В Vivo ингибирование микроРНК для уменьшения роста опухоли у мышей

Резюме

Этот протокол описывает ксенотрансплантат и ортотопические мыши модели опухоли щитовидной железы человека в качестве платформы для тестирования микроРНК основе ингибитор лечения. Этот подход идеально подходит для изучения функции некодирующих РНК и их потенциала в качестве новых терапевтических целей.

Аннотация

МикроРНК (миРНК) являются важными регуляторами экспрессии генов через их способность дестабилизировать мРНК и препятствовать переводу целевых мРНК. Постоянно растущее число исследований определили miRNAs в качестве потенциальных биомаркеров для диагностики рака и прогноза, а также в качестве терапевтических целей, добавив дополнительное измерение к оценке рака и лечения. В контексте рака щитовидной железы, опухолевые результаты не только от мутаций в важных генах, но и от переэкспрессии многих miRNAs. Соответственно, роль миРНК в контроле экспрессии генов щитовидной железы развивается как важный механизм при раке. В этом случае мы представляем протокол для изучения последствий доставки ингибитора миРНК в качестве терапевтического модальности при раке щитовидной железы с использованием ксенотрансплантата опухоли человека и ортотопических моделей мыши. После инженерных стабильных опухолевых клеток щитовидной железы, выражающих GFP и люциферазу, клетки вводятся в обнаженных мышей для развития опухолей, которые могут сопровождаться биолюминесценции. Ингибирование in vivo miRNA может уменьшить рост опухоли и upregulate цели гена miRNA. Этот метод может быть использован для оценки важности определяется miRNA in vivo, в дополнение к выявлению новых терапевтических целей.

Введение

Рак щитовидной железы является эндокринной злокачественности с увеличением заболеваемости, хотя в общих чертах он имеет хороший результат¹. Тем не менее, у некоторых пациентов развиваются агрессивные формызаболевания, которые не поддаются лечению, а молекулярные основы плохо изучены 2.

miRNAs являются 22-нуклеотидных РНК, которые регулируют экспрессию генов во многих тканях, как правило, по базовой паре, связывающей с 3' непереводной области (3'UTR) целевых РНК-мессенджера (mRNAs), вызывая деградацию мРНК или трансляционные репрессии ^{3 , 4.}Существует все больше доказательств того, что дерегулирование экспрессии микроРНК является отличительной чертой рака, так как эти молекулы модулировать пролиферативной сигнализации, миграции, вторжения и метастазирования, и может обеспечить устойчивость к апоптозам ^5,6. В последние годы, многие исследования определили miRNAs в качестве потенциальных биомаркеров для диагностики рака и прогноза, а также терапевтические цели⁷, обеспечивая новое измерение для оценки рака и лечения.

miRNAs заняли центральное место в молекулярной онкологии человека в качестве ключевых факторов неоплазмы щитовидной железы^{человека}8,^9,10,11,12. Среди miRNAs вверх-регулируется, miR-146b сильно overexpressed в Папиллярной щитовидной карциномы (PTC) опухоли и было показано, значительно увеличить пролиферацию клеток, и быть связаны с агрессивностью и мрачный прогноз^{6, 12 Лет , 13 Год , 14 Год , 15}. Кроме того, miR-146b регулирует несколько генов щитовидной железы, участвующих в дифференциации¹², а также важные гены супрессоров опухоли, такие как PTEN¹⁶ и DICER1¹⁷. Несмотря на их важность в биологии рака, miRNA основе терапии рака все еще находится на ранних стадиях, и очень немногие исследования были рассмотрены рака щитовидной железы - наиболее частые из эндокринных опухолей¹⁸. Здесь мы описываем протокол с использованием двух различных моделей мыши с человеческими опухолями, в которых введение синтетического ингибитора miRNA (antagomiR), который специально подавляет клеточной миРНК может блокировать рост опухоли. Мы впервые использовали общую модель ксенотрансплантата, а местное внутриопухолевое введение антагомии снизилась рост опухоли, измеренная как уменьшение биолюминесценции опухоли^16. Поскольку создание надежных моделей мыши, имитирующих прогрессирование опухоли человека, имеет важное значение для разработки уникальных терапевтических подходов, ортотопическая имплантация первичных опухолей человека является более ценной платформой для клинической проверки новых препаратов, чем модели подкожной имплантации. Таким образом, для того, чтобы лучше оценить терапевтический потенциал антагоми, мы использовали ортотопическую модель мыши с системной доставкой в кровоток, получая те же результаты.

протокол

Эксперименты на животных проводились в соответствии с Законом Европейского сообщества (86/609/EEC) и испанским законодательством (R.D. 1201/2005), с одобрения Комитета по этике Комитета Посеви Верховного следственного комитета Cient'ficas (CSIC, Испания).

1. Фланговая прививка клеток и внутриопухолевое антагомиР лечение

1. Подготовка клеток
   1. Инженер Cal62 человека линии раковых клеток щитовидной железы (KRAS^G12R и p53^A161D мутации) для переэкспресса трансгенной конструкции, которая является составным выражает GFP и luciferase (CMV-Светфли Luc-IRES-eGFP). Выберите трансгенные клетки с помощью устойчивости к антибиотикам или путем сортировки GFP-положительных клеток с цитометрией потока.
   2. Выращивайте клетки в модифицированной среде Орла (DMEM) DMEM, дополненной пенициллином, стрептомицином и 10% сывороткойкрупного рогатого скота (FBS) при 37 градусах По цельсии и 5% CO 2.
   3. Приостановить 1 х 10⁶ клеток в 50 л фосфата буферного солима (PBS) при 4 градусах Цельсия.
2. Прививка клеток на флангах мышей
   1. Смешайте клетки с тем же количеством мембранной матрицы подвала. Например, добавьте 1 х 10⁶ клеток в 50 Л PBS до 50 зл и мембранной матрицы (см. Таблица Материалов)и аккуратно перемешайте.
      Примечание:
   2. Впрыските 100 л образца (клетки в матрице мембраны PBS и подвала) subcutaneously в левый фланг 6-недельного иммунодефицита BALB/c nu/nu мышей используя шприц инсулина 1 мл с иглой инсулина 27G 1/2'(0.4x13 mm) иглы.
3. Внутриопухолевое антагомиР лечение.
   1. Приостановить antagomiR (см. Таблица материалов) или отрицательный контроль в 500 Зл из RNase-свободной дистиллированной воды.
   2. Перед инъекцией приготовьте 2 нмоль антагомир или элемент управления вместе с реагентом доставки in vivo (см. Таблица материалов) для каждой инъекции.
      1. Сначала смешайте решение antagomiR (см. Таблицаматериалов) и буфер сложности (см. Таблицаматериалов) в соотношении 1:1. Например, добавьте 80 кЛ раствора ингибитора miRNA (16 нмоль) к 80 злу буфера комплекса (включенного в набор реагентов доставки in vivo, см. Таблицаматериалов).
      2. Доведите реагент доставки in vivo до комнатной температуры. Добавьте 160 л.с. в трубку 1,5 мл и сразу же добавьте 160 л разбавленного антагомира. Вернуть оставшийся реагент до -20 градусов по Цельсию. При необходимости храните реагент при 4 градусах По Цельсию в течение одной недели после оттаивания.
      3. Vortex немедленно (10 s) для обеспечения комплекса in vivo доставки реагента-антагомиР.
      4. Инкубировать реагент in vivo реагент-антагомир в течение 30 мин при 50 градусах По цельсию. Centrifuge трубки кратко восстановить образец.
      5. Разбавить комплекс в 6 раз, добавив 1360 л PBS pH 7.4 и хорошо перемешать.
      6. Продолжить доставку в vivo реагента-антагомира комплекса (8 мышей/условия), или хранить комплекс при 4 градусах Цельсия в течение одной недели до инъекции. Вводят 200 л внутриопухолевого в каждую опухоль (2 нмоль антагомиР).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Объем и количество antagomiR не зависит от объема опухоли.
   3. Выполните лечение 3 раза в неделю (понедельник, среда и пятница) в течение 2 недель.
4. Анализ роста опухоли
   1. Вводят 50 л раствора D-люциферина (см. Таблица материалов) в каждый временной момент с шприцем 1 мл с иглой 27G 1'2' (0,4 мм x 13 мм).
      1. На 8 мин после инъекции, анестезирует мышей с помощью 3% изофлуран смешивается с кислородом. Оцените уровень анестезии с помощью педали рефлекса (твердый щепотка ног) и отрегулируйте анестезию доставки по мере необходимости для поддержания хирургической плоскости.
      2. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание.
   2. Изображение биолюминесцентного сигнала с программным обеспечением in vivo изображений (см. Таблицаматериалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Калиперы также могут быть использованы для измерения объема опухоли и роста опухоли.
   3. После того, как биолюминесценция сигналы получены, анализировать рост опухоли сравнения обоих методов лечения и определить значение с помощью T-тест. Для анализа дисперсии внутри группы используйте SEM.
5. Иссечение опухоли
   1. Через семь дней после окончания антагомиР лечения жертвуйте мышами, вырезайте опухоль и извлекайте белок и/или РНК для будущего анализа. Кроме того, раздел опухоли и исправить их для иммуногистохимии.

2. Ортотопическая прививка клеток и системное лечение антагомиир

1. Подготовка клеток
   1. Инженер Cal62 человека линии рака щитовидной железы, чтобы переэкспресстранс трансгенной конструкции, которая constitutly выражает GFP и luciferase. Выберите трансгенные клетки с помощью устойчивости к антибиотикам или путем сортировки GFP-положительных клеток с цитометрией потока.
   2. Выращивайте эти клетки в DMEM, дополненные антибиотиками (пенициллин и стрептомицин) и 10% FBS при 37 градусах Цельсия и 5% CO_2.
   3. Приостановить 1 х 10⁵ клеток в 5 Л ПБС.
2. Прививка клеток в щитовидную железу мышей
   1. Вводят 100 л обезболивающих (бупренорфин) и 100 л антибиотиков (цефалоспорин) подкожно в 7-недельный BALB/c nu/nu мышей. Дезинфекция места инъекции с алкоголем.
   2. Вводят 5 зл клеточного раствора в щитовидную железу мышей.
      1. Анестезить мышь с помощью 3% изофруран смешивается с кислородом и поместить его под стереомикроскоп в стериомикроскоп в стерильных шкаф потока.  Оцените уровень анестезии с помощью педали рефлекса (твердый щепотка ног) и отрегулируйте анестезию доставки по мере необходимости для поддержания хирургической плоскости.
      2. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание.
      3. Для каждой мыши, дезинфицировать шею с йодоповидоном и сделать разрез приблизительно 2 см в коже с ножницами. После открытия, разоблачить шею, вытесняя слюнных желез.
      4. Вскрыть мышцы ремешка с помощью рассечения щипцы и / или ножницы подвергать трахеи и щитовидной железы. Использование микролитрного шприца объемом 10 л вводят 5 злител яточного раствора в правую щитовидную лобулю, расположенную на стороне крикоидного хряща.
      5. Переположите слюнные железы и шов разрез с шелком с помощью плетеные, покрытые, непоглощаемые швы.
      6. Добавьте йодоповидон в область раны и поместите мышь на термичическое одеяло, пока она восстанавливается после анестезии.
   3. На следующий день после операции вводят подкожно обезболивающие (бупренорфин) и добавляют 3 мл жидкого ибупрофена (40 мг/мл) в 250 мл питьевой воды в течение 1 недели.
3. Системная антагомияР лечение
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг через 2-3 недели после инъекции клеток, когда биолюминесцентный сигнал обнаруживается.
   1. Приостановить antagomiR или отрицательный контроль в дистиллированной воды без RNase.
   2. Перед инъекцией приготовьте 7 нмоль антагомир или контроль вместе с реагентом доставки in vivo для каждой инъекции.
      1. Для antagomiR и in vivo подготовки раствора доставки увидеть шаг 1.3, но добавить 7 нмоль миРНК-ингибитор на мышь.
   3. Администрирование раствора внутривенно путем ретроорбитальной инъекции венозной синусовой части мыши. Используйте изолюран для индуцирования анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените уровень анестезии с помощью педали рефлекса (твердый щепотка ног).
   4. Лечить мышей 3 раза в неделю (понедельник, среда и пятница) в течение 2 недель.
4. Анализ роста опухоли
   1. Определите биолюминесцентный сигнал опухоли два раза в неделю для расчета роста опухоли.
      1. Вводят 50 л раствора D-люциферина в каждом моменте с помощью подкожной инъекции.
      2. На 8 мин после инъекции, анестезирует мышей с помощью 3% изофлуран смешивается с кислородом и изображение биолюминесцентного сигнала с in vivo изображений программного обеспечения.
   2. После того, как биолюминесценция сигналы получены, анализировать рост опухоли сравнения обоих методов лечения и определить значение с помощью T-тест. Для анализа дисперсии внутри группы используйте SEM.
5. Иссечение опухоли
   1. Через семь дней после окончания периода лечения антагомира жертвуйте мышами, вырезайте опухоль и извлекайте белок и/или РНК для будущего анализа. Кроме того, раздел опухоли и исправить их для иммуногистохимии.

Результаты

Мы использовали две различные модели мышей, чтобы определить, может ли нейтрализация миРНК подавлять рост опухоли. Соответственно, человеческие опухолевые клетки щитовидной железы Cal62-luc были подкожно введены в фланги обнаженных мышей для создания модели ксенографа. Через две недели, ?...

Обсуждение

В этой статье описывается метод для изучения функции in vivo miRNA, чтобы лучше понять его роль в инициировании и прогрессировании опухоли, а также его потенциал в качестве терапевтической цели при раке щитовидной железы. Опухолевые модели ксенотрансплантата здесь описаны основаны на испол...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS