쥐에서 종양 성장을 감소 하는 MicroRNA의 생체 내 억제

요약

이 프로토콜은 마이크로RNA 기반 억제제 치료를 테스트하는 플랫폼으로서 인간 갑상선 종양발생의 이종이식 및 정형외 마우스 모델을 설명합니다. 이 접근법은 비코딩 RNA의 기능과 새로운 치료 표적으로서그들의 잠재력을 연구하는 데 이상적입니다.

초록

MicroRNAs (miRNAs)는 mRNA를 불안정하게 하고 표적 mRNA의 번역을 억제하는 그들의 기능을 통해 유전자 발현의 중요한 레귤레이터입니다. 점점 더 많은 연구가 miRNAs를 암 진단 및 예후를 위한 잠재적인 바이오마커로, 또한 치료 표적으로 확인하여 암 평가 및 치료에 추가 차원을 추가했습니다. 갑상선암의 맥락에서, 종양 발생은 중요한 유전자의 돌연변이뿐만 아니라 많은 miRNAs의 과발현에서 발생합니다. 따라서, 갑상선 유전자 발현의 조절에서 miRNA의 역할은 암에서 중요한 기전으로서 진화하고 있다. 본 명세서에서, 우리는 인간 종양 이종이식 및 직교 마우스 모델을 사용하여 갑상선암에서 치료 적 양상으로서 miRNA 억제제 전달의 효과를 검사하는 프로토콜을 제시한다. GFP와 luciferase를 발현하는 안정된 갑상선 종양 세포를 공학한 후에, 세포는 종양을 개발하기 위하여 누드 마우스로 주입되고, 생물 발광에 선행될 수 있습니다. miRNA의 생체 내 억제는 종양 성장을 감소시키고 miRNA 유전자 표적을 업조절할 수 있다. 이 방법은 새로운 치료 표적을 식별하는 것 외에도 생체 내에서 결정된 miRNA의 중요성을 평가하는 데 사용될 수 있다.

서문

갑상선암은 부각이 증가하는 내분비 악성종양이지만, 일반적으로 좋은결과를 가지고 있지만 1. 그럼에도 불구하고 일부 환자는 치료할 수없는 질병의 공격적인 형태를 개발하고 분자 기지는 제대로 이해되지^않습니다2.

miRNA는 많은 조직에서 유전자 발현을 조절하는 22-뉴클레오티드-긴 비코딩 RNA이며, 일반적으로 표적 메신저 RNA(mRNA)의 3' 비번역 영역(3'UTR)에 염기 쌍 결합에 의해 mRNA 분해 또는 번역 억압을 유발합니다. ^{3개 , 4.}마이크로RNA 발현의 규제 완화가 암의 특징임을 보여주는 증거가 증가하고 있는데, 이러한 분자는 증식 신호, 이동, 침입 및 전이를 조절하고 세포 사멸에 ^{대한 저항성을 제공할 수 있습니다. 5,6}. 최근 몇 년 동안, 많은 연구는 암 진단 및 예후뿐만 아니라 치료 대상^7에대한 잠재적 인 바이오 마커로 miRNAs를 확인, 암 평가 및 치료에 새로운 차원을 제공.

miRNAs는 인간 갑상선 종양학의 핵심 동인으로 인간 분자 종양학의 중심 무대를 취했습니다 8,^9,10,11,12. miRNAs 상이 조절 중, miR-146b는 유두 갑상선 암종 (PTC) 종양에서 높게 발현되고 세포 증식을 현저하게 증가시키고, 공격성과 음침한 예후와 연관되는 것으로 나타났다^{6, 12세 , 13세 , 14세 , 또한,}miR-146b는 분화^12에관여하는 여러 갑상선 유전자를 조절하고, 또한 PTEN¹⁶ 및 DICER1^17과같은 중요한 종양 억제 유전자를 조절한다. 암 생물학에 있는 그들의 중요성에도 불구하고, miRNA 기지를 둔 암 치료는 아직 초기 단계에 있고, 아주 몇몇 연구 결과는 갑상선암을 해결했습니다 - 내분비 종양의 가장 빈번한^18. 여기서 우리는 인간 유래 종양을 가진 2개의 상이한 마우스 모델을 사용하는 프로토콜을 기술하며, 여기서 세포 miRNA를 특이적으로 억제하는 합성 miRNA 억제제(antagomiR)를 투여하면 종양 성장을 차단할 수 있다. 먼저 일반적인 이종이식 모델을 사용하였고, 안아고미R의 국소 종양 투여는 종양 발광의 감소로측정된 종양 성장 감소(16). 인간 종양 진행을 모방한 견고한 마우스 모델의 확립은 독특한 치료 접근법을 개발하는 데 필수적이기 때문에, 원발성 인간 종양의 정형화 이식은 신약의 임상 적 검증을 위한 보다 더 가치 있는 플랫폼입니다. 피하 이식 모델. 따라서, 안아고미R의 치료 잠재력을 더 잘 평가하기 위해, 우리는 혈류에서 전신 전달을 가진 직교 마우스 모델을 사용하여 동일한 결과를 얻었다.

프로토콜

동물 실험은 유럽 공동체 법 (86/609 / EEC) 및 스페인 법 (R.D. 1201/2005)에 따라 수행되었으며, Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC, 스페인)의 윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 세포의 측면 접종 및 종양 내 antagomiR 치료

1. 세포 준비
   1. Cal62 인간 갑상선 암 세포주(KRAS^G12R 및 p53^A161D 돌연변이)를 설계하여 GFP와 루시퍼라아제(CMV-반딧불 Luc-IRES-eGFP)를 구성적으로 표현하는 형질전환 구조를 과발현합니다. 항생 저항에 의해 또는 유세포측정으로 GFP 양성 세포를 분류하여 형질전환 세포를 선택합니다.
   2. 37°C 및 5% CO2에서 페니실린, 스트렙토마이신 및 10% 태아 소 혈청(FBS)으로 보충된 덜베코의 변형된 이글 배지(DMEM)에서 세포를 성장시킨다.
   3. 4 °C에서 인산완충식염수(PBS)의 50 μL에서 1 x 10⁶ 세포를 일시 중단합니다.
2. 마우스의 측면에 세포 접종
   1. 동일한 양의 지하 멤브레인 매트릭스로 세포를 혼합합니다. 예를 들어, PBS 50 μL에 1 x 10⁶ 셀을 50 μL의 지하 멤브레인 매트릭스를 추가하고 부드럽게 섞습니다.
      참고:
   2. 27G 1/2'(0.4x13 mm) 바늘로 1 mL 인슐린 주사기를 사용하여 6주 된 면역 결핍 BALB/c nu/nu 마우스의 왼쪽 측면에 시료(PBS + 지하 막 매트릭스의 세포)의 100 μL을 피하주사한다.
3. 종양 내 안타미R 치료.
   1. RNase가 없는 증류수의 500 μL에서 안타고미R(재료 표참조) 또는 음의 제어를 일시 중단합니다.
   2. 주사 전에, 각 주사에 대해 생체 내 전달 시약(재료 표참조)과 함께 안아고미R 또는 대조군 2 nmol을 준비한다.
      1. 먼저 안타고미R 용액(재료 표참조)과 복합 버퍼(재료 표참조)를 1:1 비율로 혼합합니다. 예를 들어, 80 μL의 miRNA 억제제 용액(16 nmol)을 80 μL의 복합화 완충제(생체 내 전달 시약 키트에 포함됨, 재료 표참조)를 첨가한다.
      2. 생체 내 전달 시약을 실온으로 가져옵니다. 1.5 mL 튜브에 160 μL을 추가하고 즉시 희석 된 antagomiR 용액 160 μL을 추가하십시오. 남은 시약을 -20°C로 되돌려 보라고 합니다. 필요한 경우, 시약을 해동 후 최대 1주일 동안 4°C에서 보관하십시오.
      3. 소용돌이(10초)는 생체 내 시약-안타미R의 복합화를 보장한다.
      4. 50°C에서 30분 동안 생체 내 전달 시약-안타고미R 혼합물을 배양한다. 샘플을 회수하기 위해 튜브를 잠시 원심분리합니다.
      5. PBS pH 7.4의 1360 μL을 추가하여 복잡한 것을 6배 희석시키고 잘 섞는다.
      6. 시약-안타고미R 복합체(8 마우스/상태)의 생체 내 전달을 진행하거나, 주입 전 최대 1주일 동안 4°C에서 복합체를 저장한다. 각 종양에 종양 내 200 μL을 주입하십시오 (안타고미R 의 2 nmol).
         참고 : 안타고미R의 부피와 양은 종양 부피와 독립적입니다.
   3. 매주 3회(월요일, 수요일, 금요일)에 2주 동안 치료를 수행합니다.
4. 종양 성장 분석
   1. D-luciferin 기판의 40 mg/mL 용액 50 μL을 27G 1/2'(0.4 mm x 13mm) 바늘로 1 mL 주사기로 각 시점에서 피하적으로 주입합니다.
      1. 8 분 주입 후, 산소와 혼합 3% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취. 페달 반사 (단단한 발가락 핀치)에 의해 마취의 수준을 평가하고 수술 평면을 유지하기 위해 적절하게 마취 전달을 조정합니다.
      2. 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 바르고 있습니다.
   2. 생체 내 이미징 소프트웨어로 생물 발광 신호를 이미지화합니다(재료 표참조).
      참고: 캘리퍼스는 또한 종양 부피 및 종양 성장을 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
   3. 생물 발광 신호가 수득되면, 두 치료법을 비교하는 종양 성장을 분석하고 t-test를 사용하여 유의성을 결정한다. 그룹 내 분산을 분석하려면 SEM을 사용합니다.
5. 종양 절제
   1. antagomiR 처리의 끝 후에 7 일, 마우스를 희생하고, 종양을 절제하고 미래 분석을 위한 단백질 및/또는 RNA를 추출하십시오. 양자택일로, 종양을 단면도하고 면역성 화학을 위해 그(것)들을 고쳐.

2. 세포의 갑상선 정형접종 접종 및 전신 안아고미R 치료

1. 세포 준비
   1. Cal62 인간 갑상선 암 세포주 설계를 통해 GFP와 루시퍼라제를 구성적으로 표현하는 형질전환 구조를 과발현합니다. 항생 저항에 의해 또는 유세포측정으로 GFP 양성 세포를 분류하여 형질전환 세포를 선택합니다.
   2. 항생제 (페니실린 및 연쇄상 구균)와 37 °C 및 5 % CO2에서 10 % FBS로보충 된 DMEM에서이 세포를 성장시다.
   3. PBS의 5 μL에서 1 x 10⁵ 세포를 일시 중단합니다.
2. 마우스의 갑상선으로 세포 접종
   1. 진통 (buprenorphine) 및 항생제 (세팔로스포린)의 100 μL을 7 주 된 BALB / c nu/nu 마우스에 피하적으로 주입하십시오. 알코올로 주사 부위를 소독하십시오.
   2. 세포 용액의 5 μL을 마우스의 갑상선에 주입하십시오.
      1. 산소와 혼합 된 3 % 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고 멸균 흐름 캐비닛에 입체 현미경 아래에 놓습니다.  페달 반사 (단단한 발가락 핀치)에 의해 마취의 수준을 평가하고 수술 평면을 유지하기 위해 적절하게 마취 전달을 조정합니다.
      2. 건조를 방지하기 위해 두 눈에 안과 연고를 바르고 있습니다.
      3. 각 마우스에 대해, iodopovidone로 목을 소독하고 가위로 피부에 약 2cm의 절개를합니다. 일단 열리면, 침샘을 치수하여 목을 노출시소.
      4. 해부 집게 및 / 또는 가위를 사용하여 스트랩 근육을 해부하여 기관및 갑상선을 노출시하십시오. 10 μL 마이크로리터 주사기를 사용하여 5 μL의 세포 용액을 오른쪽 갑상선 소엽에 주입하고, 크리코이드 연골의 측면에 위치한다.
      5. 타액선을 재배치하고 편조, 코팅, 흡수할 수 없는 봉합사를 사용하여 실크로 절개를 봉합하십시오.
      6. 상처 부위에 iodopovidone을 추가하고 마취에서 회복하는 동안 열 담요에 마우스를 놓습니다.
   3. 다음 날 수술 후, 피하 진통제 (buprenorphine)를 주입하고 액체 이부프로펜의 3 mL를 추가 (40 mg / mL) 에 250 1 주 동안 식수의 mL.
3. 전신 안타미R 치료
   참고 : 생물 발광 신호가 감지 될 때 세포 주입 후 2-3 주 후에이 단계를 수행하십시오.
   1. 증류된 RNase 가 없는 물에 안타고미R 또는 음의 제어를 중단합니다.
   2. 주사 전에, 각 주사에 대한 생체 내 전달 시약과 함께 안타고미R 또는 대조구의 7 nmol을 준비한다.
      1. 안타고미R 및 생체내 전달 시약 용액 제제의 경우 마우스당 miRNA 억제제의 7nmol을 첨가하지만 단계 1.3을 참조한다.
   3. 마우스의 정맥 부비동의 레트로 궤도 주입에 의해 정맥 내 용액을 투여하십시오. 마취를 유도하기 위해 이소플루란을 사용하십시오.
      참고 : 페달 반사 (단단한 발가락 핀치)로 마취 수준을 평가하십시오.
   4. 마우스를 일주일에 3회(월요일, 수요일 및 금요일)에서 2주 동안 치료합니다.
4. 종양 성장 분석
   1. 종양 성장을 계산하기 위해 매주 두 번 종양 생물 발광 신호를 결정합니다.
      1. 피하 주사를 통해 각 시점에서 D-luciferin 기판의 40 mg/mL 용액의 50 μL을 주입하십시오.
      2. 8 분 주입 후, 산소와 혼합 된 3 % 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취시키고 생체 내 이미징 소프트웨어로 생물 발광 신호를 이미지화합니다.
   2. 생물 발광 신호가 수득되면, 두 치료법을 비교하는 종양 성장을 분석하고 t-test를 사용하여 유의성을 결정한다. 그룹 내 분산을 분석하려면 SEM을 사용합니다.
5. 종양 절제
   1. antagomiR 처리 기간이 끝난 후 7일 후에, 마우스를 희생시키고, 종양을 절제하고, 향후 분석을 위해 단백질 및/또는 RNA를 추출한다. 양자택일로, 종양을 단면도하고 면역성 화학을 위해 그(것)들을 고쳐.

결과

우리는 miRNA의 중화가 종양 성장을 억압할 수 있었다는 것을 결정하기 위하여 2개의 다른 마우스 모형을 이용했습니다. 따라서, 인간 종양 갑상선 Cal62-luc 세포는 피하적으로 누드 마우스의 측면에 주입되어 제노그래프 모델을 생성하였다. 2 주 후에 종양이 확립되었고 캘리퍼스로 측정 될 수 있었습니다. 그 시점에서, 마우스는 miR-146b 억제제, 또는 적절한 대조군으로 종양 내로 주입되었고, 종양 ?...

토론

이 논문은 종양 개시 및 진행에 대한 그것의 역할, 갑상선암의 치료 표적으로서의 잠재력을 더 잘 이해하기 위해 miRNA의 생체 내 기능을 연구하는 방법을 설명합니다. 여기에서 기술된 종양 이종이식 모델은 그들의 생물 발광 신호에 의해 추적될 수 있는 세포의 사용에 기초하며, 치료의 영향하에 생체 내에서 종양 성장의 측정을 허용한다. 또한, 우리는 갑상선 암에 대한 miRNA 기반 치료의 사용을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS