在微RNA的Vivo抑制下，降低小鼠的肿瘤生长

摘要

该协议将人类甲状腺肿瘤的异种移植和正交小鼠模型描述为测试基于微RNA的抑制剂治疗的平台。该方法是研究非编码RNA的功能及其作为新的治疗靶点的潜力的理想选择。

摘要

微RNA（miRNA）是基因表达的重要调节器，通过它们破坏mRNA和抑制目标mRNA的翻译的能力。越来越多的研究已经确定miRNA是癌症诊断和治疗的潜在生物标志物，也是治疗目标，为癌症评估和治疗增加了一个额外的维度。在甲状腺癌的背景下，肿瘤的产生不仅来自重要基因的突变，还来自许多miRNA的过度表达。因此，miRNA在甲状腺基因表达控制中的作用正在演变为癌症的重要机制。本文提出一个方案，利用人类肿瘤异种移植和正交小鼠模型，研究miRNA抑制剂作为甲状腺癌治疗方式的效果。在工程稳定甲状腺肿瘤细胞表达GFP和荧光素酶后，细胞被注射到裸鼠中，形成肿瘤，随后可发生生物发光。体内抑制miRNA可以降低肿瘤生长，提高miRNA基因靶点。除了确定新的治疗靶点外，该方法还可用于评估确定 miRNA 在体内的重要性。

引言

甲状腺癌是一种内分泌恶性肿瘤，发病率不断增加，虽然一般说来，它有很好的结果1。然而，一些患者发展为无法治疗的侵略性疾病，并且对分子基础知之甚少2。

miRNA 是 22 核苷酸长的非编码 RNA，用于调节许多组织中的基因表达，通常通过基对结合到目标信使RNA （mRNA） 的 3' 非转化区域 （3'UTR），触发 mRNA 退化或转化抑制^3,4.越来越多的证据表明，微RNA表达的放松管制是癌症的标志，因为这些分子调节增殖信号、迁移、入侵和转移，并能抵抗凋亡^5，6.近年来，许多研究已经确定miRNA是癌症诊断和预后的潜在生物标志物，以及治疗目标7，为癌症评价和治疗提供了新的维度。

miRNA在人类分子肿瘤学中已成为人类甲状腺肿瘤8、9、10、11、12的关键驱动因素。在miRNA向上调节， miR-146b是高度过度表达在皮皮脑甲状腺癌 （PTC） 肿瘤， 并证明显着显著增加细胞增殖， 并与侵略性和令人沮丧的预后^{6，12,13,14,15.}此外，miR-146b调节与^分化12有关的几个甲状腺基因，以及重要的肿瘤抑制基因，如PTEN16和DICER117。尽管miRNA疗法在癌症生物学中很重要，但仍处于早期阶段，很少有研究涉及甲状腺癌——最频繁的内分泌^肿瘤18。在这里，我们描述了一种协议，使用两种不同的小鼠模型与人类衍生的肿瘤，其中，一个合成miRNA抑制剂（antagomiR）的分用，专门抑制细胞miRNA可以阻止肿瘤生长。我们首先使用一种常见的异种移植模型，而一种拮抗性肿瘤的局部肿瘤内管理降低了肿瘤的生长，测量为肿瘤生物^发光16的减少。由于建立模仿人类肿瘤进展的强健小鼠模型对于开发独特的治疗方法至关重要，因此，原发性人类肿瘤的正射体植入是新药临床验证的更有价值的平台。皮下植入模型。因此，为了更好地评估拮抗性小鼠的治疗潜力，我们使用了在血流中系统传递的正交小鼠模型，获得了相同的结果。

研究方案

动物实验是经欧洲委员会高级委员会道德委员会（CSIC，西班牙）批准，根据欧洲共同体法（86/609/EEC）和西班牙法律（R.D.1201/2005）进行的。

1. 细胞的侧角接种和肿瘤内性肿瘤治疗

1. 细胞制备
   1. 设计Cal62人类甲状腺癌细胞系（KRAS^G12R和p53^A161D突变），以过度表达一种转基因结构，该结构构成表达GFP和荧光素酶（CMV-萤火虫Luc-IRES-eGFP）。通过抗生素耐药性或通过流式细胞测定对GFP阳性细胞进行分类，选择转基因细胞。
   2. 在37°C和5%CO₂下，在Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM）中生长细胞，辅以青霉素、链霉素和10%胎儿牛血清（FBS）。
   3. 在4°C下在50μL的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中悬浮1 x 10⁶个细胞。
2. 细胞接种到小鼠的侧翼
   1. 用相同数量的基底膜基质混合细胞。例如，在PBS的50μL中加入1 x 10⁶个细胞到50μL的基底膜基质（见材料表），然后轻轻混合。
      注意:
   2. 使用 1 mL 胰岛素注射器，使用 27G 1/2' （0.4x13 mm） 针头将 100 μL 的样品（PBS + 基底膜基质中的细胞）分皮注射到 6 周一岁的免疫缺陷 BALB/c nu/nu小鼠的左侧。
3. 肿瘤内性肿瘤治疗。
   1. 在500μL无RNase蒸馏水中暂停抗逆极性（见材料表）或负控制。
   2. 注射前，每次注射时，与体内输送试剂（见材料表）一起制备2 nmol的拮抗醇或对照。
      1. 首先将拮抗美感溶液（见材料表）和复杂缓冲液（见材料表）以1:1的比例混合。例如，将80μL的miRNA抑制剂溶液（16 nmol）加入80μL的复合缓冲液（包含在体内输送试剂试剂盒中，见材料表）。
      2. 将体内输送试剂带入室温。将 160 μL 添加到 1.5 mL 管中，并立即添加 160 μL 的稀释拮抗性解溶液。将剩余的试剂返回-20°C。如有必要，在解冻后将试剂储存在4°C下长达一周。
      3. 涡旋立即（10 s），以确保体内输送试剂-安塔戈米R的复杂化。
      4. 在50°C下孵育体内输送试剂-安塔戈米R混合物30分钟。将管短暂离心以回收样品。
      5. 通过添加 1360 μL 的 PBS pH 7.4 稀释复合物 6 倍，并混合均匀。
      6. 继续在体内输送试剂-拮抗性R复合物（8只小鼠/条件），或在注射前将复合物储存在4°C下长达一周。在肿瘤内注射200μL到每个肿瘤（2 nmol的拮抗性肿瘤）。
         注: 拮抗性肿瘤的体积和数量与肿瘤体积无关。
   3. 每周（周一、周三和周五）进行3次治疗，为期2周。
4. 肿瘤生长分析
   1. 在每个时间点用1mL注射器注射50μL的D-荧光素基板溶液（见材料表）。
      1. 在注射后8分钟，使用与氧气混合的3%的杂露剂对小鼠进行麻醉。通过踏板反射（坚定的脚趾捏）评估麻醉水平，并酌情调整麻醉分娩，以维持手术平面。
      2. 在双眼应用眼膏，以防止干燥。
   2. 使用体内成像软件成像生物发光信号（参见材料表）。
      注:卡钳也可用于测量肿瘤体积和肿瘤生长。
   3. 获得生物发光信号后，分析两种治疗方法的肿瘤生长，并使用t检验确定其显著性。要分析组内差异，请使用 SEM。
5. 肿瘤切除
   1. 在拮抗性R治疗结束七天后，牺牲小鼠，切除肿瘤，提取蛋白质和/或RNA，以用于未来分析。或者，分割肿瘤，并修复它们进行免疫组化学。

2. 甲状腺正位接种细胞和全身性拮抗性治疗

1. 细胞制备
   1. 设计一个Cal62人类甲状腺癌细胞系，以过度表达一种转基因结构，该结构构成表达GFP和荧光素酶。通过抗生素耐药性或通过流式细胞测定对GFP阳性细胞进行分类，选择转基因细胞。
   2. 在DMEM中生长这些细胞，辅以抗生素（青霉素和链霉素）和10%FBS在37°C和5%CO_2。
   3. 在5μL的PBS中悬浮1 x 10⁵个细胞。
2. 细胞接种到小鼠的甲状腺
   1. 向7周大的BALB/c nu/nu小鼠注射100μL镇痛药（丁丙诺啡）和100μL抗生素（头孢菌素）皮下注射。 用酒精消毒注射部位。
   2. 将5μL的细胞溶液注射到小鼠的甲状腺中。
      1. 使用与氧气混合的3%异二苯基对小鼠进行麻醉，并将其置于无菌流动柜的立体显微镜下。 通过踏板反射（坚定的脚趾捏）评估麻醉水平，并酌情调整麻醉分娩，以维持手术平面。
      2. 在双眼应用眼膏，以防止干燥。
      3. 对于每只小鼠，用碘多波维酮对颈部进行消毒，用剪刀在皮肤上切开约2厘米。一旦打开，通过取代唾液腺暴露颈部。
      4. 使用解剖钳和/或剪刀切除表带肌肉，以暴露气管和甲状腺。使用 10 μL 微升注射器将 5 μL 的细胞溶液注射到位于软骨一侧的右甲状腺球小球中。
      5. 使用编织、涂层、不可吸收缝合用丝绸重新定位唾液腺和缝合切口。
      6. 将碘多波维酮添加到伤口区域，并将鼠标放在从麻醉中恢复的气皮毯上。
   3. 手术后第二天，注射皮下镇痛药（丁丙诺啡），在250 mL的饮用水中加入3 mL的液体布洛芬（40mg/mL），为期1周。
3. 系统性拮抗性治疗
   注:在细胞注射后2-3周，当生物发光信号可检测到时，执行此步骤。
   1. 在蒸馏无RNase水中暂停抗性控制或负控制。
   2. 注射前，每次注射时，将7 nmol的拮抗醇或控制与体内输送试剂一起制备。
      1. 对于拮抗性抗剂和体内输送试剂溶液的制备，请参阅步骤1.3，但每只小鼠添加7 nmol的miRNA抑制剂。
   3. 通过小鼠静脉主塞的逆行注射静脉注射静脉注射溶液静脉注射。使用胶质诱导麻醉。
      注:通过踏板反射（紧实的脚趾捏合）评估麻醉水平。
   4. 每周治疗小鼠3次（星期一、星期三和星期五）2周。
4. 肿瘤生长分析
   1. 确定肿瘤生物发光信号每周两次，以计算肿瘤生长。
      1. 通过皮下注射在每个时间点注射50μL的D-荧光素基质溶液。
      2. 在注射后8分钟，使用3%的胶质与氧气混合的胶合剂对小鼠进行麻醉，并用体内成像软件将生物发光信号图像化。
   2. 获得生物发光信号后，分析两种治疗方法的肿瘤生长，并使用t检验确定其显著性。要分析组内差异，请使用 SEM。
5. 肿瘤切除
   1. 在拮抗性R治疗期结束后的七天内，牺牲小鼠，切除肿瘤并提取蛋白质和/或RNA，以进行未来分析。或者，分割肿瘤，并修复它们进行免疫组化学。

结果

我们使用两个不同的小鼠模型来确定miRNA的中和是否能抑制肿瘤生长。因此，人类肿瘤甲状腺Cal62-luc细胞被分皮注射到裸鼠的侧翼，以生成异形文字模型。两周后，肿瘤成立，可以用卡钳测量。当时，小鼠在肿瘤内注射miR-146b抑制剂，或适当的对照，肿瘤体积再跟踪两周（图1A）。如图1B所示，在肿瘤内注射miR-146b抑制剂（抗146b）（n=8）的肿瘤生长对阴?...

讨论

本文介绍了一种研究miRNA体内功能的方法，以更好地了解其在肿瘤启动和进展中的作用，以及其作为甲状腺癌治疗靶点的潜力。这里描述的肿瘤异种移植模型基于细胞的使用，这些细胞可以通过其生物发光信号进行跟踪，从而允许在治疗的影响下测量体内的肿瘤生长。此外，我们描述了使用基于miRNA的甲状腺癌治疗，目前处于早期阶段。

我们首先使用皮下异种移植模型测试了m...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS