ב Vivo עיכוב של מיקרואורנה כדי להקטין את צמיחת הגידול בעכברים

Summary

פרוטוקול זה מתאר מבע ו אורתובנושא מודלים העכבר של בלוטת התריס האנושית tumorigenesis כפלטפורמה לבדוק טיפולים מעכבי מבוססי-אורנה. גישה זו אידיאלית כדי ללמוד את הפונקציה של RNAs ללא קידוד והפוטנציאל שלהם כמטרות טיפוליות חדשות.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) הם הרגולטורים חשובים של ביטוי גנים דרך היכולת שלהם לערער את היציבות mRNA ולעכב את התרגום של Mrna היעד. מספר גדל והולך של מחקרים זיהו miRNAs כסמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, וגם כמו מטרות טיפוליות, הוספת ממד נוסף להערכת סרטן וטיפול. בהקשר של סרטן בלוטת התריס, התוצאות tuמוריגנזה לא רק מוטציות בגנים חשובים, אלא גם מהבעת היתר של miRNAs רבים. בהתאם, התפקיד של miRNAs בשליטה של ביטוי גנים בלוטת התריס מתפתחת כמנגנון חשוב בסרטן. בזאת, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבחון את ההשפעות של משלוח miRNA-מעכבי כמו מודאליות טיפולית בסרטן בלוטת התריס באמצעות השתלת הגידול האנושי מודלים אורתוקפית העכבר. לאחר בלוטת התריס יציבה הנדסה מוסרי תאים המבטא GFP ו לluciferase, תאים מוזרק לתוך עכברים ערומים לפתח גידולים, אשר ניתן לאחר מכן ביולומינסנציה. בעיכוב vivo של miRNA יכול להפחית את צמיחת הגידול ו upregulate miRNA מטרות גנים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך את חשיבותו של miRNA נחושה בvivo, בנוסף לזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.

Introduction

סרטן בלוטת התריס הוא ממאירות אנדוקרינית עם שכיחות הולך וגובר, למרות במונחים כלליים יש תוצאה טובה¹. עם זאת, חלק מהחולים לפתח צורות אגרסיביות של המחלה כי הם ללא טיפול ובסיסים מולקולריים הבינו בצורה עלובה².

miRNAs הם 22-נוקלאוטיד ארוך שאינו קידוד RNAs כי לווסת ביטוי גנים ברקמות רבות, בדרך כלל על ידי כריכת זוג בסיס ל 3 ' אזור untranslational (3 ' UTR) של שליח היעד RNAs (mRNAs), הפעלה של השפלה או הדיכוי הטרנסאפילי של Mrnas מיכל שלוש ^{, 4}. יש ראיות הגוברת הוכחת כי רגולציה של הביטוי מיקרואורנה הוא סימן ההיכר של סרטן, כמו אלה מולקולות לווסת איתות מתרבים, הגירה, הפלישה גרורות, והוא יכול לספק התנגדות אפופטוזיס ^5,6. בשנים האחרונות, מחקרים רבים זיהו miRNAs כמו סמנים פוטנציאליים לאבחון סרטן פרוגנוזה, כמו גם מטרות טיפוליות⁷, מתן ממד חדש להערכת סרטן וטיפול.

mirnas לקחו את הבמה במרכז האונקולוגיה האנושית כמו נהגים מרכזיים של האדם בלוטת התריס נחיים^8,9,10,^11,12. בין miRNAs מוסדר, מיר-146b הוא מבוטא מאוד בבלוטת התריס קרצינומה (PTC) גידולים והוכח באופן משמעותי להגדיל את התפשטות התא, ולהיות משויך אגרסיביות ופרוגנוזה עגומה^6, מיכל ^{בן 12 ,} מיכל ^{בן 13 ,} מיכל ^{בן 14 , 15}. יתר על כן, מיר-146b מסדיר מספר גנים בלוטת התריס המעורבים בבידול¹², וגם גנים חשובים מדכא הגידול כגון PTEN¹⁶ ו DICER1¹⁷. למרות החשיבות שלהם בביולוגיה של סרטן, miRNA מבוססי טיפול בסרטן עדיין בשלבים המוקדמים שלה, ומחקרים מעטים מאוד התייחסו לסרטן בלוטת התריס-התכופים ביותר של גידולים האנדוקרינית¹⁸. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות שני דגמי העכבר השונים עם האדם הנגזר גידולים, שבו המינהל של מירנה סינתטי מעכבי (antagomiR) כי מעכב באופן ספציפי miRNA הסלולר יכול לחסום את צמיחת הגידול. השתמשנו לראשונה במודל משותף של מבע, ואת intratumor המקומי הממשל של antagomiR ירד גידול הגידול נמדד כירידה בביולומילומינציה הגידול¹⁶. בגלל הקמתה של דגמים חזקים של העכבר מחקה התקדמות הגידול האנושי חיוני כדי לפתח גישות טיפוליות ייחודי, אורתודהשרשה של גידולים אנושיים העיקרי היא פלטפורמה יקר יותר עבור אימות קליני של תרופות חדשות מאשר דגמים השרשה תת-עורית. כך, על מנת להעריך טוב יותר את הפוטנציאל התרפויטי של antagomiR, השתמשנו מודל העכבר אורתוטופית עם משלוח מערכתי בזרם הדם, קבלת תוצאות זהות.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לחוק הקהילה האירופי (86/609/EEC) ולחוק הספרדי (ר לוך 1201/2005), באישור ועדת האתיקה של המשרד העליון של Consejo (CSIC, ספרד).

1. מאגף לתאי תאים וטיפול antagomiR מוסרי

1. הכנה לתאים
   1. מהנדס Cal62 האנושי סרטן בלוטת התריס קו תא (קראס^G12R ו p53^A161D מוטציות) כדי לבטא את המבנה הטרנסגניים המבטא באופן מוגזם gfp ו לוציפראז (Cmv-ללוק גחלילית-IRES-egfp). בחר את התאים הטרנסגניים על ידי עמידות לאנטיביוטיקה או על ידי מיון תאים GFP-חיוביים עם הזרימה cy, לנסות.
   2. לגדל את התאים בדולב́s שונה הנשר ́s בינונית (DMEM) שיושלם עם פניצילין, סטרפטומיצין ו 10% סרום בפרה העובר (FBS) ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
   3. להשעות 1 x 10⁶ תאים ב 50 μl של פוספט מאגור פוספטים (PBS) ב 4 ° c.
2. תא החיסון לתוך מאגפים של עכברים
   1. מערבבים את התאים עם אותה כמות של מטריצת קרום המרתף. לדוגמה, להוסיף 1 x 10⁶ תאים ב 50 ΜL של PBS כדי 50 μl של מטריצה קרום המרתף (ראה טבלת חומרים) ולערבב בעדינות.
      הערה
   2. הכנס 100 μL של המדגם (תאים ב-PBS + המרתף ממברנה הממברנה) תת-עורי לתוך האגף השמאלי של החיסוני 6-שבוע-בן BALB/c נו/נו עכברים באמצעות מזרק 1 מ"ל אינסולין עם 27g 1/2 ' ' (0.4 x13 mm) מחט.
3. טיפול antagomiR.
   1. השהה את antagomiR (ראה טבלת חומרים) או את השליטה השלילית ב-500 μl של מים מזוקקים חינם RNase.
   2. לפני ההזרקה, להכין 2 nmol של antagomiR או את השליטה יחד עם vivo משלוח מגיב (ראה לוח חומרים) עבור כל זריקה.
      1. ראשית לערבב את הפתרון antagomiR (ראה טבלת חומרים) ואת מאגר complexation (ראה לוח חומרים) ביחס 1:1. לדוגמה, להוסיף 80 μL של הפתרון miRNA-מעכב (16 nmol) ל 80 μL של complexation מאגר (כלול בערכה vivo משלוח משלוחים, ראה טבלת חומרים).
      2. הביאו את האספקה הvivo. הכימית לטמפרטורת החדר הוסף 160 μL ל שפופרת 1.5-mL ומיד להוסיף 160 μL של פתרון antagomiR מדולל. החזר את התוספת הכימית ל-20 ° c. במקרה הצורך, יש לאחסן את המנה הכימית ב-4 ° צ' למשך שבוע לאחר הפשרה.
      3. מערבולת מיד (10 s) כדי להבטיח complexation של vivo משלוח מגיב-antagomiR.
      4. מודטה the vivo משלוח מגיב antagomiR תערובת במשך 30 דקות ב 50 ° c. צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר כדי לשחזר את המדגם.
      5. לדלל את מורכבות 6-קיפול על-ידי הוספת 1360 μL של PBS pH 7.4 ומערבבים היטב.
      6. המשך עם משלוח vivo של מתחם הantagomiR-מגיב (8 עכברים/תנאי), או אחסן את הקומפלקס ב -4 ° צ' עד שבוע לפני ההזרקה. הכנס 200 μL מוסרית לכל גידול (2 nmol של antagomiR).
         הערה: אמצעי האחסון והכמות של antagomiR אינו תלוי בעוצמת הגידול.
   3. לבצע את הטיפול 3 פעמים בכל שבוע (יום שני, רביעי ושישי) במשך 2 שבועות.
4. ניתוח גידול בגידולים
   1. הכנס 50 μL של פתרון 40 mg/mL של המצע D-לוציב (ראה טבלת חומרים) תת-עורי בכל נקודת זמן עם מזרק 1 מ ל עם שולחן 27g 1/2 ' ' (0.4 mm x 13 מ"מ) מחט.
      1. ב 8 דקות לאחר ההזרקה, מורדם העכברים באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן. להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (הבוהן צביטה בוהן) ולהתאים משלוח הרדמה כראוי כדי לשמור על מטוס כירורגי.
      2. החלת משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
   2. צלם את האות הביולומיאלי עם תוכנת הדמיה vivo (ראה טבלת חומרים).
      הערה: אפשר להשתמש גם כדי למדוד את נפח הגידול ואת צמיחת הגידול.
   3. לאחר השגת אותות הביולומינציה מתקבלים, לנתח את הצמיחה המוסרית השוואת שני הטיפולים ולקבוע את המשמעות באמצעות מבחן t. כדי לנתח את השונות שבתוך הקבוצה, השתמש ב-SEM.
5. כריתה של הגידול
   1. שבעה ימים לאחר סיום הטיפול antagomiR, להקריב את העכברים, לבלו את הגידול ולחלץ חלבון ו/או RNA לניתוח עתידי. לחילופין, מדור גידולים ולתקן אותם עבור אימונוהיסטוכימיה.

2. בלוטת התריס אורתוטופית של תאים וטיפול antagomiR מערכתי

1. הכנה לתאים
   1. מהנדס Cal62 האנושי סרטן בלוטת התריס קו תא כדי לבטא מבנה טרנסגניים המבטא באופן מוגזם GFP ו לluciferase. בחר את התאים הטרנסגניים על ידי עמידות לאנטיביוטיקה או על ידי מיון תאים GFP-חיוביים עם הזרימה cy, לנסות.
   2. לגדל תאים אלה בתוספת DMEM עם אנטיביוטיקה (פניצילין ו סטרפטומיצין) ו-10% FBS ב 37 ° צ' ו 5% CO₂.
   3. להשעות 1 x 10⁵ תאים 5 ΜL של PBS.
2. תא החיסון לבלוטת התריס של עכברים
   1. הכנס 100 μL של כאבים (בופרינורפין) ו 100 μL של אנטיביוטיקה (צפלוספורין) תת-עורי לתוך 7-שבוע בן BALB/c נו/נו עכברים. לחטא את אתר ההזרקה. עם אלכוהול
   2. הכנס 5 μL של פתרון התא לתוך בלוטת התריס של העכברים.
      1. לשים את העכבר באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן ולמקם אותו תחת stereomicroscope בארון זרימה סטרילית.  להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (הבוהן צביטה בוהן) ולהתאים משלוח הרדמה כראוי כדי לשמור על מטוס כירורגי.
      2. החלת משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות.
      3. עבור כל עכבר, לחטא את הצוואר עם שפתי-העין ולעשות חתך של המשוער 2 ס מ בעור עם מספריים. לפתוח פעם, לחשוף את הצוואר על ידי העקירה של בלוטות הרוק.
      4. לנתח את שרירי הרצועה באמצעות מלקחיים ו/או מספריים לחשוף את קנה הנשימה ואת בלוטת התריס. באמצעות הזרקת מזרק מיקרולויטר 10 μL 5 μL של פתרון התא לתוך כדורית בלוטת התריס הימנית, ממוקם בצד של הסחוס cricoid.
      5. למקם מחדש את בלוטות הרוק ולתפור את החתך עם משי באמצעות התפר קלוע, מצופה, לא נספגים תפרים.
      6. הוסף שפתי-על לאזור הפצע ולמקם את העכבר על שמיכה תרמיים בזמן שהוא מתאושש מן ההרדמה.
   3. למחרת לאחר ניתוח, להזריק תת-עורי משכך כאבים (buprenorphine) ולהוסיף 3 מ ל איבופרופן נוזלי (40 mg/mL) לתוך 250 mL של מי שתייה במשך 1 שבוע.
3. AntagomiR מערכתית טיפול
   הערה: בצע שלב זה 2-3 שבועות לאחר הזרקת התא, כאשר האות הביולומיאלי נמצא בזיהוי.
   1. השהה את antagomiR או את השליטה השלילית במים מזוקקים RNase-free.
   2. לפני הזריקה, להכין 7 nmol של antagomiR או את השליטה יחד עם vivo משלוח מגיב עבור כל זריקה.
      1. עבור antagomiR ו ב vivo מסירה הכנה הפתרון מגיב לראות שלב 1.3 אבל להוסיף 7 nmol של מעכב miRNA לכל עכבר.
   3. מנהל את הפתרון באופן מבוקר על ידי הזרקה רטרו מסלולית של הסינוס ורידים של העכבר. בסדר.
      הערה: להעריך את רמת ההרדמה על ידי הדוושה רפלקס (צביטה הבוהן המשרד).
   4. פנקו את העכברים 3 פעמים בשבוע (יום שני, רביעי ושישי) במשך שבועיים.
4. ניתוח גידול בגידולים
   1. לקבוע את אות הגידול הביולומיאלי פעמיים בשבוע כדי לחשב את צמיחת הגידול.
      1. הכנס 50 μL של פתרון 40 mg/mL של המצע D-לוציב בכל נקודת זמן באמצעות הזרקה תת עורית.
      2. ב 8 דקות לאחר ההזרקה, מורדם העכברים באמצעות 3% isof, מעורבב עם חמצן ותמונה האות ביולומינטיום עם תוכנת דימות vivo.
   2. לאחר השגת אותות הביולומינציה מתקבלים, לנתח את הצמיחה המוסרית השוואת שני הטיפולים ולקבוע את המשמעות באמצעות מבחן t. כדי לנתח את השונות שבתוך הקבוצה, השתמש ב-SEM.
5. כריתה של הגידול
   1. שבעה ימים לאחר סיום תקופת הטיפול antagomiR, להקריב את העכברים, לבלו את הגידול ולחלץ חלבון ו/או RNA לניתוח עתידי. לחילופין, מדור גידולים ולתקן אותם עבור אימונוהיסטוכימיה.

תוצאות

השתמשנו שני מודלים עכברים שונים כדי לקבוע אם נטרול של miRNA יכול לדכא את צמיחת הגידול. לכן, הגידול האנושי בלוטת התריס Cal62-לוק תאים היו תת-עורי וזרק לתוך מאגפים של עכברים ערומים כדי ליצור דגם xenograph. לאחר שבועיים הוקמו גידולים וניתן למדוד אותם בעזרת מחוגות. בשלב זה, עכברים הוזרקו מבחינה מוסרית עם...

Discussion

נייר זה מתאר שיטה ללמוד בפונקציה vivo של miRNA כדי להבין טוב יותר את תפקידה בייזום הגידול והתקדמות, ואת הפוטנציאל שלה כיעד טיפולית בסרטן בלוטת התריס. מודלים מבע הגידול כאן מבוססים על השימוש בתאים שניתן מעקב על ידי האות הביולומינציה שלהם, המתיר את המדידה של גידול בגידול בvivo תחת השפעת הטיפול. בנו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS