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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt Xenograft- und orthotopische Mausmodelle der menschlichen Schilddrüsentumorigenese als Plattform, um mikroRNA-basierte Inhibitorbehandlungen zu testen. Dieser Ansatz ist ideal, um die Funktion nicht-kodierender RNAs und ihr Potenzial als neue therapeutische Ziele zu untersuchen.

Zusammenfassung

MicroRNAs (miRNAs) sind wichtige Regulatoren der Genexpression durch ihre Fähigkeit, mRNA zu destabilisieren und die Translation von Ziel-mRNAs zu hemmen. Eine ständig wachsende Anzahl von Studien hat miRNAs als potenzielle Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose sowie als therapeutische Ziele identifiziert, was der Krebsbewertung und -behandlung eine zusätzliche Dimension hinzufügt. Im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs resultiert die Tumorgenese nicht nur aus Mutationen in wichtigen Genen, sondern auch aus der Überexpression vieler miRNAs. Dementsprechend entwickelt sich die Rolle von miRNAs bei der Kontrolle der Schilddrüsen-Genexpression als wichtiger Mechanismus bei Krebs. Hierbei stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirkung der miRNA-Hemmer-Verabreichung als therapeutische Modalität bei Schilddrüsenkrebs mit menschlichen Tumor-Xenograft- und orthotopischen Mausmodellen zu untersuchen. Nach der Entwicklung stabiler Schilddrüsentumorzellen, die GFP und Luziferase exezieren, werden Zellen in nackte Mäuse injiziert, um Tumore zu entwickeln, denen Biolumineszenz folgen kann. Die In-vivo-Hemmung einer miRNA kann das Tumorwachstum reduzieren und miRNA-Genziele hochregulieren. Diese Methode kann verwendet werden, um die Bedeutung einer bestimmten miRNA in vivo zu bewerten, zusätzlich zur Identifizierung neuer therapeutischer Ziele.

Einleitung

Schilddrüsenkrebs ist eine endokrine Malignität mit zunehmender Inzidenz, obwohl sie im Allgemeinen ein gutes Ergebnis hat1. Dennoch entwickeln einige Patienten aggressive Formen der Krankheit, die nicht behandelbar sind und die molekularen Grundlagen sind schlecht verstanden2.

miRNAs sind 22-Nukleotid-lange nicht-kodierende RNAs, die die Genexpression in vielen Geweben regulieren, typischerweise durch Basispaarbindung an die 3' untranslationale Region (3'UTR) von Target Messenger RNAs (mRNAs), die mRNA-Abbau oder translationale Repression auslösen 3 , 4. Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Deregulierung der microRNA-Expression ein Kennzeichen von Krebs ist, da diese Moleküle proliferative Signalisierung, Migration, Invasion und Metastasierung modulieren und Resistenzen gegen Apoptose bieten können. 5,6. In den letzten Jahren haben viele Studien miRNAs als potenzielle Biomarker für die Krebsdiagnose und -prognose sowie therapeutische Ziele7identifiziert, die eine neue Dimension für die Krebsbewertung und -behandlung bieten.

miRNAs haben in der humanen molekularen Onkologie als Schlüsseltreiber der menschlichen Schilddrüsenneoplasmen8,9,10,11,12. Unter den miRNAs up-reguliert, miR-146b ist stark überexprimiert in Papillarschildkarzinom (PTC) Tumoren und wurde gezeigt, dass signifikant erhöhen Zellproliferation, und mit Aggressivität und trostlosen Prognose assoziiert werden6, 12 , 13 , 14 , 15. Darüber hinaus reguliert miR-146b mehrere Schilddrüsengene, die an der Differenzierung beteiligt sind12, sowie wichtige Tumorsuppressorgene wie PTEN16 und DICER117. Trotz ihrer Bedeutung in der Krebsbiologie befindet sich die miRNA-basierte Krebstherapie noch in den Anfängen, und nur sehr wenige Studien haben sich mit Schilddrüsenkrebs befasst - der häufigste der endokrinen Tumoren18. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit zwei verschiedenen Mausmodellen mit vom Menschen abgeleiteten Tumoren, bei dem die Verabreichung eines synthetischen miRNA-Hemmers (AntagomiR), der speziell eine zelluläre miRNA hemmt, das Tumorwachstum blockieren kann. Wir verwendeten zuerst ein gemeinsames Xenograft-Modell, und die lokale Intratumor-Verabreichung eines AntagomiR verringerte das Tumorwachstum gemessen als eine Reduktion der Tumorbiolumineszenz16. Da die Etablierung robuster Mausmodelle, die die Progression des menschlichen Tumors imitieren, unerlässlich ist, um einzigartige therapeutische Ansätze zu entwickeln, ist die orthotopische Implantation primärer menschlicher Tumoren eine wertvollere Plattform für die klinische Validierung neuer Medikamente als subkutane Implantationsmodelle. Um das therapeutische Potenzial der AntagomiR besser einschätzen zu können, haben wir daher ein orthotopisches Mausmodell mit systemischer Entbindung im Blutstrom verwendet, um die gleichen Ergebnisse zu erzielen.

Protokoll

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit dem Gemeinschaftsrecht (86/609/EWG) und dem spanischen Gesetz (R.D. 1201/2005) mit Zustimmung der Ethikkommission des Consejo Superior de Investigaciones Cientéficas (CSIC, Spanien) durchgeführt.

1. Flankenimpfung von Zellen und intratumorale AntagomiR-Behandlung

  1. Zellvorbereitung
    1. Entwickeln Sie eine Cal62-Humanschilddrüsenkrebs-Zelllinie (KRASG12R und p53A161D-Mutationen), um ein transgenes Konstrukt zu überprimieren, das GFP und Luziferase konstitutiv ausdrückt (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Wählen Sie die transgenen Zellen nach Antibiotikaresistenz oder durch Sortieren der GFP-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie.
    2. Wachsen Sie die Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt durch Penicillin, Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS) bei 37 °C und 5%CO2.
    3. 1 x 106 Zellen in 50 l Phosphatgepufferter Saline (PBS) bei 4 °C aussetzen.
  2. Zellimpfung in die Flanken von Mäusen
    1. Mischen Sie die Zellen mit der gleichen Menge an Kellermembranmatrix. Fügen Sie z. B. 1 x 106 Zellen in 50 l PBS zu 50 l Kellermembranmatrix hinzu (siehe Tabelle der Materialien) und mischen Sie sie vorsichtig.
      notiz:
    2. Subkutan 100 l der Probe (Zellen in PBS + Kellermembranmatrix) in die linke Flanke von 6 Wochen alten immundefizienten BALB/c nu/nu-Mäusen mit einer 1 ml Insulinspritze mit einer 27G 1'2'' (0,4x13 mm) Nadel.
  3. Intratumorale AntagomiR-Behandlung.
    1. Setzen Sie die AntagomiR (siehe Materialtabelle) oder die Negativkontrolle in 500 l RNase-freiem destilliertem Wasser aus.
    2. Bereiten Sie vor der Injektion 2 nmol des AntagomiR oder die Kontrolle zusammen mit einem In-vivo-Abgabereagenz (siehe Materialtabelle) für jede Injektion vor.
      1. Mischen Sie zunächst die AntagomiR-Lösung (siehe Materialtabelle)und den Komplexierungspuffer (siehe Materialtabelle)im Verhältnis 1:1. Fügen Sie z. B. 80 L miRNA-Hemmerlösung (16 nmol) zu 80 L Komplexierungspuffer hinzu (im In-vivo-Lieferreagenz-Kit enthalten, siehe Tabelle der Materialien).
      2. Bringen Sie das In-vivo-Lieferreagenz auf Raumtemperatur. Fügen Sie 160 l in ein 1,5-ml-Rohr und sofort 160 l verdünnte AntagomiR-Lösung hinzu. Restreagenz auf -20 °C zurückgeben. Bei Bedarf das Reagenz nach dem Auftauen bis zu einer Woche bei 4 °C lagern.
      3. Wirbel sofort (10 s) zur Sicherstellung der Komplexierung der In-vivo-Abgabe Reagenz-AntagomiR.
      4. Inkubieren Sie das in vivo-Lieferreagem-AntagomiR-Gemisch 30 min bei 50 °C. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz, um die Probe wiederherzustellen.
      5. Verdünnen Sie den Komplex 6-fach, indem Sie 1360 l PBS pH 7.4 hinzufügen und gut mischen.
      6. Fahren Sie mit der In-vivo-Lieferung des Reagenz-AntagomiR-Komplexes (8 Mäuse/Bedingung) fort, oder lagern Sie den Komplex bis zu einer Woche vor der Injektion bei 4 °C. Injizieren Sie 200 l intratumoral in jeden Tumor (2 nmol AntagomiR).
        HINWEIS: Das Volumen und die Menge des AntagomiR ist unabhängig vom Tumorvolumen.
    3. Führen Sie die Behandlung 3 Mal pro Woche (Montag, Mittwoch und Freitag) für 2 Wochen.
  4. Analyse des Tumorwachstums
    1. Mit einer 1 ml Spritze mit einer 27G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm) Nadel werden 50 l einer 40 mg/ml-Lösung des D-Luziferin-Substrats (siehe Materialtabelle)subkutan zu jedem Zeitpunkt injiziert.
      1. Nach 8 min Nachinjektion die Mäuse mit 3% Isofluran mit Sauerstoff vermischt anästhesieren. Bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme) und passen Sie die Anästhesieabgabe entsprechend an, um die chirurgische Ebene aufrechtzuerhalten.
      2. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um austrocknung zu verhindern.
    2. Stellen Sie das biolumineszierende Signal mit in vivo Bildgebungssoftware ab (siehe Tabelle der Materialien).
      HINWEIS: Caliper können auch verwendet werden, um das Tumorvolumen und das Tumorwachstum zu messen.
    3. Sobald die Biolumineszenzsignale erhalten sind, analysieren Sie das Tumorwachstum, indem Sie beide Behandlungen vergleichen und die Signifikanz mit einem t-Test bestimmen. Verwenden Sie das SEM, um die Varianz innerhalb der Gruppe zu analysieren.
  5. Tumorexzision
    1. Sieben Tage nach dem Ende der AntagomiR-Behandlung opfern Sie die Mäuse, verbrauchen den Tumor und extrahieren Protein und/oder RNA für zukünftige Analysen. Alternativ, Abschnitt der Tumoren und fixieren Sie sie für die Immunhistochemie.

2. Schilddrüse orthotopische Inokulation von Zellen und systemische AntagomiR-Behandlung

  1. Zellvorbereitung
    1. Entwickeln Sie eine Cal62 menschliche Schilddrüsenkrebs-Zelllinie, um ein transgenes Konstrukt zu überprimieren, das GFP und Luziferase konstitutiv ausdrückt. Wählen Sie die transgenen Zellen nach Antibiotikaresistenz oder durch Sortieren der GFP-positiven Zellen mit Durchflusszytometrie.
    2. Wachsen Sie diese Zellen in DMEM, ergänzt mit Antibiotika (Penicillin und Streptomycin) und 10% FBS bei 37 °C und 5%CO2.
    3. 1 x 105 Zellen in 5 l PBS suspendieren.
  2. Zellimpfung in die Schilddrüse von Mäusen
    1. Injizieren Sie 100 l Analgetika (Buprenorphin) und 100 l Antibiotikum (Cephalosporin) subkutan in 7 Wochen alte BALB/c nu/nu Mäuse. Desinfizieren Sie die Injektionsstelle mit Alkohol.
    2. Injizieren Sie 5 l der Zelllösung in die Schilddrüse der Mäuse.
      1. Anästhesisieren Sie die Maus mit 3% Isofluran mit Sauerstoff gemischt und legen Sie es unter einem Stereomikroskop in einem sterilen Durchflussschrank.  Bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme) und passen Sie die Anästhesieabgabe entsprechend an, um die chirurgische Ebene aufrechtzuerhalten.
      2. Tragen Sie die ophthalmologische Salbe auf beide Augen auf, um austrocknung zu verhindern.
      3. Für jede Maus, desinfizieren Sie den Hals mit Iodopovidon und machen Einen Schnitt von ca. 2 cm in der Haut mit der Schere. Sobald geöffnet, entblößen Sie den Hals, indem Sie die Speicheldrüsen verdrängen.
      4. Sezieren Sie die Riemenmuskeln mit Sezieren Zangen und / oder Schere, um die Luftröhre und die Schilddrüse auszusetzen. Mit einer 10-L-Mikroliterspritze injizieren Sie 5 l der Zelllösung in den rechten Schilddrüsen-Lobul, der sich an der Seite des Cricoid-Knorpels befindet.
      5. Positionieren Sie die Speicheldrüsen neu und veransen Sie den Schnitt mit Seide mit geflochtenen, beschichteten, nicht resorbierbaren Nähten.
      6. Fügen Sie Iodopovidon in den Wundbereich und legen Sie die Maus auf eine thermische Decke, während es sich von der Anästhesie erholt.
    3. Am nächsten Tag nach der Operation subkutan analgetisch (Buprenorphin) injizieren und 3 ml flüssiges Ibuprofen (40 mg/ml) 1 Woche lang in 250 ml Trinkwasser geben.
  3. Systemische AntagomiR Behandlung
    HINWEIS: Führen Sie diesen Schritt 2-3 Wochen nach der Zellinjektion durch, wenn das biolumineszierende Signal nachweisbar ist.
    1. Setzen Sie die AntagomiR oder die Negativkontrolle in destilliertem RNase-freiem Wasser aus.
    2. Bereiten Sie vor der Injektion 7 nmol des AntagomiR oder der Kontrolle zusammen mit dem In-vivo-Abgabereagenz für jede Injektion vor.
      1. Für die AntagomiR und die In-vivo-Abgabe-Reagenz-Lösung s siehe Schritt 1.3, aber 7 nmol des miRNA-Hemmers pro Maus hinzufügen.
    3. Die Lösung intravenös durch retro-orbitale Injektion der venösen Sinus der Maus verabreichen. Verwenden Sie Isofluran, um Anästhesie zu induzieren.
      HINWEIS: Bewerten Sie den Grad der Anästhesie durch Pedalreflex (feste Zehenklemme).
    4. Behandeln Sie die Mäuse 3 mal pro Woche (Montag, Mittwoch und Freitag) für 2 Wochen.
  4. Analyse des Tumorwachstums
    1. Bestimmen Sie das Tumorbiolumineszenzsignal zweimal wöchentlich, um das Tumorwachstum zu berechnen.
      1. Injizieren Sie 50 l einer 40 mg/ml Lösung des D-Luziferin-Substrats zu jedem Zeitpunkt durch subkutane Injektion.
      2. Nach 8 min Nachinjektion die Mäuse mit 3% Isofluran gemischt mit Sauerstoff ansien und das biolumineszierende Signal mit in vivo Bildgebungssoftware abbilden.
    2. Sobald die Biolumineszenzsignale erhalten sind, analysieren Sie das Tumorwachstum, indem Sie beide Behandlungen vergleichen und die Signifikanz mit einem t-Test bestimmen. Verwenden Sie das SEM, um die Varianz innerhalb der Gruppe zu analysieren.
  5. Tumorexzision
    1. Sieben Tage nach dem Ende der AntagomiR-Behandlungsphase opfern Sie die Mäuse, verbrauchen den Tumor und extrahieren Protein und/oder RNA für zukünftige Analysen. Alternativ, Abschnitt der Tumoren und fixieren Sie sie für die Immunhistochemie.

Ergebnisse

Wir verwendeten zwei verschiedene Mäusemodelle, um zu bestimmen, ob die Neutralisation einer miRNA das Tumorwachstum unterdrücken könnte. Dementsprechend wurden die menschlichen Tumorschild-Cal62-luc-Zellen subkutan in die Flanken von Nacktmäusen injiziert, um ein Xenographenmodell zu erzeugen. Nach zwei Wochen wurden Tumore festgestellt und konnten mit Sätteln gemessen werden. Zu diesem Zeitpunkt wurden Mäuse intratumoral mit dem miR-146b-Hemmer injiziert, oder eine entsprechende Kontrolle, und das Tumorvolumen wu...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Untersuchung der In-vivo-Funktion einer miRNA, um ihre Rolle bei der Tumorinitiierung und -progression und ihr Potenzial als therapeutisches Ziel bei Schilddrüsenkrebs besser zu verstehen. Die hier beschriebenen Tumor-Xenograft-Modelle basieren auf der Verwendung von Zellen, die durch ihr Biolumineszenzsignal verfolgt werden können, was die Messung des Tumorwachstums in vivo unter dem Einfluss einer Behandlung ermöglicht. Darüber hinaus beschreiben wir die Verwendung einer m...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Wir danken Raquel Arocha Riesco für ihre Unterstützung bei der Behandlung und Pflege von Mäusen. Wir danken Dr. J. Blanco (Catalonian Institute for Advance Chemistry-CSIC) und Dr. E. Mato (Institut de Reserca de l'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau) Barcelona (Spanien) für die Schenkung der CMV-Firefly luc- IRES-EGFP bzw. Cal62-Luc Zellen.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitorThermo Fisher4464088In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High ConcentrationCorning#354248
DICER antibodyAbcamab14601IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 ReagentThermo FisherIVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging SystemCaliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1Thermo Fisher4464077In Vivo Ready
PCNA antibodyAbcamab92552WB: 1/2,000
PTEN antibodySanta Cruzsc-7974WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent SubstratePerkinElmer122799Diluted in PBS

Referenzen

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