A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يصف هذا البروتوكول نماذج الماوس الترصيع وتقويم العظام من تكوين أورام الغدة الدرقية البشرية كمنصة لاختبار العلاجات المثبطة المستندة إلى microRNA. هذا النهج مثالي لدراسة وظيفة RNAs غير الترميز وإمكاناتها كأهداف علاجية جديدة.
تعتبر MicroRNAs (miRNAs) جهات تنظيمية هامة للتعبير الجيني من خلال قدرتها على زعزعة استقرار الحمض النووي الريبي وتثبيط ترجمة الـ mRNAs المستهدفة. وقد حدد عدد متزايد من الدراسات miRNAs كعلامات حيوية محتملة لتشخيص السرطان والتشخيص، وأيضا كأهداف علاجية، مضيفا بعدا إضافيا لتقييم السرطان والعلاج. في سياق سرطان الغدة الدرقية، ينتج التناسل الورمي ليس فقط من الطفرات في الجينات الهامة، ولكن أيضا من التعبير المفرط للعديد من miRNAs. وبناء على ذلك، فإن دور miRNAs في السيطرة على التعبير الجيني للغدة الدرقية يتطور كآلية هامة في السرطان. هنا، نقدم بروتوكول لدراسة آثار تسليم مثبطات ميرنا كطريقة علاجية في سرطان الغدة الدرقية باستخدام xenograft الورم البشري ونماذج الماوس التقويمي. بعد هندسة الخلايا السرطانية الدرقية مستقرة التعبير عن GFP وluciferase، يتم حقن الخلايا في الفئران عارية لتطوير الأورام، والتي يمكن أن يتبعها الإنارة الحيوية. تثبيط في الجسم الحي من ميرنا يمكن أن تقلل من نمو الورم upregulate أهداف الجينات ميرنا. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم أهمية ميرنا مصممة في الجسم الحي، بالإضافة إلى تحديد أهداف علاجية جديدة.
سرطان الغدة الدرقية هو الأورام الخبيثة الغدد الصماء مع زيادة حدوث، على الرغم من أن بشكل عام لديه نتيجة جيدة1. ومع ذلك، فإن بعض المرضى تطوير أشكال عدوانية من المرض التي لا يمكن علاجها والقواعد الجزيئية غير مفهومة جيدا2.
miRNAs هي RNAs 22-nucleotide طويلة غير الترميز التي تنظم التعبير الجيني في العديد من الأنسجة، وعادة عن طريق قاعدة الزوج ملزمة للمنطقة 3'UTRANSLATIONal (3'UTR) من RNAs رسول الهدف (mRNAs)، مما يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي أو قمع الترجمة 3 , 4.هناك أدلة متزايدة تثبت أن رفع القيود عن التعبير microRNA هو سمة مميزة للسرطان، وهذه الجزيئات تعدل الإشارات التكاثرية، والهجرة، والغزو والنقيل، ويمكن أن توفر مقاومة لالمبرمج 5,6. في السنوات الأخيرة، حددت العديد من الدراسات miRNAs كعلامات حيوية محتملة لتشخيص السرطان والتشخيص، فضلا عن الأهداف العلاجية7،وتوفير بعدا جديدا لتقييم السرطان والعلاج.
وقد اتخذت miRNAs مركز الصدارة في الأورام الجزيئية البشرية كمحركات رئيسية لأورام الغدة الدرقية البشرية8،9،10،11،12. من بين miRNAs حتى ينظم، miR-146b هو مبالغ فيه للغاية في أورام سرطان الغدة الدرقية الحليمي (PTC) وتبين أن زيادة كبيرة في انتشار الخلايا، وترتبط مع العدوانية والتكهن الكئيب6، 12 , 13 , 14 سنة , 15.وعلاوة على ذلك، miR-146b ينظم العديد من جينات الغدة الدرقية المشاركة في التمايز12،وأيضا الجينات الهامة قمع الورم مثل PTEN16 وDICER117. على الرغم من أهميتها في بيولوجيا السرطان، لا يزال علاج السرطان القائم على ميرنا في مراحله الأولى، والقليل جدا من الدراسات قد تناولت سرطان الغدة الدرقية - الأكثر شيوعا من أورام الغدد الصماء18. هنا نقوم بوصف بروتوكول باستخدام نموذجين ماوس مختلفة مع الأورام المشتقة من الإنسان، والتي إدارة مثبطات ميرنا الاصطناعية (antagomiR) التي تمنع على وجه التحديد ميرنا الخلوية يمكن أن تمنع نمو الورم. استخدمنا لأول مرة نموذج xenograft المشتركة، والإدارة المحلية داخل الورم من antagomiR خفض نمو الورمتقاس كانخفاض في الورم الإنارة 16 . لأن إنشاء نماذج ماوس قوية تحاكي تطور الورم البشري أمر ضروري لتطوير نُهج علاجية فريدة من نوعها، فإن زرع الأورام البشرية الأولية في تقويم العظام هو منصة أكثر قيمة للتحقق السريري من الأدوية الجديدة من نماذج زرع تحت الجلد. وهكذا، من أجل تقييم أفضل للإمكانات العلاجية للأنتاغومترية، استخدمنا نموذج الماوس التقويمي مع التسليم المنهجي في مجرى الدم، والحصول على نفس النتائج.
وأُجريت تجارب على الحيوانات امتثالاً لقانون الجماعة الأوروبية (86/609/EEC) والقانون الإسباني (R.D. 1201/2005)، بموافقة لجنة الأخلاقيات التابعة للمجلس الأعلى للاستثمارات العلمية (CSIC، إسبانيا).
1. تلقيح الجناح من الخلايا وعلاج antagomiR داخل الورم
2. تلقيح الغدة الدرقية تقويم العظام للخلايا والعلاج الأنتاغومير الجهازية
استخدمنا نموذجين مختلفين للفئران لتحديد ما إذا كان تحييد ميرنا يمكن أن يوقف نمو الورم. وبناء على ذلك، تم حقن خلايا الغدة الدرقية البشرية Cal62-luc تحت الجلد في أجنحة الفئران عارية لتوليد نموذج xenograph. بعد أسبوعين، تم إنشاء الأورام ويمكن قياسها مع الفرجار. في تلك المرحلة، تم حقن الفئران داخل الأ?...
تصف هذه الورقة طريقة لدراسة وظيفة في الجسم الحي من ميرنا من أجل فهم أفضل لدورها في بدء الورم والتقدم، وإمكاناته كهدف علاجي في سرطان الغدة الدرقية. تستند نماذج xenograft الورم هنا وصفها على استخدام الخلايا التي يمكن تتبعها عن طريق إشارة الإنارة الحيوية الخاصة بهم، مما يسمح بقياس نمو الورم في ال...
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
ونحن ممتنون لراكيل أروشا ريسكو على مساعدتها في علاج الفئران ورعايتها. نشكر الدكتور ج. بلانكو (المعهد الكتالوني للكيمياء المتقدمة - CSIC) والدكتور إ. ماتو (معهد البحوث في مستشفى سانتا كرو إي سانت باو) برشلونة (إسبانيا) على إهداء الخلايا CMV-Firefly luc-IRES-EGFP وCal62-Luc، على التوالي.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor | Thermo Fisher | 4464088 | In Vivo Ready |
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration | Corning | #354248 | |
DICER antibody | Abcam | ab14601 | IHQ: 1/100 |
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent | Thermo Fisher | IVF3005 | |
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System | Caliper Life Sciences | ||
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1 | Thermo Fisher | 4464077 | In Vivo Ready |
PCNA antibody | Abcam | ab92552 | WB: 1/2,000 |
PTEN antibody | Santa Cruz | sc-7974 | WB: 1/1,000 |
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate | PerkinElmer | 122799 | Diluted in PBS |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved