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요약

Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.

초록

제브라피쉬는 질병 및 표현형 기반 약물 발견을 위해 널리 사용되는 척추동물 모델 유기체이다. 얼룩말 물고기는 많은 자손을 생성, 투명 한 배아와 빠른 외부 개발. 따라서 Zebrafish 배아는 소중하고 소량으로 사용할 수 있는 약물의 독성을 신속하게 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 본 기사에서는, 1-5일 후 수정 배아를 이용한 화학 화합물의 독성을 효율적으로 스크리닝하는 방법에 대해 설명한다. 배아는 화합물의 다른 농도에 노출에 기인한 현상형 결함을 조사하기 위하여 입체 현미경에 의해 감시됩니다. 화합물의 반 최대 치명적인농도 (LC 50)도 결정 됩니다. 본 연구는 억제제 화합물의 3-6 mg을 요구했으며, 전체 실험은 기본 시설을 갖는 실험실에서 개인에 의해 완료되기까지 약 8-10 시간이 소요됩니다. 현재 프로토콜은 약물 발견의 초기 단계에서 화합물의 참을 수 없는 독성 또는 오프 타겟 효과를 식별하고 세포 배양 또는 다른 동물 모델에서 놓칠 수 있는 미묘한 독성 효과를 검출하기 위해 임의의 화합물을 테스트하는 데 적합하다. 이 방법은 절차 지연 및 약물 개발 비용을 줄입니다.

서문

약물 개발은 비용이 많이 드는 과정입니다. 단일 화학 화합물이 식품 의약국 (FDA)과 유럽 의약품 기구 (EMA)에 의해 승인되기 전에 수천 개의화합물이 10 억 달러 이상의 비용으로 선별됩니다 1. 전임상 개발 동안, 이 비용의 가장 큰 부분은동물 실험에 필요한 2. 비용을 제한하기 위해, 약물 개발 분야의 연구자들은 화학 화합물의 안전성 스크리닝을위한 대체 모델이 필요합니다 3. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서, 적합한 모델에서 화합물의 안전성 및 독성을 신속하게 평가할 수 있는 방법을 사용하는 것이 매우 유익할 것이다. 동물 및 세포 배양 모델을 포함하는 화학 화합물의 독성 스크리닝에 사용되는 여러 프로토콜이 있지만 검증되고 공통사용되는단일 프로토콜은 없다 4,5. zebrafish를 이용한 기존 프로토콜은 길이가 다양하며 편의요건6, 7,8,9에 따라 독성을 평가한 개별 연구자들이 사용하고 있습니다. 10개 , 11세 , 12.

최근, 제브라피쉬는 배아 개발 시 화학물질의 독성을 평가하는 편리한 모델로 대두되어있다6,7. 제브라피쉬는 화학화합물(13)의 평가에많은 내장장점을 갖는다. 심지어 대규모 실험은 제브라피쉬 여성이 200-300 개의 계란을 배치 할 수 있기 때문에 급속하게 생체 내생체 내에서 발달할 수 있으며 최대 1 주일 동안 외부 먹이가 필요하지 않으며 투명합니다. 화합물은 물 속으로 직접 첨가 될 수 있으며, 여기서 (화합물의 특성에 따라) 융모를 통해 확산되고 부화 후 피부, 아가미 및 유충의 입을 통해 확산 될 수 있습니다. 실험은 배아의 작은 크기 로 인해 풍부한 양의 화학 화합물(14)을 필요로하지 않는다. 제브라피시 배아를 개발하는 것은 정상적인 발달 결과를 달성하는 데 필요한 대부분의 단백질을 표현합니다. 따라서, 제브라피쉬 배아는 잠재적인 약물이 발달적으로 유의한 단백질 또는 신호 분자의 기능을 방해할 수 있는지 여부를 평가하는 민감한 모델이다. 제브라피쉬의 장기는 2-5 dpf15사이의 기능적이 되고, 배아 발달의 이 민감한 기간 동안 독성이 있는 화합물은 제브라피시 유충의 현상형 결함을 유발한다. 이러한 현상형 변화는 침습적 기술11없이 간단한 현미경을 사용하여 쉽게 검출될 수 있다. Zebrafish 배아는 세포 배양 모델16,17을사용하여 시험관내 약물 스크리닝에 비해 훨씬 더 큰 생물학적 복잡성으로 인해 독성 연구에서 널리 사용된다.  척추동물로서, 제브라피쉬의 유전적, 생리학적 구성은 인간과 비교할 수 있으며, 따라서 화학물질의 독성은 제브라피시와 인간8,18,19, 20개 , 21세 , 22. Zebrafish는, 따라서, 화학 화합물의 독성 및 안전성의 평가를 위한 약물 발견의 초기 단계에서 귀중한 도구이다.

본 기사에서는, 단일 연구자가 1-5일 후 수정(dpf) 제브라피시 배아를 사용하여 탄산 무수효소(CA) 억제제 화합물의 안전성 및 독성을 평가하는 데 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 프로토콜은 화학 억제제 화합물의 다른 농도에 제브라피시 배아를 노출하고 배아 발달 도중 사망과 현상형 변경을 공부하는 관련시킵니다. 화학 화합물에 대한 노출이 끝나면, 화학 물질의 LC50 투여량이 결정된다. 이 방법은 개인이 1-5 개의 시험 화합물을 효율적으로 선별 할 수 있게하고 방법을 가진 사람의 경험에따라 약 8-10 시간이 걸립니다 (그림 1). 화합물의 독성을 평가하는 데 필요한 각 단계는 도2에 설명되어 있다. CA 억제제의 독성 평가는 8 일이 필요하며, 짝짓기 쌍의 설정 (1 일째)을 포함한다; 사육 탱크에서 배아의 수집, 청소 및 28.5 °C 인큐베이터로 전송 (2 일); 24 웰 플레이트의 우물에 배아의 분포와 희석 CA 억제제 화합물의 추가 (3 일째); 유충의 phenotypic 분석 및 이미징 (일 4-8), LC의 결정50 투여량 (day8).  이 방법은 신속하고 효율적이며 소량의 화학 화합물과 실험실의 기본 시설만 필요합니다.

프로토콜

탐페레 대학의 제브라피시 핵심 시설은 국립 동물 실험 위원회(ESAVI/7975/04.10.05/2016)에서 부여한 설립 허가를 받았습니다. 제브라피시 배아를 이용한 모든 실험은 핀란드 동부 지방 정부, 탐페레 지역 서비스 단위 프로토콜의 사회 보건부에 따라 수행되었다 # LSLH-2007-7254/Ym-23.

1. 하룻밤 얼룩말 짝짓기 탱크 의 설정

  1. 2-5 성인 수컷 얼룩말과 3-5 성인 암컷 얼룩말어를 하룻밤 짝짓기 탱크에 넣습니다. (사육은 밤새 자동 어둡고 가벼운 사이클에 의해 아침에 유도된다).
  2. 두 개 이상의 화학 화합물의 독성을 평가하기위한 충분한 배아를 얻기 위해 여러 십자가를 설정합니다. 독성평가를 위해, 각 농도는 최소 20개의 배아23을필요로 한다.
  3. 동물에게 스트레스를 받지 않으려면, 동물이 번식을 위해 동일한 개인을 사용하기 전에 2 주 동안 휴식을 취하도록 하십시오.

2. 배아 수집 및 화학 화합물에 대한 노출을위한 플레이트 준비

  1. 배아를 수집, 다음날 정오, 미세 메쉬 여과기를 사용하여 E3 배아 배지 [5.0 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4,및 0.1% w/v 메틸렌 블루]를 포함하는 페트리 접시에 옮니다.
  2. 플라스틱 파스퇴르 파이펫(예: 음식물 및 고체 폐기물)을 사용하여 이물질을 제거합니다. 스테레오현미경 의 밑에 배아의 각 배치를 검토하여 비수정/죽은 배아를 제거합니다(불투명한 외관으로 확인됨).
  3. 배아를 인큐베이터에 28.5°C로 유지합니다. 다음날 아침, 입체 현미경으로 배아를 검사하고 건강에 해롭거나 죽은 배아를 제거하십시오. 또한 기존 E3 매체를 신선한 E3 매체로 교체하십시오.
    참고: 얼룩말 배아는 항상 실험실 조건하에서 28.5 °C에서 유지됩니다.
  4. 1개의 배아를 배아를 덮기 위하여 충분한 E3 배지를 포함하는 24 웰 플레이트의 각 우물으로 조심스럽게 옮기는다.

3. 화학 화합물의 주식 용액 준비 및 희석 화합물을 우물에 분배

  1. 4°C에 저장된 억제제 화합물을 함유하는 바이알을 꺼내.
    참고: 화합물의 특성에 따라 다른 온도에서 저장됩니다.
  2. 화합물의 몇 밀리그램 (mg)을 정확하게 계량 할 수있는 분석 균형을 사용하여 화합물을 계량하십시오.
  3. 화합물의 용해도 특성에 기초하여 적절한 용매(예를 들어, E3 물 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 각 화합물에 대해 적어도 250 μL(100 mM)의 스톡 용액을 준비한다.
    참고: 위의 단계는 편리한 시간에 실험시작 하루 전에 4 °C에 보관할 수 있습니다.
  4. 15 mL 원심분리튜브에서 E3 물을 사용하여 스톡 솔루션(예: 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 150 μM, 500 μM)의 직렬 희석을 만듭니다.
    참고: 농도 및 일련 희석의 수는 독성 수준에 따라 하나의 화합물에서 다른 화합물에 따라 다릅니다.
  5. 배아를 함유하는 24개의 웰 플레이트에서, 파스퇴르 피펫과 1 mL 파이펫(1 dpf 배아 를 함유함)을 사용하여 우물에서 E3 물을 한 번에 제거한다.
  6. 각 우물에 각 희석제 1 mL을 분배하십시오 (낮은 곳에서 시작하여 더 높은 농도로 이동)를 24 웰 플레이트의 우물에 분배하십시오.
  7. 동일한 배아 배치에서 대조군을 설정하고 해당 양의 희석제를 추가합니다.
  8. 화합물의 이름과 농도를 가진 24웰 플레이트에 라벨을 부착하고 플레이트를 인큐베이터에 28.5°C로 유지한다.

4. 입체 현미경을 사용하여 배아의 현상형 분석 및 이미징

  1. 화학 화합물에 노출 된 후 매개 변수 24 시간 동안 입체 현미경으로 배아를 검사하십시오.
    1. 사망률, 부화, 심장 박동, 노른자 자루의 활용, 수영 방광 발달, 물고기의 움직임, 심낭 부종 및 신체 모양(23)과같은 매개 변수를 주목한다.
    2. 화합물의 각 농도에 노출된 애벌레를 취하여 금속 프로브를 사용하여 3% 고분자량 메틸 셀룰로오스를 함유하는 작은 페트리 접시에 옆으로 놓는다.
      참고: 3 % 메틸 셀룰로오스 (고분자)는 미세한 검사에 필요한 방향으로 물고기를 포함시키는 데 필요한 점성 액체입니다. 이 액체에서 물고기의 방향을 지정하려면 금속 프로브가 필요합니다.
    3. 카메라에 부착된 스테레오현미경을 사용하여 이미지를 찍습니다. 실험이 끝날 때까지 매일 별도의 폴더에 이미지를 저장합니다.
    4. 매일 테이블이나 인쇄된 시트에 모든 관측작은 테이블에 입력합니다.
    5. 화합물이 신경 독성인 경우, 4 내지 5 dpf 애벌레는 변경된 수영 패턴을 보여줄 수 있고, 비정상적인 운동 패턴을 나타내는 유충의 짧은(30 내지 1분) 비디오를 캡처하여 그러한 변화의 기록을 만들 수 있다.
    6. 화학 화합물에 5 일 동안 노출 된 후, 배아의 절반이 각 화학 물질의 절반 최대치명적인 농도 50 (LC 50)을 계산하기 위해 죽는 농도를 주목하십시오.
      참고: LC50은 배아의 50 %가 화학 화합물에 노출 된 5 일 후에 죽는 농도입니다. 화합물23의각 농도의 독성을 시험하기 위해 최소 20개의 배아를 사용한다.
    7. 적합한 프로그램을 사용하여 모든 농도에 대한 배아의 사망률에 대한 곡선을 구성합니다.

결과

독성 평가의 중요한 부분은 단일 실험에서 하나 또는 여러 화학 화합물의 서로 다른 농도를 테스트하는 것입니다. 처음에는, 독성평가를 위한 화합물을 선택하고, 각 화합물에 대해 시험할 농도의 수를, 그에 따라, 차트를 만든다(도 3). 우리는 샘플을 구성하기 위해 각 화합물에대한 고유 한 색상을 사용했다 (그림 3). 나중에 혼...

토론

배양된 세포를 이용한 시험관내 독성 시험은 시험 화합물에 의해 유도된 독성에 대한 제한된 정보를 제공하는 세포의 생존 및 형태학적 연구를 검출할 수 있다. 제브라피시 배아를 이용한 화학 화합물의 독성 스크리닝의 장점은 관련 모델 유기체에서 배아 개발 동안 전체 동물에서 화학적으로 유도된 현상형 변화를 신속하게 검출하는 것이다. 단백질 코딩 인간 유전자의 약 70%는 제브라피?...

공개

저자에 의해 잠재적 인 이해 상충이보고되지 않았습니다.

감사의 말

이 작품은 시그리드 주셀리우스 재단(SP, MP), 핀란드 문화 재단(AA, MH), 핀란드 아카데미(SP, MP), 오리온 파노스 재단(MH), 탐페레 결핵 재단(SP, MH 및 MP), 제인 과 아토스 에르코 재단(SP 및 MP)의 보조금으로 지원되었습니다. ). 우리는 항결핵 및 항암 제 개발 목적을 위한 안전성 및 독성 평가를 위한 탄산 아수드라아제 억제제를 제공한 이탈리아와 프랑스 협력자, 수푸란 교수 및 Winum 교수에게 감사드립니다. 아울릭키 레무스와 마리안 쿠슬라티에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 제브라피시 사육과 배아 수집에 도움을 준 리나 메키넨과 한날리나 피포에게 감사를 표합니다. 우리는 진심으로 원고와 통찰력있는 의견의 비판적 평가 할란 바커에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesNuncThermo Scientific
Balance (Weighing scale)KERNPLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT.BakerRS421910024
Disecting ProbeThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, GermanyD4540
Falcon tubes 15 mLGreiner bio-one188271
High molecular weight methylcelluloseSigma Aldrich, GermanyM0262 
Incubator for zebrafish larvaeTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Methyl BlueSigma Aldrich, Germany28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, GermanyM7506
Microcentrifuge tubesStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemicals27810.295
Paraffin Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteur pipette Sarstedt86.1171
Petri dishThermo Scientific101R20 
Petri platesSarstedt82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)Thermo Scientific4641230N, 4641210N  
Plates 24-WellThermo Scientific142485
Steriomicroscope/CameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB strainsZIRC   ZL1 

참고문헌

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