マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

要約

マウスにおける実験剤の気管内(IT)投与は、しばしば遠位肺への非対称的な送達をもたらす。 本報告では、生きているマウスの各肺を非手術的にカニューレする直接気管支内(IB)アプローチについて述べた。 このアプローチは、1つの肺に薬剤を選択的に投与するために使用することができ、または両方の肺への対称剤送達を改善するために適合されてもよい。

要約

実験剤の気管内(IT)投与は、ブレオマイシン誘発肺線維症などの拡散性肺疾患のマウスモデルにおいて不可欠な技術である。 しかし、遠位マウス肺への気管内投与剤の分布はしばしば非対称であり、マウスの左肺の小さい(しかし同様にアクセス可能な)肺の無分別濃度が増加した。 この報告に記載されているのは、生きているマウスの左および/または右の肺を非手術的にカニューレする新しい気管支内(IB)アプローチである。 また、このアプローチを使用して、1つの肺に薬剤を選択的に投与するか、または(用量調整されたIB送達を介して)実験剤の肺送達の左右対称性を改善し、それによって拡散のモデルを改善するためにどのように使用できるかも実証されている。ブレオマイシン誘発肺線維症などの肺疾患。

概要

マウスにおける実験剤の直接肺投与は、肺免疫応答、急性肺損傷、および肺線維症の研究を可能にする。直接肺投与は、典型的には、前述の1、2、3に記載されているように、気管内(IT)インスティレーションを介して行われる。しかし、このアプローチは非選択的であり、非標的およびしばしば非対称的な方法で両方の肺に影響を与える。 肺損傷の実験的モデリングは、1つの特定の肺を選択的に標的化する能力から利益を得ることができ、対照として反対索肺を使用することを可能にする。逆に、ヒト拡散性肺疾患の正確なモデリングは、両側肺無益に対称的な実験剤の分布から利益を得る。

このレポートの全体的な目標は、マウスの左右の肺に実験剤を選択的に送達する方法を記述することです(図1)。この気管支内(IB)投与アプローチは、マウス肺の一方的な治療を可能にし、両側の主体気管支への薬剤の均等な送達を確実にするために容易に適合させることができる。IB投与を使用して、より大きな右肺に大きな用量の実験剤を、より小さな左肺(すなわち、用量調整IB投与)に少量を提供することにより、この報告書で実証された肺の均質性の改善である。実験剤の送達は、マウスにおける拡散性肺損傷のモデルを最適化する。したがって、この報告書は、マウスに実験剤を一方的に投与するか、両肺における薬物沈着の対称性を改善しようとする研究者にとって価値を保持する可能性がある。

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プロトコル

すべての動物プロトコルは、コロラド大学デンバー大学機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。以下に説明するすべての手順(セクション4-7)は、雄および雌のC57BL/6マウスの両方を使用して最適化されている。このアプローチは、体重19~40gのマウスを用いて検証された。

1. IB管理のためのプラットフォームの構築

1. 基底翼と立翼の間の元の 90° 角度から 70° にブックエンドを曲げます (図 2A)。
2. 金属製ブックエンドの立ち翼の中央上部に穴を開けます(図2A)。
3. プラスチック板の対応する位置で同じサイズの穴をドリルします。2つの小さな穴を下に、横にドリルします(図2A)。
4. プラスチック板のこれらの小さな穴の間に4:0の絹縫合糸をドレープする(図2A)。
5. フックテープとループテープをプラスチック製の基板の端に置きます(図2A)。
6. プラスチック製のボードをネジで金属製のブックエンドに組み立てます(図2B)。必要に応じて、ネジナットが十分にしっかりと基板を固定し、角度の調整を可能にします。
7. プラスチック製ボードの回転が時計回りと反時計回りに回転し、自由に動いていることを確認します。
   注: 時計回りの動きは、このレポートでは(+)度回転として表され、反時計回りは(-)度回転として表されます。
8. 角度分度器を使用して、プラスチック板を+30°、+86°、-30°、-74°に配置し、ブックエンドにそれぞれマークします。

2. IB剤投与用拡張カテーテルの作成

1. 元の22Gカテーテル(25mm、材料の表を参照)の先端に鋭い刃で直角カットを行います(図3、ステップ1a)。
2. ベベル(〜50°~60°)は、ブレードを使用して他の元のカテーテル(25mm)の先端を切り取り、ハブから直角に切り取ります(図3、ステップ1b)。
3. 2つのカテーテルを鈍い端に接着し、わずかに180°以下の角度で接着します(図3、ステップ2)。
4. 低温焼灼で溶かして、ベブ状の先端を鈍くする(材料の表を参照)。
5. 接着領域に「0」サイズのサンドペーパーと拡張カテーテルのベッベ先端で拡張カテーテルを磨きます(図3、ステップ3)。
6. 25 mm、30 mm、および 35 mm で異なる色の拡張カテーテルにマークを付けます (図 3、ステップ 3)。
7. ハブにマーカーでラベルを付け、拡張カテーテルのベベル側を示します。
8. 拡張カテーテルをDI水で洗い流し、カテーテルの内部を70%エタノールで洗い流します。カテーテルをエアドライ。
9. 使用前にUV光で10分間殺菌してください。

3. 事前手順の準備

1. 無菌技術の下で生物学的安全フードですべての投与された薬剤を作る。
2. 70%のエタノールで職場をきれいにします。
3. 70%のエタノールが付いているすべての外科用具を殺菌する。
4. ブックエンドの基底翼にCクランプを貼り付け、研究者の目の前のベンチに作業台のベースを固定します。
5. マウスの潮流の検出を可能にする装置であるいくつかのメイクシフトスピロメーターを生成します。簡単に言えば、ゲルローディングチップで1 mLシリンジ(プランジャー除去)に殺菌生理生理生理生の60μLを堆積します。
   注:生理生理生理の堆積したドロップは、バレルを閉塞し、潮の換気3にさらされたときに上下に移動します。
6. 22 G拡張カテーテルのハブをメイクシフトスピロメーターにゆるく取り付けます。
7. アクセスを容易にするために、各ガラススポイトをプラットフォームの両側に置きます。
8. イソファラン誘導室をげっ歯類麻酔機(材料の表を参照)に接続し、イソファラン互換の生物学的安全キャビネットに接続します。

4. 非運用型IT挿管アプローチ

1. C57BL/6マウス(オスまたはメス、8〜10週間、~25g)を酸素(2L/min)と5%のイソルラン(材料の表を参照)を誘導室で4分間麻酔する。
2. 2つのピペットに渡される実験剤(例えば、エバンスブルー染料またはFITC-dextran)を2つのピペットに吸引し、その後、落とし込む間にプラットフォームの両側に配置します。
3. 麻酔誘導室からマウスを取り出す前に、約24~30回の呼吸/分の呼吸数を確認してください。
   注:イソファラン麻酔は通常、すべてのIB手順に十分な4分間持続する。オペレータが技術に堪能でない場合、ケタミン/キシラジン(80mg/kgおよび10mg/kgの経後経周期、材料の表を参照)は、より長期の麻酔に使用されてもよい。
4. スポイン位置のドレープ縫合線上の切り傷によってマウスを中断します。2~3個のフックでマウスを固定し、テープをゆるくループさせ、換気の制限を回避します。
5. LED光ファイバ照度器をオンにします(「材料の表、図2C」を参照)。
6. プラットフォームの後ろにオペレータを配置します(マウスに向かいます)。
7. イルミネーターのグースネックを向けて、皮膚を通して喉頭の領域を照らします。マウスと光源の間の距離は2~3cm(図2C)です。
8. 以下のすべての手順を実行する前に、つま先/足のピンチで麻酔の深さを確認してください。
9. 生殖不能鉗子を支配的な手で保持し、鉗子で口腔から舌を引き出します。
10. 無菌の抑圧器を非支配的な手で保持し、その後、口腔を広く露出させるために、うつ病で舌の根を平らにします。鉗子は、支配的な手を解放し、解放することができます。
11. 優勢な手を使用して、拡張カテーテルを口腔を介して気管に挿管します(図2C)。
12. 注射器の泡が呼吸ごとに上下に動くかどうかを観察して配置を確認します。
13. IT 挿管の追加の詳細は、以前に³.麻酔を除く合計手順時間は、十分な訓練を受けたオペレータに対して10〜15s続く。

5. 非手術IB挿管および送達アプローチ

1. 遠位右肺の選択的ロバーカネンスに対するIBアプローチ
   1. IT カナンテーション(ステップ 4.11)を実行した後、プラスチック製ボードを +30° (図 4A)回転させます。
   2. カテーテルのハブを保持し、マウスの中線に平行に自然に導き、表 1に説明するように重量ベースの深さまで拡張します。
      注:これらの深さでの抵抗に注意する必要があります。この時点で、マウスは、代表的な結果で説明するように、わずかに頻脈になります。経験豊富なオペレータの場合、約90%の試みは右肺を正常にカナレートします(頻脈が記載されています)。
   3. ゲルローディングチップで0.3%のエバンスブルー染料(EBD、材料の表を参照)の20 μLを提供します。
   4. ガラススポイトを使用して、空気の1-2アリコット(各0.1 mL)を分配します。
      注:これはカテーテルの内部からの残留EBD溶液(または実験剤)のクリアランスを保障する。
   5. カテーテルを引き出し、マウスの位置を30sに維持します。
   6. 意識を取り戻すまで、温かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。
2. 遠位左肺の選択的セグメントカネンスに対するIBアプローチ
   1. IT カナンテーション(ステップ 4.11)を実行した後、プラスチックボードを -74° (図 4B)回転させます。
   2. カテーテルのハブを保持し、左の主幹気管支にカテーテルを進めるために穏やかな圧力を加え、下向き(90°)およびブックエンドに向かって適度な圧力を置く。表1に記載の深さで、オペレータは左肺の下部セグメントが従事しているので抵抗性に注意する必要があります。頻脈が発生した場合は、カテーテルを20~25mmの位置に引き出し、再試行する。
   3. 左下下肺セグメントをカヌレートした後、薬剤投与のための重力援助を可能にするために位置の変化が必要である。プラスチック板を-30°回転させます(図4B)。
   4. ゲルローディングチップで0.3%EBDの40 μLを提供します。
      注:左肺は1つのローブしか持っていないため、より多くの量の薬剤を提供することが可能です。
   5. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
      注:これはカテーテルの内部からの残留EBD(または実験剤)のクリアランスを保障する。
   6. カテーテルを引き出し、マウスの位置を30sに維持します。
   7. 意識を取り戻すまで、温かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。
3. 左または右肺全体への薬剤の送達を可能にするIB投与の適応
   注:オペレータが特定の右肺葉または左肺セグメントではなく、肺全体(右または左肺)に薬剤を送り出そうとする場合、カテーテルは、次のように、それぞれの主幹気管支にわずかに引き抜かれるべきである。
   1. 右の肺投与
      1. ステップ 4.11 の後、プラスチック製ボード +30° (図 5A)を回転させます。
      2. カテーテルのハブを保持し、マウスの中線に平行に自然に導き、右側の遠位ロバーのカニテーションに必要な深さに達します(表1)。
      3. 頻脈記号の外観を確認します。
      4. マウスを -74° 回転させて、エージェントの送達に対する重力アシスタンスを有効にします(図5B)。
      5. カテーテルを右の主幹気管支の離陸に相当する位置に引き出す(表1)。カテーテルのベベルが下向きであることを確認します (図 5B)。
      6. 右肺にゲルローディングチップで0.3%EBDの30 μLを提供します。
      7. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
      8. カテーテルを引き出し、30sのマウスの位置を維持し、それが意識を取り戻すまで、暖かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。
   2. 左肺投与
      1. ステップ4.11の後、プラスチック板を-74°(図6A)回転させます。あるいは、カテーテルを気管に引き抜くことによってステップ5.3.1.8の後に回転が起こり、両側IB剤投与を可能にする。
      2. カテーテルのハブを保持し、左の主ステムカテーテルにカテーテルを進めるために穏やかな圧力を加え、下向き(90°)およびブックエンドに向かって適度な圧力を置く。挿管の深さは表 1によって示されます。
      3. 頻脈の兆候がないことを確認します。
      4. マウスを +86° 回転させて、エージェントの投与に対する重力アシスタンスを可能にします。
      5. 左の主体気管支にカテーテルを引き出し(右肺と同じ距離で十分であり、表1)カテーテルの斜体を下方に回転させる(図6B)。
      6. 左肺にゲルローディングチップで0.3%EBDの30 μLを提供します。
      7. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
      8. カテーテルを引き出し、30sのマウスの位置を維持し、それが意識を取り戻すまで、暖かい毛布の上に動物を置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。

6. 順次IBカネレーションアプローチを使用して、各肺に用量調整量の薬剤を提供する

1. IT 管理グループ
   1. 手順 4.1 ~ 4.11 に説明するように、IT カナンテーションを実行します。
   2. ゲルローディングチップ(図1B)で0.05%FITC-dextran(材料の表を参照)の60 μLを提供します。
   3. ガラススポイトを使用して空気の1-2アリコート(各0.1-0.3 mL)を分配します。
   4. 60 s の位置を維持し、上記のようにマウスの回復を可能にします。
2. 対称二国間 IB 投与
   1. ステップ 5.3.1.1 ~ 5.3.1.8 (右肺) とステップ 5.3.2.1 ~ 5.3.2.8 (左肺) を実行します。
   2. 0.05%のFITC-dextran(または実験剤)の等しい容積(30 μL)を肺の両側に投与する。
3. 用量調整された二国間IB投与
   1. ステップ 5.3.1.1 ~ 5.3.1.8 (右肺) とステップ 5.3.2.1~ 5.3.2.8 (左肺) を実行します。
   2. より大きな右肺に0.05%のFITC-dextranのより大きな容積(40 μL)を、より小さい左肺に0.05%のFITC-dextranのより小さい容積(20 μL)を投与する。FITC-dextranの代わりに、実験剤を投与することができる。

7. 単回用量ブレオマイシン(BLM)誘発性肺損傷の対称性を改善するための用量調整IB投与の使用

1. BLM 管理グループ
   1. 用量調整IB-BLM(1.2mg/kg、材料表参照)投与群:BLM溶液の60μL(左肺は20μL、右肺は40μL)をマウスに送達した(n=5)。コントロール (n = 5) は、同様の量の生理生理を受け取りました。
      注: 手順 5.3.1 および 5.3.2 を参照してください。
   2. IT管理群:BLM溶液の60μLをIT投与技術を用いたマウスに送達した。
      注: 手順 6.1.1 ~ 6.1.4 を参照してください。
2. 肺機能測定
   1. BLMまたは生理生理生理生の後の21日目に、ケタミン(160mg/kg)とキシラジン(32mg/kg)の精肉注射でマウスを麻酔する。
   2. 足/つま先のピンチで麻酔の深さを確認した後、18Gカニューレで気管切開を行う(材料の表を参照)。
   3. マウスを人工呼吸器に接続し、前述の4のように呼吸力学を測定する。
3. 肺組織の収集と処理
   1. 肺力学の測定に続いて、心臓穿刺によって麻酔マウスを安楽死させる。
   2. 胸壁を開き、両側性気球を誘発する。
   3. 一貫した圧力(42 cm H₂O)でPBSで1%低溶融アガロース(40°C)5で肺を膨張させます。
   4. 長い軸に沿って肺の4~5個を横方向に切断し、10%ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込みます。
   5. 5 μmの切片をカットし、マッソンのトリクロムで染色し、コラーゲン堆積を視覚化します。

8 手続き後のケア

1. 生存手順の最後に、意識を取り戻すまで、動物を暖かい毛布の上に置きます。通常、回復は 2 分以内に完了します。

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結果

選択的IB挿管は、特定の葉(右肺)またはバジラーセグメント(左肺)を標的とする。

右肺へのEBDのIB投与は、セクション5.1に記載されているように行われた。実験終了後、マウスに皮腔内ケタミン/キシラジンの致死量を投与し、EBD分布のデモンストレーションのために肺を採取した(図4A、右...

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ディスカッション

肺損傷は、BLM⁶などの有害な薬剤のIT投与を用いてげっ歯類で古典的にモデル化されている。しかし、このようなIT投与は、このアプローチ7を用いて肺送達の非標的性を反映した斑状の傷害を引き起こしうる。肺損傷のモデリングのこれらの制限は、薬物、siRNA、細胞療法などの有害でない実験薬のIT提供を試みる際に直面する有益な課題です。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine