultados

La parte crítica de la evaluación de la toxicidad es probar diferentes concentraciones de uno o varios compuestos químicos en un solo experimento. Al principio, seleccione los compuestos para la evaluación de la toxicidad, el número de concentraciones a probar para cada compuesto y, en consecuencia, haga un gráfico (Figura3). Usamos un color único para cada compuesto para organizar las muestras (Figura3). El uso de marcado...

Discusión

El ensayo de toxicidad in vitro utilizando células cultivadas puede detectar la supervivencia y los estudios morfológicos de las células proporcionando información limitada sobre la toxicidad inducida por el compuesto de ensayo. La ventaja del cribado de toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra es la detección rápida de cambios fenotípicos inducidos químicamente en todo un animal durante el desarrollo embrionario en un organismo modelo relevante. Aproximadamente el 70% de los gen...

Divulgaciones

Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Sigrid Juselius (SP, MP), la Fundación Cultural Finlandesa (AA, MH), la Academia de Finlandia (SP, MP), la Fundación Orion Farmos (MH), la Fundación Tampere Tuberculosis (SP, MH y MP) y la Fundación Jane y Aatos Erkko (SP y MP) ). Agradecemos a nuestros colaboradores italianos y franceses, el profesor Supuran y el profesor Winum, por proporcionar inhibidores de la anhidrasa carbónica para la evaluación de la seguridad y la toxicidad con fines de desarrollo de fármacos contra la tuberculosis y contra el cáncer. Agradecemos a Aulikki Lehmus y Marianne Kuuslahti por la asistencia técnica. También agradecemos a Leena M'kinen y Hannaleena Piippo por su ayuda con la cría de peces cebra y la recolección de embriones. Agradecemos sinceramente a Harlan Barker por la evaluación crítica del manuscrito y comentarios perspicaces.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesNuncThermo Scientific
Balance (Weighing scale)KERNPLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT.BakerRS421910024
Disecting ProbeThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, GermanyD4540
Falcon tubes 15 mLGreiner bio-one188271
High molecular weight methylcelluloseSigma Aldrich, GermanyM0262 
Incubator for zebrafish larvaeTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Methyl BlueSigma Aldrich, Germany28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, GermanyM7506
Microcentrifuge tubesStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemicals27810.295
Paraffin Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteur pipette Sarstedt86.1171
Petri dishThermo Scientific101R20 
Petri platesSarstedt82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)Thermo Scientific4641230N, 4641210N  
Plates 24-WellThermo Scientific142485
Steriomicroscope/CameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB strainsZIRC   ZL1 

Referencias

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