АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Эмбрионы зебры используются для оценки токсичности химических соединений. Они развиваются внешне и чувствительны к химическим веществам, что позволяет обнаруживать тонкие фенотипические изменения. Эксперимент требует лишь небольшого количества соединения, которое непосредственно добавляется в пластину, содержащую эмбрионы, что делает систему тестирования эффективной и рентабельной.

Аннотация

Зебрафиш является широко используемой позвоночной модели организма для болезни и фенотипа основе открытия наркотиков. Зебрафиш генерирует много потомства, имеет прозрачные эмбрионы и быстрое внешнее развитие. Таким образом, эмбрионы зебры могут также использоваться для быстрой оценки токсичности препаратов, которые являются ценными и доступны в небольших количествах. В настоящей статье описан метод эффективного скрининга токсичности химических соединений с использованием 1-5-дневных эмбрионов после оплодотворения. Эмбрионы контролируются стереомикроскопом для исследования фенотипических дефектов, вызванных воздействием различных концентраций соединений. Половина максимальных концентраций летальных (LC50) соединений также определены. Настоящее исследование требует 3-6 мг ингибиторного соединения, и весь эксперимент занимает около 8-10 ч, чтобы быть завершена человеком в лаборатории, имеющей основные средства. Текущий протокол подходит для тестирования любого соединения для выявления невыносимых токсичных или вне целевых эффектов соединения на ранней стадии обнаружения наркотиков и для обнаружения тонких токсических эффектов, которые могут быть пропущены в культуре клеток или других животных моделей. Метод сокращает процедурные задержки и затраты на разработку лекарств.

Введение

Разработка лекарств является дорогостоящим процессом. Прежде чем одно химическое соединение одобрено Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) несколько тысяч соединений проверяются на сумму более одного миллиарда долларов1. Во время доклинической разработки, большая часть этой стоимости требуется для тестирования на животных2. Чтобы ограничить затраты, исследователям в области разработки лекарств необходимы альтернативныемодели для скрининга безопасности химических соединений 3. Поэтому на ранней стадии разработки препарата было бы очень полезно использовать метод, который может быстро оценить безопасность и токсичность соединений в подходящей модели. Есть несколько протоколов, которые были использованы для скрининга токсичности химических соединений с участием животных и клеточных моделей культуры, но нет ни одного протокола, который проверяется и является общим использованием4,5. Существующие протоколы с использованием зебры различаются по длине и былииспользованы отдельными исследователями, которые оценили токсичность в соответствии с их требованиями удобства 6,7,8,9, 10 Лет , 11 Год , 12.

В недавнем прошлом, зебрафиш стала удобной моделью для оценки токсичностихимических соединений во время эмбрионального развития 6,7. Зебрафиш имеет много встроенных преимуществ для оценки химических соединений13. Даже крупномасштабные эксперименты поддаются, так как самка зебры может откладывать партии по 200-300 яиц, которые быстро развиваются ex vivo,не нуждаются во внешнем кормлении до недели и прозрачны. Соединения могут быть добавлены непосредственно в воду, где они могут (в зависимости от характера соединения) диффундировать через хорион, и после вылупления, через кожу, жабры и рот личинок. Эксперименты не требуют большого количества химических соединений14 из-за небольшого размера эмбриона. Развитие эмбрионов зебры выражает большинство белков, необходимых для достижения нормального результата развития. Таким образом, эмбрион зебры является чувствительной моделью для оценки того, может ли потенциальный препарат нарушить функцию белка или сигнальной молекулы, которая имеет важное значение для развития. Органы зебры становятся функциональными между 2-5 dpf15, и соединения, которые являются токсичными в этот чувствительный период эмбрионального развития вызывают фенотипические дефекты в личинки зебры. Эти фенотипические изменения могут быть легко обнаружены с помощью простого микроскопа без инвазивных методов11. Эмбрионы зебрафиш широко используются в токсикологических исследованиях из-за их гораздо большей биологической сложности по сравнению с скринингом наркотиков in vitro с использованием моделей клеточной культуры16,17.  Как позвоночных, генетический и физиологический состав зебры сопоставим с человеком и, следовательно, токсичность химических соединений похожи между зебрафиши и людей8,18,19, 20 , 21 год , 22. Зебрафиш, таким образом, является ценным инструментом на ранней стадии открытия наркотиков для оценки токсичности и безопасности химических соединений.

В настоящей статье мы предоставляем подробное описание метода, используемого для оценки безопасности и токсичности соединений ингибитора углеродной анигидразы (CA) с использованием 1-5-дневного послеоплодного оплодотворения (dpf) эмбрионов зебры одним исследователем. Протокол включает в себя подвергая эмбрионы зебры различным концентрациям химических ингибиторных соединений и изучая смертность и фенотипические изменения во время эмбрионального развития. В конце воздействия химических соединений, LC50 доза химического вещества определяется. Метод позволяет человеку проводить эффективный скрининг 1-5 испытательных соединений и занимает около 8-10 ч в зависимости от опыта человека с методом(рисунок 1). Каждый из шагов, необходимых для оценки токсичности соединений, изложен на рисунке 2. Оценка токсичности ингибиторов ЦА требует 8 дней и включает в себя настройку спаривающихпар (день 1); сбор эмбрионов из резервуаров для размножения, очистка и перенос их в инкубатор 28,5 градуса по Цельсию (день 2); распределение эмбрионов в колодцы 24-колодца пластины и добавление разбавленных ингибиторных соединений CA (день 3); фенотипический анализ и визуализация личинок (день 4-8), а также определение дозы LC50 (день8).  Этот метод является быстрым и эффективным, требует небольшого количества химического соединения и только основные средства лаборатории.

протокол

Основной объект "Зебрафиш" в Университете Тампере имеет разрешение на создание, выдаваемый Национальным советом по эксперименту на животных (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Все эксперименты с использованием эмбрионов зебры проводились в соответствии с провинциальным правительством Восточной Финляндии, Департаментом социального и медицинского департамента Тампере регионального обслуживания протокола LSLH-2007-7254/Ym-23.

1. Настройка Ночь Зебрафиш спаривания танков

  1. Поместите 2-5 взрослых самцов зебры и 3-5 взрослых самок зебры в брачных резервуарах на ночь. (Разведение индуцируется утром автоматическим темным и светлым циклом на ночь).
  2. Установите несколько крестов, чтобы получить достаточно эмбрионов для оценки токсичности более чем двух химических соединений. Для оценки токсичности, каждой концентрации необходимо как минимум 20 эмбрионов23.
  3. Чтобы избежать стресса для животных, дайте животным отдохнуть в течение 2 недель, прежде чем использовать те же лица для размножения.

2. Сбор эмбрионов и подготовка пластин для воздействия химических соединений

  1. Соберите эмбрионы, на следующий день до полудня, используя тонкой сетки ситечко и передать их на чашку Петри, содержащую E3 эмбриона среднего 5,0 мм NaCl, 0,17 мм KCl, 0,33 мм CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, и 0,1% w/v Метилене Blue "
  2. Удалите мусор с помощью пластиковой пипетки Pasteur (например, продуктов питания и твердых отходов). Изучите каждую партию эмбрионов под стереомикроскопом, чтобы удалить неоплодотворенные/мертвые эмбрионы (идентифицированные по их непрозрачному внешнему виду).
  3. Храните эмбрионы при 28,5 градуса цельсия в инкубаторе. Изучите эмбрионы на следующее утро под стереомикроскопом и удалите любые нездоровые или мертвые эмбрионы. Кроме того, заменить старый E3 среды со свежим E3 среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы зебрафиш всегда поддерживаются при 28,5 градуса х в лабораторных условиях.
  4. Тщательно перенесите 1 эмбрион в каждый колодец из 24-колодца пластины, содержащей достаточно E3 среды для покрытия эмбрионов.

3. Подготовка стокового раствора химических соединений и распределение разбавленного соединения в скважинах

  1. Вынизить флаконы, содержащие ингибиторные соединения, хранящиеся при 4 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от свойств соединения, они хранятся при различных температурах.
  2. Взвесьте соединение (ы) с помощью аналитического баланса, который может весить несколько миллиграммов (мг) соединения точно.
  3. Подготовьте не менее 250 кЛ (100 мМ) запасного раствора для каждого соединения в соответствующем растворителе (например, вода Е3 или диметилсульксид (ДМСО), основываясь на свойствах растворимости соединений.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные шаги могут быть сделаны за день до начала эксперимента в удобное время и хранятся при 4 градусах Цельсия).
  4. Сделать серийное разбавление стоковых растворов (например, 10 мкм, 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 150 мкм, 300 мкм и 500 мкм) с помощью воды E3 в 15 мл центрифуговых труб.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации и количество серийных разбавлений варьируются от одного соединения к другому в зависимости от их уровня токсичности.
  5. Из 24 хорошо пластины, содержащей эмбрионы, удалить E3 воды из колодцев с помощью пастера пипетка и 1 мл пипетка (содержащая 1 dpf эмбрионов) один ряд за один раз.
  6. Распределите по 1 мл каждого разбавителя в каждом колодце (начиная от нижней и переходной к более высокой концентрации) в колодцы 24-хорошей пластины.
  7. Настройте контрольную группу из той же партии эмбрионов и добавьте соответствующее количество разбавив.
  8. Наклейте 24-колодные пластины с названием и концентрацией соединения и держите пластины на уровне 28,5 градусов по Цельсию в инкубаторе.

4. Фенотипический анализ и визуализация эмбрионов с помощью стереомикроскопа

  1. Изучить эмбрионы под стереомикроскопом по параметрам 24 ч после контакта с химическими соединениями.
    1. Обратите внимание на такие параметры, как смертность, вылупление, сердцебиение, использование желточного мешка, развитие плавательного пузыря, движение рыбы, отек перикардиала, и форма тела23.
    2. Возьмите личинки подвергаются каждой концентрации соединения и положить их боком в небольшой чашке Петри, содержащей 3% высокий молекулярный вес метилцеллюлозы с помощью металлического зонда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 3% метилцеллюлозы (высокий молекулярный с) является вязкой жидкости, необходимой для встраивания рыбы с необходимой ориентацией для микроскопического исследования. Для ориентации рыбы в этой жидкости необходим металлический зонд.
    3. Возьмите изображения с помощью стереомикроскопа, прикрепленного к камере. До конца эксперимента сохраняя изображения в отдельной папке каждый день.
    4. Введите все наблюдения в таблице каждый день либо в онлайн-стол или на печатном листе.
    5. Если соединения являются нейротоксическими, 4 до 5 dpf личинки могут показать измененный шаблон плавания, сделать запись таких изменений либо путем захвата короткий (30 с до 1 мин) видео личинок, демонстрирующих ненормальные движения картины.
    6. После 5 дней воздействия химических соединений, обратите внимание на концентрацию, при которой половина эмбрионов умирают для расчета половины максимальной смертельной концентрации 50 (LC50) каждого химического вещества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: LC50 является концентрация, при которой 50% эмбрионов умирают в конце 5 дней воздействия химического соединения. Используйте минимум 20 эмбрионов для проверки токсичности каждой концентрации соединения23.
    7. Постройте кривую смертности эмбрионов для всех концентраций с помощью подходящей программы.

Результаты

Важнейшей частью оценки токсичности является тестирование различных концентраций одного или нескольких химических соединений в рамках одного эксперимента. В начале, выберите соединения для оценки токсичности, количество концентраций для проверки для каждого соеди...

Обсуждение

Тест на токсичность in vitro с использованием культивированных клеток может обнаружить выживаемость и морфологические исследования клеток, предоставляющих ограниченную информацию о токсичности, индуцированной испытательным соединением. Преимуществом скрининга токсичности химич...

Раскрытие информации

О каком-либо потенциальном конфликте интересов авторы не сообщали.

Благодарности

Работа была поддержана грантами Фонда Сигрида Джузелиуса (SP, MP), Финского культурного фонда (AA, MH), Академии Финляндии (SP, MP), Фонда Ориона Фармоса (MH), Фонда тампере туберкулеза (SP, MH и MP) и Фонда Джейн и Аатоса Эркко (SP and MP ). Мы благодарим наших итальянских и французских коллег, профессора Супурана и профессора Винама, за предоставление ингибиторов углеродной анигидраззы для оценки безопасности и токсичности для целей разработки противотуберкулезных и противораковых препаратов. Мы благодарим Ауликки Лемуса и Марианну Кууслахти за техническую помощь. Мы также благодарим Лину Мякинен и Ханналину Пииппо за помощь в разведении зебры и сборе эмбрионов. Мы искренне благодарим Харлана Баркера за критическую оценку рукописи и глубокие комментарии.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
24-well platesNuncThermo Scientific
Balance (Weighing scale)KERNPLJ3000-2CM
Balance (Weighing scale)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT.BakerRS421910024
Disecting ProbeThermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, GermanyD4540
Falcon tubes 15 mLGreiner bio-one188271
High molecular weight methylcelluloseSigma Aldrich, GermanyM0262 
Incubator for zebrafish larvaeTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Methyl BlueSigma Aldrich, Germany28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, GermanyM7506
Microcentrifuge tubesStarlabS1615-5500
NaClVWR Chemicals27810.295
Paraffin Histoplast IMThermo Scientific8331
Pasteur pipette Sarstedt86.1171
Petri dishThermo Scientific101R20 
Petri platesSarstedt82.1473
Pipette (1 mL and 200 μL)Thermo Scientific4641230N, 4641210N  
Plates 24-WellThermo Scientific142485
Steriomicroscope/CameraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 color
Vials (1.5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB strainsZIRC   ZL1 

Ссылки

  1. Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
  2. Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M., Gupta, R. C. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. , 89-109 (2011).
  3. Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K. Alternative models in developmental toxicology. Systems Biology in Reproductive Medicine. 58 (1), 10-22 (2012).
  4. Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
  5. Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
  6. Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), 308-320 (2009).
  7. Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
  8. Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
  9. Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
  10. Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
  11. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
  12. Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
  13. Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
  14. Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
  15. Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
  16. Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
  17. Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
  18. Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , 62-87 (2003).
  19. Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
  20. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  21. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  22. Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
  23. Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
  24. Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
  25. Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
  26. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  27. Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
  28. Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
  29. Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

150in vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены