الإدارة داخل الشعب الهوائية مباشرة لتحسين ترسب عامل انتقائي داخل الرئة الماوس

Summary

إدارة الرغامى (IT) من العوامل التجريبية في الفئران غالبا ما يؤدي إلى تسليم غير متناظرة إلى الرئتين البعيدة.  في هذا التقرير، نقوم بوصف نهج داخل الشعب الهوائية مباشرة (IB) لcannulate كل رئة في الفئران الحية غير الجراحية.  ويمكن استخدام هذا النهج لإدارة انتقائية وكلاء إلى رئة واحدة أو يمكن تكييفها لتحسين تسليم عامل متناظرة لكلا الرئتين.

Abstract

إدارة الرغامى (IT) من العوامل التجريبية هي تقنية أساسية في نماذج المورين من أمراض الرئة المنتشرة، مثل التليف الرئوي الناجم عن البلميسين.  ومع ذلك، فإن توزيع العوامل التي تدار داخل التراخالية على رئة الفأر البعيدة غالباً ما يكون غير متماثل، مع زيادة تركيزات الرئة في الرئة اليسرى الأصغر (ولكن يمكن الوصول إليها على قدم المساواة).  الموصوفة في هذا التقرير هو نهج جديد داخل الشعب الهوائية (IB) لcannulate الرئتين اليسرى و / أو اليمنى من الفئران الحية غير الجراحية.  ويتضح أيضا كيف يمكن استخدام هذا النهج لإدارة انتقائية وكلاء إلى رئة واحدة أو تكييفها (عنطريق تسليم IB تعديل الجرعة) لتحسين التماثل بين اليسار واليمين من تسليم الرئة من العوامل التجريبية، وبالتالي تحسين نماذج من انتشار أمراض الرئة مثل التليف الرئوي الناجم عن البلميسين.

Introduction

الإدارة الرئوية المباشرة للعوامل التجريبية في الفئران تسمح بدراسة الاستجابات المناعية للرئة، وإصابة الرئة الحادة، والتليف الرئوي. يتم تنفيذ الإدارة الرئوية المباشرة عادة عن طريق الغرس داخل الرغامى (IT)، كما هو موضح سابقا 1،^2،3. ومع ذلك، فإن هذا النهج غير انتقائي، ويؤثر على كلا الرئتين بطريقة غير مستهدفة وغير متناظرة في كثير من الأحيان.  قد تستفيد النمذجة التجريبية لإصابة الرئة من القدرة على استهداف رئة واحدة محددة بشكل انتقائي، مما يسمح باستخدام الرئة التعارضية كتحكم. وعلى العكس من ذلك، فإن النمذجة الدقيقة لأمراض الرئة المنتشرة البشرية تستفيد من التوزيع المتناظر للعوامل التجريبية إلى parenchyma الرئة الثنائية.

الهدف العام لهذا التقرير هو وصف طريقة للتسليم الانتقائي للعوامل التجريبية إلىالرئة اليسرى أو اليمنى للفأر (الشكل 1). هذا النهج الإداري داخل الشعب الهوائية (IB) يسمح لعلاج من جانب واحد من الرئة الماوس ويمكن تكييفها بسهولة لضمان التسليم على قدم المساواة من عامل إلى الشعب الهوائية الرئيسية الثنائية. باستخدام إدارة IB لتقديم جرعات أكبر من العوامل التجريبية إلى الرئة اليمنى الأكبر وكميات أصغر إلى الرئة اليسرى الأصغر (أي، إدارة IB المعدلة بالجرعة)، التي يتضح من هذا التقرير هو تحسن في تجانس الرئة تسليم العوامل التجريبية، وتحسين نموذج إصابة الرئة المنتشرة في الفئران. وعلى هذا النحو، قد يكون لهذا التقرير قيمة بالنسبة للمحققين الذين يسعون إما إلى إعطاء عوامل تجريبية من جانب واحد للفئران أو تحسين تماثل ترسب المخدرات في كلتا الرئتين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل جامعة كولورادو دنفر المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC). تم تحسين جميع الإجراءات الموضحة أدناه (الأقسام 4-7) باستخدام فئران C57BL/6 من الذكور والإناث على حد سواء. وقد تم التحقق من صحة هذا النهج باستخدام الفئران تتراوح بين 19-40 غرام في وزن الجسم.

1- إنشاء منبر لإدارة المكتب الدولي

1. ثني bookend من زاوية 90 درجة الأصلي بين الجناح القاعدية والجناح الدائم إلى 70 درجة (الشكل2A).
2. حفر حفرة في أعلى مركز الجناح الدائم من bookend المعادن (الشكل2A).
3. حفر حفرة من حجم متطابقة في الموقف المقابل لللوحة البلاستيكية. حفر اثنين من الثقوب أصغر دون أدنى وأفقيا (الشكل2A).
4. الستائر خياطة الحرير 4:0 بين هذه الثقوب الصغيرة في المجلس البلاستيك (الشكل2A).
5. وضع هوك وحلقة الشريط على حافة المجلس البلاستيك (الشكل2A).
6. تجميع المجلس البلاستيك إلى bookend المعادن مع المسمار (الشكل2B). تأكد من أن المسمار الجوز هو ضيق بما فيه الكفاية لعقد المجلس في موقف مع السماح لتعديل زاوية، إذا لزم الأمر.
7. تأكد من أن دوران المجلس البلاستيك هو في اتجاه عقارب الساعة وعكس اتجاه عقارب الساعة، وتتحرك بحرية.
   ملاحظة: يتم تمثيل الحركة في اتجاه عقارب الساعة في هذا التقرير كاستدارة درجة (+)، ويتم تمثيل عكس اتجاه عقارب الساعة كتناوب درجة (-).
8. استخدام منقلة زاوية لوضع المجلس البلاستيك في +30 درجة، +86 درجة، -30 درجة، و -74 درجة ووضع علامة عليها على bookend، على التوالي.

2. إنشاء قسطرة موسعة لإدارة وكيل IB

1. جعل قطع الزاوية اليمنى مع شفرة حادة على طرف القسطرة الأصلي 22 G (25 ملم، انظر جدولالمواد) (الشكل3، الخطوة 1أ).
2. شطبة (~ 50 درجة -60 درجة) غيض من القسطرة الأصلية الأخرى (25 مم) مع النصل، ثم قطع في الزاوية اليمنى من المحور (الشكل3، الخطوة 1ب).
3. الغراء القسطرة اثنين في نهايات حادة مع زاوية أقل قليلا من 180 درجة (الشكل3، الخطوة 2).
4. قم بفك الطرف المنقطع بالذوبان مع الكي المنخفض في درجات الحرارة (انظر جدولالمواد).
5. قم بتلميع القسطرة الممتدة بورق الصنفرة "0" على المنطقة الملتصقة والطرف المنقطع للقسطرة الممتدة (الشكل3، الخطوة 3).
6. وضع علامة على القسطرة الموسعة بألوان مختلفة في 25 مم، 30 مم، و 35 مم (الشكل3، الخطوة 3).
7. قم بالإشارة إلى جانب شطبة القسطرة الممتدة عن طريق وضع علامة على محورها بعلامة.
8. شطف القسطرة الموسعة مع الماء DI، وبعد ذلك عن طريق التنظيف داخل القسطرة مع الإيثانول 70٪. تجفيف القسطرة.
9. تعقيم مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة قبل الاستخدام.

3- الإعداد المسبق للإجراءات

1. جعل جميع العوامل التي تدار في غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية تحت تقنية معقمة.
2. تنظيف مكان العمل مع الإيثانول 70٪.
3. تعقيم جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70٪.
4. إصلاح قاعدة منصة العمل إلى مقاعد البدلاء مباشرة أمام الباحث عن طريق تثبيت C-المشابك إلى الجناح القاعدية من bookend.
5. توليد العديد من مقاييس الببيروتية المؤقتة، والتي هي الأجهزة التي من شأنها أن تسمح للكشف عن تدفق الهواء المد والجزر في الفئران. باختصار، إيداع 60 درجة مئوية من المالحة المعقمة في حقنة 1 مل (إزالة الغطاس) مع طرف تحميل هلام.
   ملاحظة: انخفاض المودعة من المالحة occludes البرميل ويتحرك صعودا وهبوطا عندما تتعرض للتهوية المد والجزر³.
6. قم بإرفاق محور قسطرة 22 G الموسعة بمقياس التنفس المؤقت.
7. ضع كل من قطرات الزجاج على كل جانب من المنصة لسهولة الوصول إليها.
8. توصيل غرفة الحث isoflurane إلى آلة التخدير القوارض (انظر جدولالمواد) في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية متوافق مع isoflurane.

4- نهج تنبيب تكنولوجيا المعلومات غير الجراحي

1. التخدير ماوس C57BL/6 (ذكر أو أنثى، 8-10 أسابيع، ~ 25 غرام) مع الأكسجين (2 لتر / دقيقة) و 5٪ isoflurane (انظر جدولالمواد) في غرفة التعريفي لمدة 4 دقائق.
2. قم بفصل العامل التجريبي ليتم تسليمه (على سبيل المثال، صبغة إيفانز الزرقاء أو FITC-dextran، كما هو موضح في الشكل4) إلى ماصتين، ثم ضعها على كل جانب من المنصة أثناء التخدير.
3. تأكد من معدل تنفس يتراوح بين 24 و30 نفسًا تقريبًا/دقيقة قبل إزالة الماوس من غرفة التخدير التعريفي.
   ملاحظة: التخدير Isoflurane عادة ما يستمر لمدة 4 دقائق، بما يكفي لجميع إجراءات IB. إذا كان المشغل لا يتقن هذه التقنية، يمكن استخدام الكيتامين/ إكسلازين (80 مغ/كغ و 10 ملغ/كغ داخل اقبية، انظر جدولالمواد) للتخدير لفترات أطول.
4. تعليق الماوس بواسطة القواطع على خط خياطة رايات في موقف supine. تأمين الماوس مع قطعتين إلى ثلاث قطع من هوك وحلقة الشريط فضفاضة، وتجنب تقييد التهوية.
5. تشغيل الإنارة الألياف البصرية LED (انظر جدولالمواد، الشكل 2C).
6. ضع المشغل خلف المنصة (الـ dorsal إلى الماوس).
7. قم بتوجيه عنق المضيئة بحيث يضيء منطقة الحنجرة من خلال الجلد. المسافة بين الماوس ومصدر الضوء هي 2-3 سم (الشكل2C).
8. تأكد من عمق التخدير بقرصة اصبع القدم/الكفو قبل إجراء جميع الإجراءات أدناه.
9. عقد ملقط معقمة مع اليد المهيمنة، ثم رسم اللسان من تجويف الفم مع ملقط.
10. عقد الاكتئاب المعقم مع اليد غير المهيمنة، ثم تسطيح جذر اللسان مع الاكتئاب لفضح البلعوم على نطاق واسع. ويمكن بعد ذلك الإفراج عن الملقط، وتحرير اليد المهيمنة.
11. استخدام اليد المهيمنة لتنبيب القسطرة الموسعة في القصبة الهوائية عن طريق تجويف الفم (الشكل2C).
12. تأكد من الموضع من خلال مراقبة ما إذا كانت الفقاعة في الحقنة تتحرك صعودا وهبوطا مع كل نفس.
13. وقد نشرت تفاصيل إضافية عن تنبيب تكنولوجيا المعلومات سابقا³. إجمالي وقت العملية، باستثناء التخدير، يستمر 10-15 ق لمشغل مدرب تدريبا جيدا.

5- نُهُج التنبيب والتسليم غير العملية للـ IB

1. نهج IB لكانيشن الفص ية الانتقائية في الرئة اليمنى البعيدة
   1. بعد إجراء تعليب تكنولوجيا المعلومات (الخطوة 4.11)، تدوير المجلس البلاستيك +30 درجة (الشكل4A).
   2. عقد محور القسطرة وتوجيهها بشكل طبيعي بالتوازي مع خط الوسط الماوس، وتوسيعه إلى أعماق الوزن على النحو المبين في الجدول1.
      ملاحظة: يجب ملاحظة المقاومة في هذه الأعماق. عند هذه النقطة، سوف يصبح الماوس عدم انتظام دقات القلب قليلا، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. بالنسبة للمشغل من ذوي الخبرة، فإن ما يقرب من 90٪ من المحاولات بنجاح cannulate الرئة اليمنى (مع عدم انتظام دقات القلب لاحظت).
   3. تسليم 20 درجة مئوية من 0.3٪ إيفانز صبغ ة زرقاء (EBD، انظر جدولالمواد) مع طرف تحميل هلام.
   4. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرات الزجاج.
      ملاحظة: هذا يضمن إزالة الحل EBD المتبقية (أو العوامل التجريبية) من داخل القسطرة.
   5. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على موقف الماوس لمدة 30 ق.
   6. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.
2. نهج IB للتعليب القطاعي الانتقائي للرئة اليسرى البعيدة
   1. بعد إجراء تعليب تكنولوجيا المعلومات (الخطوة 4.11)، تدوير المجلس البلاستيك -74 درجة (الشكل4B).
   2. عقد محور القسطرة وتطبيق ضغط لطيف لدفع القسطرة في القصبات الرئيسية اليسرى، في حين وضع ضغط متواضع على حد سواء إلى أسفل (90 درجة) ونحو نهاية الكتابة. في الأعماق المشار إليها في الجدول 1، يجب على المشغل ملاحظة المقاومة كما يتم تشغيل الأجزاء السفلى من الرئة اليسرى. في حالة حدوث عدم انتظام دقات القلب، اسحب القسطرة إلى موضع 20-25 مم، وحاول من مرة أخرى.
   3. بعد قنية أجزاء الرئة السفلى اليسرى، يلزم تغيير في الموقف للسماح بالمساعدة الجاذبية لإدارة العامل. تدوير المجلس البلاستيك -30 درجة (الشكل4B).
   4. تقديم 40 درجة مئوية من 0.3٪ EBD مع طرف تحميل هلام.
      ملاحظة: من الممكن تسليم حجم أكبر من العامل لأن الرئة اليسرى لديها فص واحد فقط.
   5. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرات الزجاج.
      ملاحظة: هذا يضمن إزالة أي EBD المتبقية (أو العوامل التجريبية) من داخل القسطرة.
   6. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على موقف الماوس لمدة 30 ق.
   7. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.
3. تكييف إدارة IB للسماح بتسليم عامل إلى كامل الرئة اليسرى أو اليمنى
   ملاحظة: إذا كان المشغل يسعى إلى تسليم وكلاء ليس إلى فص الرئة الأيمن محددة أو جزء الرئة اليسرى، ولكن بدلا من الرئة بأكملها (الرئة اليمنى أو اليسرى)، يجب سحب القسطرة قليلا إلى الشعب الهوائية الرئيسية ذات الصلة، على النحو التالي.
   1. إدارة الرئة بالكامل
      1. بعد الخطوة 4.11، تدوير المجلس البلاستيك +30 درجة (الشكل5A).
      2. عقد محور القسطرة وتوجيهها بشكل طبيعي بالتوازي مع خط الوسط الماوس، والوصول إلى الأعماقاللازمة لالتعليب الفص يبعد الجانب الأيمن (الجدول 1).
      3. تأكد من ظهور علامة عدم انتظام دقات القلب.
      4. تدوير الماوس -74 درجة لتمكين مساعدة الجاذبية لتسليم وكيل (الشكل5B).
      5. سحب القسطرة إلى وضع يتوافق مع إقلاع الشعب الهوائيةالرئيسية اليمنى (الجدول 1). تأكد من أن شطبة القسطرة تواجه الهبوط (الشكل5B).
      6. تقديم 30 درجة مئوية من 0.3٪ EBD مع طرف تحميل هلام إلى الرئة اليمنى.
      7. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرة زجاجية.
      8. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على وضع الماوس لمدة 30 ق. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.
   2. ترك إدارة الرئة بأكملها
      1. بعد الخطوة 4.11، تدوير المجلس البلاستيك -74 درجة (الشكل6A). بدلاً من ذلك، قد يحدث التناوب بعد الخطوة 5.3.1.8 عن طريق سحب القسطرة إلى القصبة الهوائية، مما يتيح الإدارة الثنائية لوكيل IB.
      2. عقد محور القسطرة وتطبيق ضغط لطيف لدفع القسطرة إلى القسطرة الرئيسية اليسرى، مع وضع ضغط متواضع على حد سواء إلى أسفل (90 درجة) ونحو نهاية الكتابة. ويسترشد عمق التنبيب بالجدول1.
      3. تأكيد علامة عدم انتظام دقات القلب.
      4. تدوير الماوس +86 درجة للسماح للحصول على مساعدة الجاذبية مع إدارة وكيل.
      5. سحب القسطرة إلى القصبات الرئيسية اليسرى (نفس المسافات مثل الرئة اليمنى كافية، الجدول1) وتدوير شطبة من القسطرة يواجه إلى أسفل (الشكل6B).
      6. تسليم 30 درجة مئوية من 0.3٪ EBD مع طرف تحميل هلام إلى الرئة اليسرى.
      7. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرة زجاجية.
      8. سحب القسطرة، ثم الحفاظ على وضع الماوس لمدة 30 ق. وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.

6- استخدام نُهُج التعليب المتسلسلة للأرقام الأوجاع الدولية لإيصال كميات من العوامل معدلة بالجرعات إلى كل رئة

1. مجموعة إدارة تكنولوجيا المعلومات
   1. إجراء تعليب تكنولوجيا المعلومات كما هو موضح في الخطوات 4.1-4.11.
   2. تقديم 60 ميكرولتر من 0.05٪ FITC-dextran (انظر جدولالمواد) مع طرف تحميل هلام (الشكل1B).
   3. الاستغناء عن 1-2 aliquots (0.1-0.3 مل لكل منهما) من الهواء باستخدام قطرات الزجاج.
   4. الحفاظ على موقف ل 60 ق والسماح لاسترداد الماوس كما هو موضح أعلاه.
2. إدارة ثنائية متناظرة للبنك الدولي
   1. تنفيذ الخطوات 5-3-1-1-5-3-1-8 (الرئة اليمنى) والخطوات 5-3-2-1-5-3-2-8 (الرئة اليسرى).
   2. إدارة كميات متساوية (30 درجة مئوية) من 0.05٪ FITC-dextran (أو وكيل تجريبي) إلى كل جانب من الرئة.
3. إدارة الـ IB الثنائية المعدلة حسب الجرعة
   1. تنفيذ الخطوة 5.3.1.1-5.3.1.8 (الرئة اليمنى) والخطوات 5.3.2.1-5.3.2.8 (الرئة اليسرى).
   2. إدارة حجم أكبر (40 درجة مئوية) من 0.05٪ FITC-dextran إلى الرئة اليمنى أكبر، وحجم أصغر (20 درجة مئوية) من 0.05٪ FITC-dextran إلى الرئة اليسرى أصغر. بدلا من FITC-dextran، يمكن إدارة عامل تجريبي.

7. استخدام إدارة IB المعدلة بالجرعة لتحسين التماثل من جرعة واحدة من إصابة الرئة الناجمة عن جرعة واحدة (BLM)

1. مجموعات إدارة BLM
   1. تم تسليم IB-BLM المعدل بالجرعة (1.2 ملغم/كغم، انظر جدولالمواد) مجموعة الإدارة: 60 ميكرولتر (20 ميكرولتر للرئة اليسرى و40 ميكرولتر للرئة اليمنى، على التوالي) من محلول BLM إلى الفئران (ن = 5). وتلقت عناصر التحكم (n = 5) كميات مماثلة من المالحة.
      ملاحظة: راجع الخطوتين 5.3.1 و 5.3.2.
   2. مجموعة إدارة تكنولوجيا المعلومات: تم تسليم 60 ميكرولتر من حل BLM إلى الفئران مع تقنيات إدارة تكنولوجيا المعلومات.
      ملاحظة: راجع الخطوات 6-1-1-6-1-4.
2. قياس وظيفة الرئة
   1. في اليوم 21 بعد BLM أو المالحة، والتخدير الفئران مع حقن داخل الصفاق (IP) من الكيتامين (160 ملغ / كغ) وxylazine (32 ملغ / كغ).
   2. بعد التأكد من عمق التخدير بواسطة قرصة مخلب / اصبع القدم، إجراء استئصال القصبة الهوائية مع قنية 18 G (انظر جدولالمواد).
   3. ربط الفئران إلى جهاز التنفس الصناعي وقياس ميكانيكا الجهاز التنفسي كما سبق وصفها⁴.
3. جمع أنسجة الرئة ومعالجتها
   1. بعد قياس الميكانيكا الرئوية، قتل الفئران التخدير عن طريق ثقب القلب.
   2. فتح جدار الصدر والحث على الاعتلال الثنائي.
   3. تضخيم الرئتين مع 1٪ منخفضة تذوب أغاروز (40 درجة مئوية)⁵ في PBS في ضغط ثابت (42 سم H₂O).
   4. قطع أربع إلى خمس قطع من الرئة على طول المحور الطويل عرضيًا، وإصلاح في شكلي 10٪، وتضمين في البارافين.
   5. قطع 5 أقسام ميكرومتر ووصمة عار مع trichrome ماسون لتصور ترسب الكولاجين.

8 رعاية ما بعد الإجراءات

1. في نهاية إجراءات البقاء على قيد الحياة، وضع الحيوان على بطانية الاحترار حتى يستعيد وعيه. عادة ما يكتمل الاسترداد في غضون دقيقتين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يستهدف التنبيب الانتقائي IB فصوص محددة (الرئة اليمنى) أو أجزاء باسيلار (الرئة اليسرى).

تم تنفيذ إدارة IB من EBD إلى الرئة اليمنى على النحو المبين في القسم 5.1. بعد الانتهاء من التجربة، أعطيت الفئران جرعة قاتلة من الكيتامين داخل مجلس اك?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد تم على غرار إصابة الرئة بشكل كلاسيكي في القوارض باستخدام إدارة تكنولوجيا المعلومات من العوامل الضارة مثل BLM⁶. ومع ذلك، فإن إدارة تكنولوجيا المعلومات هذه لا تؤدي إلا إلى إصابة غير مكتملة، مما يعكس الطبيعة غير المستهدفة لإيصال الرئة مع هذا النهج⁷. هذه القيود على...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine