In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo Inhibition of MicroRNA to Decrease Tumor Growth in Mice In Vivo

Résumé

Ce protocole décrit les modèles de souris xénogreffes et orthotopiques de la tumorigénèse thyroïdienne humaine comme plate-forme pour tester des traitements inhibiteurs à base de microARN. Cette approche est idéale pour étudier la fonction des ARN non codants et leur potentiel en tant que nouvelles cibles thérapeutiques.

Résumé

Les microARN (miARN) sont d'importants régulateurs de l'expression génique grâce à leur capacité à déstabiliser l'ARNm et à inhiber la traduction des ARNc cibles. Un nombre sans cesse croissant d'études ont identifié les miARN comme des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic du cancer, ainsi que comme des cibles thérapeutiques, ajoutant une dimension supplémentaire à l'évaluation et au traitement du cancer. Dans le contexte du cancer de la thyroïde, la tumorigénèse résulte non seulement de mutations dans des gènes importants, mais aussi de la surexpression de nombreux miARN. En conséquence, le rôle des miARN dans le contrôle de l'expression des gènes thyroïdiens évolue comme un mécanisme important dans le cancer. Ici, nous présentons un protocole pour examiner les effets de la livraison miRNA-inhibiteur comme modalité thérapeutique dans le cancer thyroïde utilisant le xénogreffe humain de tumeur et les modèles orthotopic de souris. Après l'ingénierie des cellules tumorales thyroïdiennes stables exprimant le GFP et la luciferase, les cellules sont injectées dans les souris nues pour développer des tumeurs, qui peuvent être suivies par la bioluminescence. L'inhibition in vivo d'un miRNA peut réduire la croissance tumorale et réguler les cibles du gène miRNA. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l'importance d'un miRNA déterminé in vivo, en plus d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Introduction

Le cancer de la thyroïde est une malignité endocrinienne avec une incidence croissante, bien qu'en termes généraux il ait un bon résultat¹. Néanmoins, certains patients développent des formes agressives de la maladie qui sont incurables et les bases moléculaires sont mal comprises².

Les miARN sont des ARN non codants de 22 nucléotides qui régulent l'expression des gènes dans de nombreux tissus, généralement par liaison de base-paire à la région non translationnelle de 3' (3'UTR) des ARN de messager cible (ARNM), déclenchant la dégradation de l'ARNm ou la répression translationnelle ^{3 (en) , 4}. Il y a de plus en plus de preuves démontrant que la déréglementation de l'expression des microARN est une caractéristique du cancer, car ces molécules modulent la signalisation proliférante, la migration, l'invasion et la métastasie, et peuvent fournir une résistance à l'apoptose ^5,6. Ces dernières années, de nombreuses études ont identifié les miARN comme des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic et le pronostic du cancer ainsi que des cibles thérapeutiques⁷, fournissant une nouvelle dimension à l'évaluation et au traitement du cancer.

miRNAs ont pris le devant de la scène en oncologie moléculaire humaine en tant que moteurs clés des néoplasmes thyroïdiens humains^8,9,10,11,12. Parmi les miRNAs up-regulated, miR-146b est fortement surexprimé dans les tumeurs de carcinome thyroïde papillaire (PTC) et a été montré pour augmenter de manière significative la prolifération cellulaire, et pour être associé à l'agressivité et au pronostic lamentable^{6, 12 Ans, états-unis , 13 (en) , 14 (en) , 15}. En outre, miR-146b régule plusieurs gènes thyroïdiens impliqués dans la différenciation¹², et aussi des gènes suppresseurs de tumeurs importants tels que PTEN¹⁶ et DICER1¹⁷. Malgré leur importance dans la biologie du cancer, la thérapie contre le cancer à base de miARN en est encore à ses premiers stades, et très peu d'études ont abordé le cancer de la thyroïde - la plus fréquente des tumeurs endocriniennes¹⁸. Ici nous décrivons un protocole utilisant deux modèles différents de souris avec des tumeurs d'origine humaine, dans lequel l'administration d'un miRNA-inhibiteur synthétique (antagomiR) qui inhibe spécifiquement un miRNA cellulaire peut bloquer la croissance de tumeur. Nous avons d'abord employé un modèle commun de xénogreffe, et l'administration intratumorale locale d'une croissance diminuée de tumeur antagomiR mesurée comme réduction de la bioluminescence de tumeur¹⁶. Parce que l'établissement de modèles de souris robustes imitant la progression des tumeurs humaines est essentiel pour développer des approches thérapeutiques uniques, l'implantation orthotopique de tumeurs humaines primaires est une plate-forme plus précieuse pour la validation clinique de nouveaux médicaments que modèles d'implantation sous-cutanée. Ainsi, afin de mieux évaluer le potentiel thérapeutique de l'antagomiR, nous avons utilisé un modèle de souris orthotopic avec la livraison systémique dans la circulation sanguine, obtenant les mêmes résultats.

Protocole

L'expérimentation animale a été réalisée conformément au droit communautaire européen (86/609/CEE) et au droit espagnol (R.D. 1201/2005), avec l'approbation du Comité d'éthique du Consejo Superior de Investigaciones Cient-ficas (CSIC, Espagne).

1. Inoculation de flanc des cellules et traitement antagomiR intratumoral

1. Préparation cellulaire
   1. Ingénieur d'une lignée de cellules cancéreuses de la thyroïde humaine Cal62 (KRAS^G12R et p53^A161D mutations) pour surexprimer une construction transgénique qui exprime constitutivement GFP et luciferase (CMV-Firefly Luc-IRES-eGFP). Sélectionnez les cellules transgéniques par résistance aux antibiotiques ou en triant les cellules GFP-positives avec cytométrie de flux.
   2. Cultivez les cellules du milieu de l'aigle modifié (DMEM) modifié de Dulbecco, complétées par de la pénicilline, de la streptomycine et 10 % du sérum bovin fœtal (SGF) à 37 oC et 5 % de CO_2.
   3. Suspendre 1 x 10⁶ cellules dans 50 'L de phosphate tamponné salin (PBS) à 4 oC.
2. Inoculation cellulaire sur les flancs des souris
   1. Mélanger les cellules avec la même quantité de matrice de membrane de sous-sol. Par exemple, ajouter 1 x 10⁶ cellules dans 50 OL de PBS à 50 oL de matrice membranaire du sous-sol (voir Tableau des matériaux)et mélanger délicatement.
      note:
   2. Injecter 100 L de l'échantillon (cellules dans la matrice de membrane de PBS et sous-sol) sous-cutané dans le flanc gauche des souris immunodéficientes BALB/c nu/nu de 6 semaines à l'aide d'une seringue à insuline de 1 mL avec une aiguille de 27 G 1/2 (0,4x13 mm).
3. Traitement antagomiR intratumoral.
   1. Suspendre l'antagomiR (voir Tableau des matériaux)ou le contrôle négatif dans 500 l'eau distillée sans RNase.
   2. Avant l'injection, préparer 2 nmol de l'antagomiR ou le contrôle avec un réactif de livraison in vivo (voir Tableau des matériaux) pour chaque injection.
      1. Mélanger d'abord la solution antagomiR (voir Tableau des matériaux) et le tampon de complexation (voir Tableau des matériaux) dans un rapport 1:1. Par exemple, ajoutez 80 l de solution d'inhibiteur de miRNA (16 nmol) à 80 'L de mémoire tampon de complexation (inclus dans le kit de réactif de livraison in vivo, voir Tableau des matériaux).
      2. Apportez le réactif de livraison in vivo à la température ambiante. Ajouter 160 l à un tube de 1,5 ml et ajouter immédiatement 160 l de solution antagomiR diluée. Remettre le réactif restant à -20 oC. Si nécessaire, conserver le réactif à 4 oC jusqu'à une semaine après la décongélation.
      3. Vortex immédiatement (10 s) pour assurer la complexation du réactif-antagomiR de livraison in vivo.
      4. Incuber le mélange réactif-antagomiR in vivo pendant 30 min à 50 oC. Centrifuger le tube brièvement pour récupérer l'échantillon.
      5. Diluer le complexe 6 fois en ajoutant 1360 L de PBS pH 7.4 et bien mélanger.
      6. Procédez à la livraison in vivo du complexe réactif-antagomiR (8 souris/condition), ou entreposez le complexe à 4 oC pendant une semaine avant l'injection. Injecter 200 L intratumoraux dans chaque tumeur (2 nmol d'antagomiR).
         REMARQUE : Le volume et la quantité de l'antagomiR sont indépendants du volume de tumeur.
   3. Effectuez le traitement 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) pendant 2 semaines.
4. Analyse de la croissance tumorale
   1. Injecter 50 oL d'une solution de 40 mg/mL de substrat D-luciferin (voir Tableau des matériaux)sous-cutané à chaque point de temps avec une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27 G 1/2'' (0,4 mm x 13 mm).
      1. À 8 min après injection, anesthésier les souris à l'aide de 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène. Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pince ment aux orteils fermes) et ajuster la livraison anesthésique le cas échéant pour maintenir l'avion chirurgical.
      2. Appliquer onduleur ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation.
   2. Imagez le signal bioluminescent avec un logiciel d'imagerie in vivo (voir Tableau des matériaux).
      REMARQUE: Calipers peut également être utilisé pour mesurer le volume de tumeur et la croissance de la tumeur.
   3. Une fois que les signaux de bioluminescence sont obtenus, analyser la croissance tumorale en comparant les deux traitements et déterminer l'importance à l'aide d'un test t. Pour analyser la variance au sein du groupe, utilisez le SEM.
5. Excision de tumeur
   1. Sept jours après la fin du traitement antagomiR, sacrifiez les souris, excisiez la tumeur et extrayez la protéine et/ou l'ARN pour l'analyse future. Alternativement, sectionles les tumeurs et les fixer pour l'immunohistochimie.

2. Inoculation orthotopic thyroïde des cellules et traitement antagomiR systémique

1. Préparation cellulaire
   1. Ingénieur d'une lignée de cellules cancéreuses de la thyroïde humaine Cal62 pour surexprimer une construction transgénique qui exprime constitutivement GFP et luciferase. Sélectionnez les cellules transgéniques par résistance aux antibiotiques ou en triant les cellules GFP-positives avec cytométrie de flux.
   2. Cultivez ces cellules dans le DMEM complétée s'il y a des antibiotiques (pénicilline et streptomycine) et 10 % de FBS à 37 oC et 5 % de CO_2.
   3. Suspendre 1 x 10⁵ cellules dans 5 'L de PBS.
2. Inoculation cellulaire dans la glande thyroïde des souris
   1. Injecter 100 l d'analgésiques (buprénorphine) et 100 l d'antibiotiques (céphalosporine) sous-cutanés dans des souris BALB/c nu/nu de 7 semaines. Désinfecter le site d'injection avec de l'alcool.
   2. Injecter 5 ll de la solution cellulaire dans la glande thyroïde des souris.
      1. Anesthésiez la souris à l'aide de 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène et placez-la sous un stéréomicroscope dans une armoire à débit stérile.  Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pince ment aux orteils fermes) et ajuster la livraison anesthésique le cas échéant pour maintenir l'avion chirurgical.
      2. Appliquer onduleur ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation.
      3. Pour chaque souris, désinfecter le cou avec de l'iodopovideone et faire une incision d'environ 2 cm dans la peau avec des ciseaux. Une fois ouvert, exposer le cou en déplaçant les glandes salivaires.
      4. Disséquer les muscles de la sangle à l'aide de forceps de dissection et/ou de ciseaux pour exposer la trachée et la glande thyroïde. À l'aide d'une seringue de 10 l microlitre injecter 5 l de la solution cellulaire dans le lobule thyroïdien droit, situé sur le côté du cartilage cricoid.
      5. Repositionnez les glandes salivaires et suturez l'incision avec de la soie à l'aide de sutures tressées, enduites et non absorbables.
      6. Ajouter l'iodopovidone à la zone de la plaie et placer la souris sur une couverture thermique pendant qu'elle se remet de l'anesthésie.
   3. Le lendemain, après la chirurgie, injectez subcutanéement analgésique (buprénorphine) et ajoutez 3 ml d'ibuprofène liquide (40 mg/ml) dans 250 ml d'eau potable pendant 1 semaine.
3. AntagomiR systémique traitement
   REMARQUE : Effectuez cette étape 2-3 semaines après l'injection cellulaire, lorsque le signal bioluminescent est détectable.
   1. Suspendre le antagomiR ou le contrôle négatif dans l'eau distillée sans RNase.
   2. Avant l'injection, préparer 7 nmol de l'antagomiR ou le contrôle avec le réactif de livraison in vivo pour chaque injection.
      1. Pour l'antagomiR et la préparation in vivo de solution de réagent de livraison voir l'étape 1.3 mais ajoutez 7 nmol de l'inhibiteur de miRNA par souris.
   3. Administrer la solution par voie intraveineuse par injection rétro-orbitale du sinus veineux de la souris. Utilisez l'isoflurane pour induire l'anesthésie.
      REMARQUE : Évaluer le niveau d'anesthésie par réflexe de pédale (pincement ferme de l'orteil).
   4. Traiter les souris 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi) pendant 2 semaines.
4. Analyse de la croissance tumorale
   1. Déterminer le signal bioluminescent de tumeur deux fois par semaine pour calculer la croissance de tumeur.
      1. Injecter 50 OL d'une solution de 40 mg/mL de substrat D-luciferin à chaque moment par injection sous-cutanée.
      2. À 8 min après injection, anesthésier les souris à l'aide de 3% d'isoflurane mélangé à de l'oxygène et d'imager le signal bioluminescent avec un logiciel d'imagerie in vivo.
   2. Une fois que les signaux de bioluminescence sont obtenus, analyser la croissance tumorale en comparant les deux traitements et déterminer l'importance à l'aide d'un test t. Pour analyser la variance au sein du groupe, utilisez le SEM.
5. Excision de tumeur
   1. Sept jours après la fin de la période de traitement antagomiR, sacrifiez les souris, excisiez la tumeur et extrayez la protéine et/ou l'ARN pour l'analyse future. Alternativement, sectionles les tumeurs et les fixer pour l'immunohistochimie.

Résultats

Nous avons utilisé deux modèles différents de souris pour déterminer si la neutralisation d'un miRNA pourrait supprimer la croissance de tumeur. En conséquence, les cellules de Cal62-luc de tumeur humaine de tumeur ont été sous-cutanéement injectées dans les flancs des souris nues pour produire un modèle xénographe. Après deux semaines, des tumeurs ont été établies et pourraient être mesurées avec des étriers. À ce moment-là, des souris ont été injectées intratumoralement avec l'inhibiteur miR-146b...

Discussion

Cet article décrit une méthode pour étudier la fonction in vivo d'un miRNA afin de mieux comprendre son rôle dans l'initiation et la progression de tumeur, et son potentiel en tant que cible thérapeutique dans le cancer thyroïde. Les modèles de xénogreffe de tumeur décrits ici sont basés sur l'utilisation des cellules qui peuvent être suivies par leur signal de bioluminescence, permettant la mesure de la croissance de tumeur in vivo sous l'influence d'un traitement. En outre, nous décrivons l'utilisation d'un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AntagomiR: mirVana miRNA inhibitor	Thermo Fisher	4464088	In Vivo Ready
Basement Membrane Matrix: Matrigel Basement Membrane Matrix High Concentration	Corning	#354248
DICER antibody	Abcam	ab14601	IHQ: 1/100
In vivo delivery reagent: Invivofectamine 3.0 Reagent	Thermo Fisher	IVF3005
In vivo imaging software: IVIS-Lumina II Imaging System	Caliper Life Sciences
Negative control: mirVana miRNA Inhibitor, Negative Control #1	Thermo Fisher	4464077	In Vivo Ready
PCNA antibody	Abcam	ab92552	WB: 1/2,000
PTEN antibody	Santa Cruz	sc-7974	WB: 1/1,000
XenoLight D-Luciferin - K+ Salt Bioluminescent Substrate	PerkinElmer	122799	Diluted in PBS