Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول نماذج الماوس الترصيع وتقويم العظام من تكوين أورام الغدة الدرقية البشرية كمنصة لاختبار العلاجات المثبطة المستندة إلى microRNA. هذا النهج مثالي لدراسة وظيفة RNAs غير الترميز وإمكاناتها كأهداف علاجية جديدة.

Abstract

تعتبر MicroRNAs (miRNAs) جهات تنظيمية هامة للتعبير الجيني من خلال قدرتها على زعزعة استقرار الحمض النووي الريبي وتثبيط ترجمة الـ mRNAs المستهدفة. وقد حدد عدد متزايد من الدراسات miRNAs كعلامات حيوية محتملة لتشخيص السرطان والتشخيص، وأيضا كأهداف علاجية، مضيفا بعدا إضافيا لتقييم السرطان والعلاج. في سياق سرطان الغدة الدرقية، ينتج التناسل الورمي ليس فقط من الطفرات في الجينات الهامة، ولكن أيضا من التعبير المفرط للعديد من miRNAs. وبناء على ذلك، فإن دور miRNAs في السيطرة على التعبير الجيني للغدة الدرقية يتطور كآلية هامة في السرطان. هنا، نقدم بروتوكول لدراسة آثار تسليم مثبطات ميرنا كطريقة علاجية في سرطان الغدة الدرقية باستخدام xenograft الورم البشري ونماذج الماوس التقويمي. بعد هندسة الخلايا السرطانية الدرقية مستقرة التعبير عن GFP وluciferase، يتم حقن الخلايا في الفئران عارية لتطوير الأورام، والتي يمكن أن يتبعها الإنارة الحيوية. تثبيط في الجسم الحي من ميرنا يمكن أن تقلل من نمو الورم upregulate أهداف الجينات ميرنا. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم أهمية ميرنا مصممة في الجسم الحي، بالإضافة إلى تحديد أهداف علاجية جديدة.

Introduction

سرطان الغدة الدرقية هو الأورام الخبيثة الغدد الصماء مع زيادة حدوث، على الرغم من أن بشكل عام لديه نتيجة جيدة1. ومع ذلك، فإن بعض المرضى تطوير أشكال عدوانية من المرض التي لا يمكن علاجها والقواعد الجزيئية غير مفهومة جيدا2.

miRNAs هي RNAs 22-nucleotide طويلة غير الترميز التي تنظم التعبير الجيني في العديد من الأنسجة، وعادة عن طريق قاعدة الزوج ملزمة للمنطقة 3'UTRANSLATIONal (3'UTR) من RNAs رسول الهدف (mRNAs)، مما يؤدي إلى تدهور الحمض النووي الريبي أو قمع الترجمة 3 , 4.هناك أدلة متزايدة تثبت أن رفع القيود عن التعبير microRNA هو سمة مميزة للسرطان، وهذه الجزيئات تعدل الإشارات التكاثرية، والهجرة، والغزو والنقيل، ويمكن أن توفر مقاومة لالمبرمج 5,6. في السنوات الأخيرة، حددت العديد من الدراسات miRNAs كعلامات حيوية محتملة لتشخيص السرطان والتشخيص، فضلا عن الأهداف العلاجيةوتوفير بعدا جديدا لتقييم السرطان والعلاج.

وقد اتخذت miRNAs مركز الصدارة في الأورام الجزيئية البشرية كمحركات رئيسية لأورام الغدة الدرقية البشرية8،9،10،11،12. من بين miRNAs حتى ينظم، miR-146b هو مبالغ فيه للغاية في أورام سرطان الغدة الدرقية الحليمي (PTC) وتبين أن زيادة كبيرة في انتشار الخلايا، وترتبط مع العدوانية والتكهن الكئيب6، 12 , 13 , 14 سنة , 15.وعلاوة على ذلك، miR-146b ينظم العديد من جينات الغدة الدرقية المشاركة في التمايز12،وأيضا الجينات الهامة قمع الورم مثل PTEN16 وDICER117. على الرغم من أهميتها في بيولوجيا السرطان، لا يزال علاج السرطان القائم على ميرنا في مراحله الأولى، والقليل جدا من الدراسات قد تناولت سرطان الغدة الدرقية - الأكثر شيوعا من أورام الغدد الصماء18. هنا نقوم بوصف بروتوكول باستخدام نموذجين ماوس مختلفة مع الأورام المشتقة من الإنسان، والتي إدارة مثبطات ميرنا الاصطناعية (antagomiR) التي تمنع على وجه التحديد ميرنا الخلوية يمكن أن تمنع نمو الورم. استخدمنا لأول مرة نموذج xenograft المشتركة، والإدارة المحلية داخل الورم من antagomiR خفض نمو الورمتقاس كانخفاض في الورم الإنارة 16 . لأن إنشاء نماذج ماوس قوية تحاكي تطور الورم البشري أمر ضروري لتطوير نُهج علاجية فريدة من نوعها، فإن زرع الأورام البشرية الأولية في تقويم العظام هو منصة أكثر قيمة للتحقق السريري من الأدوية الجديدة من نماذج زرع تحت الجلد. وهكذا، من أجل تقييم أفضل للإمكانات العلاجية للأنتاغومترية، استخدمنا نموذج الماوس التقويمي مع التسليم المنهجي في مجرى الدم، والحصول على نفس النتائج.

Protocol

وأُجريت تجارب على الحيوانات امتثالاً لقانون الجماعة الأوروبية (86/609/EEC) والقانون الإسباني (R.D. 1201/2005)، بموافقة لجنة الأخلاقيات التابعة للمجلس الأعلى للاستثمارات العلمية (CSIC، إسبانيا).

1. تلقيح الجناح من الخلايا وعلاج antagomiR داخل الورم

  1. إعداد الخلايا
    1. مهندس خط خلايا سرطان الغدة الدرقية البشرية Cal62 (KRASG12R و p53A161D الطفرات) لoverexpress a بنية المعدلة وراثيا التي تعبر بشكل تأسيسي GFP وluciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). حدد الخلايا المعدلة وراثيا عن طريق مقاومة المضادات الحيوية أو عن طريق فرز الخلايا الإيجابية GFP مع قياس التدفق.
    2. تنمو الخلايا في دولبيكو € ق تعديل النسر € ق المتوسطة (DMEM) تستكمل مع البنسلين, العقدية و 10% مصل البقر الجنيني (FBS) في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    3. تعليق 1 × 106 خلايا في 50 ميكرولتر من الفوسفات المخزنة المالحة (PBS) عند 4 درجة مئوية.
  2. تلقيح الخلايا في أجنحة الفئران
    1. خلط الخلايا مع نفس الكمية من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. على سبيل المثال، أضف 1 × 106 خلايا في 50 ميكرولتر من PBS إلى 50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدولالمواد) واخلط بلطف.
      ملاحظه:
    2. حقن 100 ميكرولتر من العينة (الخلايا في PBS + مصفوفة غشاء الطابق السفلي) تحت الجلد في الجناح الأيسر من 6 أسابيع من العمر نقص المناعة BALB / c nu/nu الفئران باستخدام حقنة الأنسولين 1 مل مع إبرة 27G 1/2 '' (0.4x13 مم).
  3. علاج الأنتمومتري داخل الورم.
    1. تعليق الأنتاغومير (انظر جدولالمواد) أو السيطرة السلبية في 500 درجة مئوية من المياه المقطرة الخالية من RNase.
    2. قبل الحقن، إعداد 2 نمول من antagomiR أو السيطرة جنبا إلى جنب مع كاشف التسليم في الجسم الحي (انظر جدولالمواد) لكل حقن.
      1. مزيج الأول الحل antagomiR (انظر جدولالمواد) والمخزن المؤقت للتعقيد (انظر جدولالمواد) في نسبة 1:1. على سبيل المثال، أضف 80 ميكرولتر من محلول مثبطات ميرنا (16 نمول) إلى 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتعقيد (المضمن في مجموعة الكاشف في الجسم الحي، انظر جدولالمواد).
      2. جلب في الجسم الحي تسليم الكاشف إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 160 درجة مئوية إلى أنبوب 1.5 مل وإضافة على الفور 160 درجة مئوية من محلول antagomiR المخفف. إرجاع الكاشف المتبقي إلى -20 درجة مئوية. إذا لزم الأمر، قم بتخزين الكاشف عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد بعد الذوبان.
      3. دوامة على الفور (10 ق) لضمان تعقيد في الجسم الحي تسليم كاشف antagomiR.
      4. حضانة في الجسم الحي تسليم الكاشف الأنتاغومير خليط لمدة 30 دقيقة في 50 درجة مئوية. طرد مركزي الأنبوب لفترة وجيزة لاسترداد العينة.
      5. تخفيف معقدة 6 أضعاف بإضافة 1360 درجة مئوية من PBS درجة الحموضة 7.4 وتخلط جيدا.
      6. المضي قدما في تسليم الجسم الحي من مجمع الكاشف أنتاغوميغر (8 الفئران / حالة)، أو تخزين المجمع في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد قبل الحقن. حقن 200 ميكرولتر داخل الأورام في كل ورم (2 نمول من الأنتاغومير).
        ملاحظة: حجم وكمية antagomiR مستقلة عن حجم الورم.
    3. قم بإجراء العلاج 3 مرات كل أسبوع (الاثنين والأربعاء والجمعة) لمدة أسبوعين.
  4. تحليل نمو الورم
    1. حقن 50 ميكرولتر من محلول 40 ملغ /مل من الركيزة د-لوسيفيرين (انظر جدولالمواد) تحت الجلد في كل نقطة زمنية مع حقنة 1 مل مع إبرة 27G 1/2'' (0.4 مم × 13 مم).
      1. في 8 دقائق بعد الحقن، تخدير الفئران باستخدام 3٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين. تقييم مستوى التخدير عن طريق دواسة رد الفعل (قرصة اصبع القدم شركة) وضبط الولادة مخدر حسب الاقتضاء للحفاظ على الطائرة الجراحية.
      2. تطبيق مرهم العيون لكلا العينين لمنع الجفاف.
    2. صورة الإشارة [بيولوميسنت] مع في [فيفو] تصوير برمجيّة (رأيت جدول ال [متريلس]).
      ملاحظة: الفرجار يمكن أيضا أن تستخدم لقياس حجم الورم ونمو الورم.
    3. بمجرد الحصول على إشارات الإضاءة الحيوية، تحليل النمو الورمي مقارنة كلا العلاجين وتحديد أهمية باستخدام اختبار تي. لتحليل التباين داخل المجموعة استخدم SEM.
  5. استئصال الورم
    1. بعد سبعة أيام من نهاية العلاج antagomiR، التضحية الفئران، المكوس الورم واستخراج البروتين و / أو الحمض النووي الريبي للتحليل في المستقبل. بدلا من ذلك، قسم الأورام وإصلاحها لالكيمياء المناعية.

2. تلقيح الغدة الدرقية تقويم العظام للخلايا والعلاج الأنتاغومير الجهازية

  1. إعداد الخلايا
    1. مهندس خط خلايا سرطان الغدة الدرقية البشرية Cal62 إلى الإفراط في بناء المعدلة وراثيا التي تعبر بشكل تأسيسي GFP وluciferase. حدد الخلايا المعدلة وراثيا عن طريق مقاومة المضادات الحيوية أو عن طريق فرز الخلايا الإيجابية GFP مع قياس التدفق.
    2. تنمو هذه الخلايا في DMEM تستكمل بالمضادات الحيوية (البنسلين والعقديات) و 10٪ FBS في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    3. تعليق 1 × 105 خلايا في 5 ميكرولتر من PBS.
  2. تلقيح الخلايا في الغدة الدرقية للفئران
    1. حقن 100 ميكرولتر من مسكن (البوبرينورفين) و 100 ميكرولتر من المضادات الحيوية (سيفالوسبورين) تحت الجلد في 7 أسابيع من العمر BALB / ج نو/نو الفئران. تطهير موقع الحقن مع الكحول.
    2. حقن 5 ميكرولتر من محلول الخلية في الغدة الدرقية للفئران.
      1. تخدير الماوس باستخدام 3٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين ووضعها تحت مجهر مجسم في مجلس الوزراء تدفق معقمة.  تقييم مستوى التخدير عن طريق دواسة رد الفعل (قرصة اصبع القدم شركة) وضبط الولادة مخدر حسب الاقتضاء للحفاظ على الطائرة الجراحية.
      2. تطبيق مرهم العيون لكلا العينين لمنع الجفاف.
      3. لكل فأر، تطهير الرقبة مع يودوبوفيدون وجعل شق من 2 سم تقريبا في الجلد مع مقص. بمجرد فتح، فضح الرقبة عن طريق إزاحة الغدد اللعابية.
      4. تشريح عضلات الأشرطة باستخدام ملقط تشريح و / أو مقص لفضح القصبة الهوائية والغدة الدرقية. باستخدام حقنة ميكرولتر 10 ميكرولتر حقن 5 ميكرولتر من محلول الخلية في الفص الغدة الدرقية الحق، وتقع على جانب غضروف cricoid.
      5. تغيير موضع الغدد اللعابية وخياطة الشق مع الحرير باستخدام مضفر، المغلفة، الغرز غير قابلة للامتصاص.
      6. إضافة يودوبوفيدون إلى منطقة الجرح ووضع الماوس على بطانية ثيرميك في حين أنه يتعافى من التخدير.
    3. في اليوم التالي بعد الجراحة، حقن مسكن تحت الجلد (البوبرينورفين) وإضافة 3 مل من ايبوبروفين السائل (40 ملغ / مل) في 250 مل من مياه الشرب لمدة أسبوع واحد.
  3. أنتاغومير الجهازية العلاج
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة 2-3 أسابيع بعد حقن الخلية، عندما تكون إشارة الإنارة الحيوية قابلة للكشف.
    1. تعليق الأنتاغومير أو السيطرة السلبية في الماء المقطر الخالي من RNase.
    2. قبل الحقن، إعداد 7 نمول من antagomiR أو السيطرة جنبا إلى جنب مع كاشف التسليم في الجسم الحي لكل حقن.
      1. للأنتاغومير وإعداد محلول كاشف التسليم في الجسم الحي انظر الخطوة 1.3 ولكن إضافة 7 نمول من مثبطات ميرنا لكل ماوس.
    3. إدارة الحل عن طريق الوريد عن طريق الحقن الرجعية المدارية من الجيوب الوريدية للماوس. استخدام isoflurane للحث على التخدير.
      ملاحظة: تقييم مستوى التخدير عن طريق دواسة رد الفعل (قرصة اصبع القدم شركة).
    4. علاج الفئران 3 مرات في الأسبوع (الاثنين والأربعاء والجمعة) لمدة 2 أسابيع.
  4. تحليل نمو الورم
    1. تحديد إشارة الورم الإنارة الحيوية مرتين في الأسبوع لحساب نمو الورم.
      1. حقن 50 ميكرولتر من محلول 40 ملغ / مل من الركيزة د-لوسيفيرين في كل نقطة زمنية عن طريق الحقن تحت الجلد.
      2. في 8 دقائق بعد الحقن، تخدير الفئران باستخدام 3٪ isoflurane مختلطة مع الأكسجين وصورة إشارة الإنارة الحيوية مع في برنامج التصوير في الجسم الحي.
    2. بمجرد الحصول على إشارات الإضاءة الحيوية، تحليل النمو الورمي مقارنة كلا العلاجين وتحديد أهمية باستخدام اختبار تي. لتحليل التباين داخل المجموعة استخدم SEM.
  5. استئصال الورم
    1. بعد سبعة أيام من نهاية فترة العلاج antagomiR، التضحية الفئران، المكوس الورم واستخراج البروتين و / أو الحمض النووي الريبي للتحليل في المستقبل. بدلا من ذلك، قسم الأورام وإصلاحها لالكيمياء المناعية.

النتائج

استخدمنا نموذجين مختلفين للفئران لتحديد ما إذا كان تحييد ميرنا يمكن أن يوقف نمو الورم. وبناء على ذلك، تم حقن خلايا الغدة الدرقية البشرية Cal62-luc تحت الجلد في أجنحة الفئران عارية لتوليد نموذج xenograph. بعد أسبوعين، تم إنشاء الأورام ويمكن قياسها مع الفرجار. في تلك المرحلة، تم حقن الفئران داخل الأ?...

Discussion

تصف هذه الورقة طريقة لدراسة وظيفة في الجسم الحي من ميرنا من أجل فهم أفضل لدورها في بدء الورم والتقدم، وإمكاناته كهدف علاجي في سرطان الغدة الدرقية. تستند نماذج xenograft الورم هنا وصفها على استخدام الخلايا التي يمكن تتبعها عن طريق إشارة الإنارة الحيوية الخاصة بهم، مما يسمح بقياس نمو الورم في ال...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

ونحن ممتنون لراكيل أروشا ريسكو على مساعدتها في علاج الفئران ورعايتها. نشكر الدكتور ج. بلانكو (المعهد الكتالوني للكيمياء المتقدمة - CSIC) والدكتور إ. ماتو (معهد البحوث في مستشفى سانتا كرو إي سانت باو) برشلونة (إسبانيا) على إهداء الخلايا CMV-Firefly luc-IRES-EGFP وCal62-Luc، على التوالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitorThermo Fisher4464088In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High ConcentrationCorning#354248
DICER antibodyAbcamab14601IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 ReagentThermo FisherIVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging SystemCaliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1Thermo Fisher4464077In Vivo Ready
PCNA antibodyAbcamab92552WB: 1/2,000
PTEN antibodySanta Cruzsc-7974WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent SubstratePerkinElmer122799Diluted in PBS

References

  1. Lim, H., Devesa, S. S., Sosa, J. A., Check, D., Kitahara, C. M. Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States. Journal of the American Medical Association. 317 (13), 1338-1348 (2017).
  2. Landa, I., et al. Genomic and transcriptomic hallmarks of poorly differentiated and anaplastic thyroid cancers. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 1052-1066 (2016).
  3. Gregory, R. I., Shiekhattar, R. MicroRNA biogenesis and cancer. Cancer Research. 65 (9), 3509-3512 (2005).
  4. Lin, S., Gregory, R. I. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 321-333 (2015).
  5. Hammond, S. M. MicroRNAs as oncogenes. Current Opinion In Genetics & Development. 16 (1), 4-9 (2006).
  6. Cancer Genome Atlas Reserch Network. Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell. 159 (3), 676-690 (2014).
  7. Li, Z., Rana, T. M. Therapeutic targeting of microRNAs: current status and future challenges. Nature Reviews. Drug Discovery. 13 (8), 622-638 (2014).
  8. Pallante, P., Battista, S., Pierantoni, G. M., Fusco, A. Deregulation of microRNA expression in thyroid neoplasias. Nature Reviews. Endocrinology. 10 (2), 88-101 (2014).
  9. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNAs in thyroid development, function and tumorigenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 456, 44-50 (2017).
  10. Fuziwara, C. S., Kimura, E. T. MicroRNA Deregulation in Anaplastic Thyroid Cancer Biology. International Journal of Endocrinology. 2014, 743450 (2014).
  11. Riesco-Eizaguirre, G., Santisteban, P. Endocrine Tumours: Advances in the molecular pathogenesis of thyroid cancer: lessons from the cancer genome. European Journal of Endocrinology. 175 (5), R203-R217 (2016).
  12. Riesco-Eizaguirre, G., et al. The miR-146b-3p/PAX8/NIS Regulatory Circuit Modulates the Differentiation Phenotype and Function of Thyroid Cells during Carcinogenesis. Cancer Research. 75 (19), 4119-4130 (2015).
  13. Lima, C. R., Geraldo, M. V., Fuziwara, C. S., Kimura, E. T., Santos, M. F. MiRNA-146b-5p upregulates migration and invasion of different Papillary Thyroid Carcinoma cells. BMC Cancer. 16, 108 (2016).
  14. Lee, J. C., et al. MicroRNA-222 and microRNA-146b are tissue and circulating biomarkers of recurrent papillary thyroid cancer. Cancer. 119 (24), 4358-4365 (2013).
  15. Deng, X., et al. MiR-146b-5p promotes metastasis and induces epithelial-mesenchymal transition in thyroid cancer by targeting ZNRF3. Cellular Physiology and Biochemistry. International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 35 (1), 71-82 (2015).
  16. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Santisteban, P. MicroRNA-146b promotes PI3K/AKT pathway hyperactivation and thyroid cancer progression by targeting PTEN. Oncogene. , (2018).
  17. Ramirez-Moya, J., Wert-Lamas, L., Riesco Eizaguirre, G., Santisteban, P. Impaired microRNA processing by DICER1 downregulation endows thyroid cancer with increased aggressiveness. Oncogene. , (2019).
  18. Xing, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews. Cancer. 13 (3), 184-199 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

150 miR 146b

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved