In vivo inibição de MicroRNA para diminuir o crescimento tumoral em camundongos

Resumo

Este protocolo descreve o xenograft e os modelos transplantação orthotopic do do rato do tumorigênese humano do tiróide como uma plataforma para testar tratamentos microRNA-baseados do inibidor. Esta abordagem é ideal para estudar a função de RNAs não codificantes e seu potencial como novos alvos terapêuticos.

Resumo

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica através de sua capacidade de destabilizar o mRNA e inibir a tradução de mRNAs alvo. Um número cada vez maior de estudos identificou miRNAs como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e prognóstico do câncer, e também como alvos terapêuticos, acrescentando uma dimensão extra à avaliação e tratamento do câncer. No contexto do cancro de tiróide, os resultados do tumorigênese não somente das mutações em genes importantes, mas igualmente da superexpressão de muitos miRNAs. Assim, o papel do miRNAs no controle da expressão gênica da tireoide está evoluindo como um importante mecanismo de câncer. Nisto, nós apresentamos um protocolo para examinar os efeitos da entrega do Mirna-inibidor como uma modalidade terapêutica no cancro de tiróide usando o xenograft humano do tumor e os modelos transplantação orthotopic do do rato. Após a engenharia de células tumorais estáveis da tireóide expressando GFP e luciferase, as células são injetadas em camundongos nus para desenvolver tumores, que podem ser seguidos por bioluminescência. A inibição in vivo de um miRNA pode reduzir o crescimento do tumor e upregulate alvos do gene de miRNA. Este método pode ser utilizado para avaliar a importância de um determinado miRNA in vivo, além de identificar novos alvos terapêuticos.

Introdução

O câncer de tireóide é uma malignidade endócrina com uma incidência crescente, embora, em termos gerais, tenha um bom desfecho¹. No entanto, alguns pacientes desenvolvem formas agressivas da doença que são intratáveis e as bases moleculares são pouco compreendidas².

miRNAs são 22-nucleotídeo-longo não-codificando RNAs que regulam a expressão de gene em muitos tecidos, tipicamente pela ligação do par-base à 3 ' região untranslational (3 ' UTR) do mensageiro do alvo RNAs (mRNAs), provocando a degradação do mRNA ou a repressão translacional ^{3. º , 4}. There está aumentando a evidência que demonstra que a desregulamentação da expressão de microRNA é uma indicação do cancro, porque estas moléculas modulam a sinalização proliferativa, a migração, a invasão e a metástase, e podem fornecer a resistência ao apoptose ^5,6. Nos últimos anos, muitos estudos identificaram miRNAs como potenciais biomarcadores para diagnóstico de câncer e prognóstico, bem como alvos terapêuticos⁷, proporcionando uma nova dimensão à avaliação e tratamento do câncer.

miRNAs tomaram o estágio Center na Oncologia molecular humana como os excitadores chaves de neoplasma humanos^8,9,10,^11,12da^tiróide. Entre os miRNAs acima-regulados, miR-146B é altamente overexpressado em tumores Papillary do carcinoma do tiróide (PTC) e foi mostrado para aumentar significativamente a proliferação de pilha, e para ser associado com a agressividade e o prognóstico sombrio^{6, 12 anos} de ^{, 13} anos de ^{, 14} anos de ^{, 15}. Além disso, miR-146B regula vários genes da tireóide envolvidos na diferenciação¹², e também importantes genes supressores de tumor, como PTEN¹⁶ e DICER1¹⁷. Apesar de sua importância na biologia do câncer, a terapia oncológica baseada em miRNA ainda está em seus estágios iniciais, e muito poucos estudos abordaram o câncer de tireóide-o mais frequente dos tumores endócrinos¹⁸. Aqui nós descrevemos um protocolo usando dois modelos diferentes do rato com os tumores humano-derivados, em que a administração de um miRNA-inibidor sintético (antagomiR) que inibe especificamente um miRNA celular pode obstruir o crescimento do tumor. Nós usamos primeiramente um modelo comum do xenograft, e a administração local do intratumorais de um antagomir diminuiu o crescimento do tumor medido como uma redução no bioluminescência¹⁶do tumor. Porque o estabelecimento de modelos robustos do rato que imita a progressão humana do tumor é essencial desenvolver aproximações terapêuticas originais, a implantação transplantação orthotopic do de tumores humanos preliminares é uma plataforma mais valiosa para a validação clínica de drogas novas do que modelos de implante subcutâneo. Assim, a fim de melhor avaliar o potencial terapêutico do antagomiR, utilizou-se um modelo de camundongo ortotópico com parto sistêmico na corrente sanguínea, obtendo os mesmos resultados.

Protocolo

A experimentação animal foi realizada em conformidade com o direito da Comunidade Europeia (86/609/CEE) e a lei espanhola (1201/2005), com aprovação do Comité de ética do Consejo superior de Investigaciones científicas (CSIC, Espanha).

1. inoculação do flanco de células e tratamento antagomiR intratumoral

1. Preparação de células
   1. Engenheiro de uma linha de células de câncer de tireóide humano Cal62 (Kras^G12R e p53^A161D mutações) para sobre-expressão uma construção transgênica que constitutivamente expressa GFP e luciferase (CMV-Firefly Luc-ires-EGFP). Selecione as células transgênicas por resistência a antibióticos ou classificando as células GFP-positivas com citometria de fluxo.
   2. Cultivar as células no meio de Eagle ' s modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com penicilina, estreptomicina e soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° c e 5% CO₂.
   3. Suspender 1 x 10⁶ células em 50 μL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 4 ° c.
2. Inoculação de células nos flancos de camundongos
   1. Misture as células com a mesma quantidade de matriz de membrana basal. Por exemplo, adicione 1 x 10⁶ células em 50 ΜL de PBS a 50 μL de matriz de membrana basal (ver tabela de materiais) e misture suavemente.
      Nota:
   2. Injete 100 μL da amostra (células em PBS + matriz de membrana basal) subcutaneamente no flanco esquerdo de camundongos BALB/c nu/nu de 6 semanas de idade, utilizando uma seringa de 1 ml de insulina com uma agulha de 27G 1/2 ' ' (0,4 x13 mm).
3. Tratamento com antagomiR intratumoral.
   1. Suspender o antagomiR (ver tabela de materiais) ou o controlo negativo em 500 μL de água destilada sem RNase.
   2. Antes da injecção, prepare 2 nmol do antagomiR ou o controlo juntamente com um reagente de entrega in vivo (ver tabela de materiais) para cada injeção.
      1. Primeiro misture a solução antagomiR (ver tabela de materiais) e o tampão de complexação (ver tabela de materiais) numa proporção de 1:1. Por exemplo, adicionar 80 μL de solução de inibidor de miRNA (16 nmol) a 80 μL de tampão de complexação (incluído no kit de reagente de entrega in vivo, ver tabela de materiais).
      2. Traga o reagente de entrega in vivo para a temperatura ambiente. Adicione 160 μL a um tubo de 1,5 mL e adicione imediatamente 160 μL de solução de antagomiR diluída. Retorne o reagente restante a-20 ° c. Se necessário, guarde o reagente a 4 ° c durante até uma semana após a descongelar.
      3. Vortex imediatamente (10 s) para garantir a complexação do reagente de entrega in vivo-antagomiR.
      4. Incubar a mistura de reagente-antagomiR de entrega in vivo durante 30 min a 50 ° c. Centrifugue o tubo brevemente para recuperar a amostra.
      5. Diluir o complexo de 6 vezes, adicionando 1360 μL de PBS pH 7,4 e misture bem.
      6. Proceder com a entrega in vivo do complexo reagente-antagomiR (8 camundongos/condição), ou armazenar o complexo a 4 ° c por até uma semana antes da injecção. Injete 200 μL de intratumoralmente em cada tumor (2 nmol de antagomiR).
         Nota: o volume e a quantidade do antagomiR são independentes do volume tumoral.
   3. Realize o tratamento 3 vezes por semana (segunda, quarta e sexta) durante 2 semanas.
4. Análise do crescimento tumoral
   1. Injete 50 μL de uma solução de 40 mg/mL de substrato de D-luciferina (ver tabela de materiais) por via subcutânea em cada ponto de tempo com uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27g 1/2 ' ' (0,4 mm x 13 mm).
      1. A 8 min após a injeção, anestesiam os camundongos usando isoflurano a 3% misturado com oxigênio. Avalie o nível de anestesia por reflexo de pedal (pinça firme do dedo do pé) e ajuste o parto anestésico conforme apropriado para manter o plano cirúrgico.
      2. Aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos para impedir o desseccation.
   2. Imagem do sinal bioluminescente com software de imagem in vivo (ver tabela de materiais).
      Nota: os calipers podem igualmente ser usados para medir o volume do tumor e o crescimento do tumor.
   3. Uma vez obtidos os sinais de bioluminescência, analisar o crescimento tumoral comparando os dois tratamentos e determinar a significância por meio de um teste t. Para analisar a variância dentro do grupo, use o SEM.
5. Excisão tumoral
   1. Sete dias após o término do tratamento com antagomiR, sacrificam os camundongos, exprimem o tumor e extraem proteínas e/ou RNA para análise futura. Alternativamente, seção os tumores e corrigi-los para immunohistochemistry.

2. inoculação ortotópica tireoidiana de células e tratamento sistêmico de antagomiR

1. Preparação de células
   1. Engenheiro de uma linha celular de câncer de tireóide Cal62 humano para sobre-expressão uma construção transgênica que constitutivamente expressa GFP e luciferase. Selecione as células transgênicas por resistência a antibióticos ou classificando as células GFP-positivas com citometria de fluxo.
   2. Cultivar estas células em DMEM suplementados com antibióticos (penicilina e estreptomicina) e 10% FBS a 37 ° c e 5% CO₂.
   3. Suspender 1 x 10⁵ células em 5 ΜL de PBS.
2. Inoculação celular na glândula tireóide de camundongos
   1. Injete 100 μL de analgésico (buprenorfina) e 100 μL de antibiótico (cefalosporina) por via subcutânea em camundongos BALB/c nu/nu de 7 semanas de idade. Desinfete o local da injecção com álcool.
   2. Injete 5 μL da solução celular na glândula tireóide dos camundongos.
      1. Anestesiar o rato usando isoflurano 3% misturado com oxigênio e colocá-lo um estereomicroscópio em um armário de fluxo estéril.  Avalie o nível de anestesia por reflexo de pedal (pinça firme do dedo do pé) e ajuste o parto anestésico conforme apropriado para manter o plano cirúrgico.
      2. Aplique a pomada oftálmica a ambos os olhos para impedir o desseccation.
      3. Para cada rato, desinfete o pescoço com iodopovidona e faça uma incisão aproximada de 2 cm na pele com uma tesoura. Uma vez aberto, expor o pescoço, deslocando as glândulas salivares.
      4. Dissecar os músculos da cinta usando o fórceps e/ou a tesoura da dissecção para expor a traquéia e a glândula de tiróide. A utilização de uma seringa de microlitro de 10 μL injecta 5 μL da solução celular no lóbulo direito da tiroide, localizado no lado da cartilagem cricóide.
      5. Reposicione as glândulas salivares e sutura a incisão com seda usando suturas trançadas, revestidas, não absorvíveis.
      6. Adicione iodopovidona à área da ferida e coloque o mouse sobre um cobertor térmico enquanto ele se recupera da anestesia.
   3. No dia seguinte após a cirurgia, injete o analgésico subcutaneamente (buprenorfina) e adicione 3 mL de ibuprofeno líquido (40 mg/mL) em 250 mL da água potável durante 1 semana.
3. AntagomiR sistémico tratamento
   Nota: execute esta etapa 2-3 semanas após a injeção da pilha, quando o sinal bioluminescente é detectável.
   1. Suspenda o antagomiR ou o controle negativo na água destilada RNase-livre.
   2. Antes da injecção, prepare 7 nmol do antagomiR ou o controlo juntamente com o reagente de entrega in vivo para cada injeção.
      1. Para o antagomiR e a preparação da solução de reagente de entrega in vivo, consulte a etapa 1,3, mas adicione 7 nmol do inibidor de miRNA por mouse.
   3. Administrar a solução por via intravenosa por injeção retro-orbital do seio venoso do rato. Use isoflurano para induzir anestesia.
      Nota: avaliar o nível de anestesia por pedal Reflex (firme Toe pinch).
   4. Trate os ratos 3 vezes por semana (segunda, quarta e sexta-feira) durante 2 semanas.
4. Análise do crescimento tumoral
   1. Determine o sinal bioluminescente do tumor duas vezes por semana para calcular o crescimento do tumor.
      1. Injetar 50 μL de uma solução de 40 mg/mL de substrato de D-luciferina em cada ponto de tempo através de injeção subcutânea.
      2. A 8 min após a injeção, anestesiam os camundongos usando isoflurano a 3% misturado com oxigênio e imagem o sinal bioluminescente com o software de imagem in vivo.
   2. Uma vez obtidos os sinais de bioluminescência, analisar o crescimento tumoral comparando os dois tratamentos e determinar a significância por meio de um teste t. Para analisar a variância dentro do grupo, use o SEM.
5. Excisão tumoral
   1. Sete dias após o término do período de tratamento de antagomiR, sacrificam os camundongos, exprimem o tumor e extraem proteínas e/ou RNA para análise futura. Alternativamente, seção os tumores e corrigi-los para immunohistochemistry.

Resultados

Nós usamos dois modelos diferentes dos ratos para determinar se a neutralização de um miRNA poderia suprimir o crescimento do tumor. Conformemente, as pilhas humanas do tiróide Cal62-Luc do tumor foram injetadas por via subcutânea nos flancos de ratos nus para gerar um modelo do xenograph. Após duas semanas, os tumores foram estabelecidos e poderiam ser medidos com calipers. Nesse momento, os camundongos foram injetados intratumoralmente com o inibidor do miR-146B, ou um controle adequado, e o volume tumoral foi se...

Discussão

Este artigo descreve um método para estudar a função in vivo de um miRNA a fim compreender melhor seu papel na iniciação e na progressão do tumor, e em seu potencial como um alvo terapêutico no cancro de tiróide. Os modelos do xenograft do tumor descritos aqui são baseados no uso das pilhas que podem ser controladas por seu sinal do bioluminescência, permitindo a medida do crescimento do tumor in vivo a influência de um tratamento. Além disso, descrevemos o uso de um tratamento baseado em miRNA para o câncer...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS