In vivivo Inibizione del MicroRNA per diminuire la crescita tumorale nei topi

Riepilogo

Questo protocollo descrive i modelli murini xenoinpito e ortotopici della tumorigenesi tiroidea umana come piattaforma per testare i trattamenti inibitori basati su microRNA. Questo approccio è ideale per studiare la funzione degli RNA non codificanti e il loro potenziale come nuovi obiettivi terapeutici.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono importanti regolatori dell'espressione genica attraverso la loro capacità di destabilizzare l'mRNA e inibire la traduzione degli mRNA bersaglio. Un numero sempre crescente di studi ha identificato i miRNA come potenziali biomarcatori per la diagnosi e la prognosi del cancro, nonché come obiettivi terapeutici, aggiungendo una dimensione aggiuntiva alla valutazione e al trattamento del cancro. Nel contesto del cancro della tiroide, la tumorigenesi deriva non solo da mutazioni in geni importanti, ma anche dalla sovraespressione di molti miRNA. Di conseguenza, il ruolo dei miRNA nel controllo dell'espressione genica della tiroide si sta evolvendo come un importante meccanismo nel cancro. Qui, presentiamo un protocollo per esaminare gli effetti della somministrazione di miRNA-inibitori come modalità terapeutica nel cancro della tiroide utilizzando modelli di xenotrapianto del tumore umano e modelli murini ortotopici. Dopo aver engineering cellule tumorali della tiroide stabili che esprimono GFP e luciferasi, le cellule vengono iniettate nei topi nudi per sviluppare tumori, che possono essere seguiti da bioluminescenza. L'inibizione in vivo di un miRNA può ridurre la crescita del tumore e upregulate bersagli genici genici del miRNA. Questo metodo può essere utilizzato per valutare l'importanza di un miRNA determinato in vivo, oltre a identificare nuovi bersagli terapeutici.

Introduzione

Il cancro della tiroide è una malignità endocrina con un'incidenza crescente, anche se in termini generali ha un buon risultato¹. Tuttavia, alcuni pazienti sviluppano forme aggressive della malattia che non sono curabili e le basi molecolari sono poco comprese².

I miRNA sono RNA non codificanti lunghi 22 nucleotidi che regolano l'espressione genica in molti tessuti, in genere legandosi di coppie di base alla regione non traslazionale 3' (3'UTR) di RNA messaggeri bersaglio (mRNA), innescando la degradazione dell'mRNA o la repressione traslazionale ³ (COM del nome ^{, 4}. Ci sono sempre più prove che dimostrano che la deregolazione dell'espressione del microRNA è un segno distintivo del cancro, in quanto queste molecole modulano la segnalazione proliferale, la migrazione, l'invasione e la metastasi, e possono fornire resistenza all'apoptosi ^5,6. Negli ultimi anni, molti studi hanno identificato i miRNA come potenziali biomarcatori perla diagnosi e la prognosi del cancro, nonché obiettivi terapeutici 7, fornendo una nuova dimensione alla valutazione e al trattamento del cancro.

I miRNA hanno preso il centro dell'oncologia molecolare umana come fattori chiave dei neoplasmi tiroidei umani^8,9,10,11,12. Tra i miRNA up-regolato, miR-146b è altamente sovraespresso nei tumori Papillary Thyroid Carcinoma (PTC) e ha dimostrato di aumentare significativamente la proliferazione cellulare, e di essere associato con aggressività e prognosi triste^{6, 12} mila ^{, 13} del sistema ^{, 14} Del sistema ^{, 15}. Inoltre, miR-146b regola diversi geni tiroidei coinvolti nella differenziazione¹²e anche importanti geni soppressori tumorali come PTEN¹⁶ e DICER1¹⁷. Nonostante la loro importanza nella biologia del cancro, la terapia del cancro basata su miRNA è ancora nelle sue fasi iniziali, e pochissimi studi hanno affrontato il cancro della tiroide - il più frequente dei tumori endocrini¹⁸. Qui descriviamo un protocollo usando due diversi modelli murini con tumori di origine umana, in cui la somministrazione di un inibitore di miRNA sintetico (antagomiR) che inibisce specificamente un miRNA cellulare può bloccare la crescita del tumore. Per la prima volta abbiamo usato un modello comune di xenotrapianto, e la somministrazione intratumorale locale di un antagomiR ha diminuito la crescita tumorale misurata come riduzione della bioluminescenza tumorale¹⁶. Poiché la creazione di robusti modelli murini che imitano la progressione del tumore umano è essenziale per sviluppare approcci terapeutici unici, l'impianto ortotopico dei tumori umani primari è una piattaforma più preziosa per la convalida clinica di nuovi farmaci modelli di impianto sottocutaneo. Così, al fine di valutare meglio il potenziale terapeutico dell'antagomir, abbiamo usato un modello di topo ortotopico con consegna sistemica nel flusso sanguigno, ottenendo gli stessi risultati.

Protocollo

La sperimentazione animale è stata effettuata in conformità con il Diritto comunitario (86/609/CEE) e la legge spagnola (R.D. 1201/2005), con l'approvazione del Comitato Etico del Superiore del Consejo di Investigaciones Cient-ficas (CSIC, Spagna).

1. Inoculazione del fianco delle cellule e trattamento dell'antagomiR intratutuale

1. Preparazione cellulare
   1. Ingegnere una linea cellulare del cancro della tiroide umana Cal62 (mutazioni KRAS^G12R e p53^A161D) per sovraesprimere un costrutto transgenico che esprime in modo stitutivo GFP e luciferasi (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Selezionare le cellule transgeniche per resistenza agli antibiotici o smistando le cellule positive GFP con citometria di flusso.
   2. Far crescere le cellule in Dulbecco- modificato mezzo Eagle's (DMEM) integrato con penicillina, streptomicina e 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 c e 5% CO₂.
   3. Sospendere 1 x 10⁶ celle in 50 : L di fosfato gassato (PBS) a 4 gradi centigradi.
2. Inoculazione cellulare nei fianchi dei topi
   1. Mescolare le celle con la stessa quantità di matrice della membrana del seminterrato. Ad esempio, aggiungere 1 x 10⁶ celle in 50 - L di PBS a 50 - L di matrice della membrana seminterrato (vedere Tabella dei materiali) e mescolare delicatamente.
      nota:
   2. Iniettare 100 l del campione (cellule in PBS - matrice di membrana seminterrato) sottocutaneamente nel fianco sinistro di 6 settimane-vecchio immunodeficiente BALB / c nu/nu topi utilizzando una siringa di insulina da 1 mL con un ago 27G 1/2'' (0,4x13 mm).
3. Trattamento intratumialo di antagomiR.
   1. Sospendere l'antagomir (vedere Tabella deimateriali) o il controllo negativo in 500 -L di acqua distillata senza RNase.
   2. Prima dell'iniezione, preparare 2 nmol dell'antagomiR o il controllo insieme a un reagente di consegna in vivo (vedi Tabella dei materiali) per ogni iniezione.
      1. In primo luogo mescolare la soluzione antagomiR (vedere Tabella dei materiali) e il buffer di complessità (vedere Tabella dei materiali) in un rapporto 1:1. Aggiungere, ad esempio, 80 L di soluzione miRNA-inhibitor (16 nmol) a 80 l di buffer di complessità (incluso nel kit di reagente per la consegna in vivo, vedere Tabella deimateriali).
      2. Portare il reagente di consegna in vivo a temperatura ambiente. Aggiungere 160 l in un tubo da 1,5 mL e aggiungere immediatamente 160 -L di soluzione antagomiR diluita. Riportare il reagente rimanente a -20 gradi centigradi. Se necessario, conservare il reagente a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana dopo lo scongelamento.
      3. Vortice immediatamente (10 s) per garantire la complessità del reagente-antagomiR di consegna in vivo.
      4. Incubare la miscela reagente-antagomiR di consegna in vivo per 30 min a 50 gradi centigradi. Centrifugare brevemente il tubo per recuperare il campione.
      5. Diluire il complesso a 6 volte aggiungendo 1360 L di PBS pH 7.4 e mescolare bene.
      6. Procedere con la consegna in vivo del complesso reagente-antagomiR (8 topi/condizione) o conservare il complesso a 4 gradi centigradi per un massimo di una settimana prima dell'iniezione. Iniettare 200 L intratumoralmente in ogni tumore (2 nmol di antagomiR).
         NOTA: Il volume e la quantità dell'antagomiR sono indipendenti dal volume del tumore.
   3. Eseguire il trattamento 3 volte ogni settimana (lunedì, mercoledì e venerdì) per 2 settimane.
4. Analisi della crescita tumorale
   1. Iniettare 50 l di una soluzione da 40 mg/mL di substrato D-luciferin (vedi Tabella deimateriali) sottocutaneamente ad ogni punto temporale con una siringa da 1 mL con un ago da 27G 1/2' (0,4 mm x 13 mm).
      1. A 8 min dopo l'iniezione, anestesizzare i topi utilizzando 3% isoflurane mescolato con ossigeno. Valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale (pizzico dell'aldino) e regolare la consegna anestetica come appropriato per mantenere il piano chirurgico.
      2. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la disidratazione.
   2. Immagine del segnale bioluminescente con il software di imaging in vivo (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: I calibrorie possono essere utilizzati anche per misurare il volume del tumore e la crescita del tumore.
   3. Una volta ottenuti i segnali di bioluminescenza, analizzare la crescita tumorale confrontando entrambi i trattamenti e determinare il significato utilizzando un test t. Per analizzare la varianza all'interno del gruppo, utilizzare il SEM.
5. Escissione tumorale
   1. Sette giorni dopo la fine del trattamento dell'antagomiR, sacrificare i topi, eccitare il tumore ed estrarre proteine e/o RNA per analisi future. In alternativa, sezionare i tumori e fissarli per l'immunoistochimica.

2. Inoculazione ortotopica tiroidea delle cellule e trattamento dell'antagomiR sistemico

1. Preparazione cellulare
   1. Ingegnere una linea cellulare del cancro della tiroide umana Cal62 per sovraesprimere un costrutto transgenico che esprime in modo coniugale GFP e luciferasi. Selezionare le cellule transgeniche per resistenza agli antibiotici o smistando le cellule positive GFP con citometria di flusso.
   2. Far crescere queste cellule in DMEM integrati con antibiotici (penicillina e streptomicina) e 10% FBS a 37 e 5% CO₂.
   3. Sospendere 1 x 10⁵ celle in 5 : L di PBS.
2. Inoculazione cellulare nella ghiandola tiroidea dei topi
   1. Iniettare 100 l di analgesici (buprenorfina) e 100 l di antibiotico (cefalosporina) sottocutaneamente nei topi BALB/c nu/nu di 7 settimane. Disinfettare il sito di iniezione con l'alcol.
   2. Iniettare 5 l della soluzione cellulare nella ghiandola tiroidea dei topi.
      1. Anestesizzare il topo utilizzando 3% isoflurane mescolato con ossigeno e posizionarlo sotto uno stereomicroscopio in un armadio di flusso sterile.  Valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale (pizzico dell'aldino) e regolare la consegna anestetica come appropriato per mantenere il piano chirurgico.
      2. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la disidratazione.
      3. Per ogni topo, disinfettare il collo con iodopovidone e fare un'incisione di circa 2 cm nella pelle con le forbici. Una volta aperto, esporre il collo spostando le ghiandole salivari.
      4. Dissezionare i muscoli della cinghia utilizzando pinze di dissezione e/o forbici per esporre la trachea e la ghiandola tiroidea. L'utilizzo di una siringa microlitro da 10 Litri inietta 5 l l della soluzione cellulare nel lobulo tiroidea destro, situato a lato della cartilagine cricoide.
      5. Riposizionare le ghiandole salivari e suturare l'incisione con seta utilizzando suture intrecciate, rivestite e non assorbibili.
      6. Aggiungere iodopovidone all'area della ferita e posizionare il mouse su una coperta termica mentre si riprende dall'anestesia.
   3. Il giorno seguente dopo l'intervento chirurgico, iniettare sottocutaneamente analgesico (buprenorfina) e aggiungere 3 mL di ibuprofene liquido (40 mg/mL) in 250 mL di acqua potabile per 1 settimana.
3. Antagomir sistemico trattamento
   NOTA: Eseguire questo passaggio 2-3 settimane dopo l'iniezione cellulare, quando il segnale bioluminescente è rilevabile.
   1. Sospendere l'antagomir o il controllo negativo nell'acqua distillata priva di RNase.
   2. Prima dell'iniezione, preparare 7 nmol dell'antagomiR o il controllo insieme al reagente di consegna in vivo per ogni iniezione.
      1. Per l'antagomiR e la preparazione della soluzione reagente di emissione in vivo, vedere il passaggio 1.3, ma aggiungere 7 nmol del miRNA-inibitore per mouse.
   3. Somministrare la soluzione per via endovenosa mediante iniezione retroorbitale del seno venoso del topo. Uso isoflurane per indurre l'anestesia.
      NOTA: Valutare il livello di anestesia mediante riflesso pedale (pizzico di dita dell'aldino).
   4. Trattare i topi 3 volte a settimana (lunedì, mercoledì e venerdì) per 2 settimane.
4. Analisi della crescita tumorale
   1. Determinare il segnale bioluminescente del tumore due volte alla settimana per calcolare la crescita del tumore.
      1. Iniettare 50 l di una soluzione da 40 mg/mL di substrato D-lucidferin in ogni momento tramite iniezione sottocutanea.
      2. A 8 min dopo l'iniezione, anestesizzare i topi utilizzando 3% isoflurane mescolato con ossigeno e immaginare il segnale bioluminescente con il software di imaging in vivo.
   2. Una volta ottenuti i segnali di bioluminescenza, analizzare la crescita tumorale confrontando entrambi i trattamenti e determinare il significato utilizzando un test t. Per analizzare la varianza all'interno del gruppo, utilizzare il SEM.
5. Escissione tumorale
   1. Sette giorni dopo la fine del periodo di trattamento dell'antagomiR, sacrificare i topi, eccitare il tumore ed estrarre proteine e/o RNA per analisi future. In alternativa, sezionare i tumori e fissarli per l'immunoistochimica.

Risultati

Abbiamo usato due diversi modelli di topi per determinare se la neutralizzazione di un miRNA potrebbe sopprimere la crescita tumorale. Di conseguenza, le cellule tiroide del tumore umano Cal62-luc sono state iniettate sottocutaneamente nei fianchi dei topi nudi per generare un modello di xenografo. Dopo due settimane, i tumori sono stati stabiliti e potrebbero essere misurati con pinze. A quel punto, i topi sono stati iniettati intratumoralmente con l'inibitore miR-146b, o un controllo appropriato, e il volume del tumore...

Discussione

Questo documento descrive un metodo per studiare la funzione in vivo di un miRNA al fine di comprendere meglio il suo ruolo nell'avvio e nella progressione del tumore, e il suo potenziale come bersaglio terapeutico nel cancro della tiroide. I modelli di xenotrapianto tumorale qui descritti si basano sull'uso di cellule che possono essere monitorate dal loro segnale di bioluminescenza, permettendo la misurazione della crescita del tumore in vivo sotto l'influenza di un trattamento. Inoltre, descriviamo l'uso di un trattam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS