Прямая интрабронхиальная администрация для улучшения селективного осаждения агента в мышь легких

Резюме

Внутритрачельное (ИТ) введение экспериментальных агентов у мышей часто приводит к асимметричным родам в легкие.  В этом докладе мы описываем прямой внутрибронхиальный (IB) подход к канюляции каждого легкого у живых мышей неоперативно.  Этот подход может быть использован для выборочного введения агентов в одно легкое или могут быть адаптированы для улучшения симметричной доставки агента в обоих легких.

Аннотация

Внутритрачеционное (ИТ) администрирование экспериментальных агентов является важным методом в моделях диффузных заболеваний легких, таких как блеомицин-индуцированный легочный фиброз.  Тем не менее, распределение внутричешно управляемых агентов в дистальное легкое мыши часто асимметрично, с легкими паранхимальными концентрациями, увеличенными в меньшем (но в равной степени доступном) левом легком мыши.  Описанный в настоящем докладе является новым внутрибронхиальным (IB) подходом к канюляции левого и/или правого легких живых мышей неоперативно.  Также показано, как этот подход может быть использован для выборочного администрирования агентов в одно легкое или адаптированы (через дозу скорректированной доставки IB) для улучшения лево-правой симметрии легких доставки экспериментальных агентов, тем самым улучшая модели диффузных заболевания легких, такие как блеомицин-индуцированный легочный фиброз.

Введение

Прямое легочочное введение экспериментальных агентов у мышей позволяет изучать иммунные реакции легких, острую травму легких и фиброз легких. Прямое легочочное введение обычно осуществляется через интрахельное (ИТ) зависление, как описано ранее 1,^2,3. Однако этот подход является неселективным, затрагивая оба легких нецелевым и часто асимметричным образом.  Экспериментальное моделирование травмы легких может извлечь выгоду из способности избирательно целевой одного конкретного легкого, что позволяет использовать контралатеральные легких в качестве контроля. И наоборот, точное моделирование заболеваний легких человека приносит пользу от симметричного распределения экспериментальных агентов на двустороннюю пуэнхиму легких.

Общая цель настоящего доклада заключается в описании метода выборочной доставки экспериментальных агентов в левое или правое легкое мыши(рисунок 1). Такой внутрибронхиальный (IB) административный подход позволяет одностороннее лечение легких мыши и может быть легко адаптирован для обеспечения равной доставки агента в двусторонний основной бронхов. С помощью администрации IB для доставки больших доз экспериментальных агентов в более крупные правые легкие и меньшие объемы в меньшее левое легкое (т.е. скорректированная на дозу администрация IB), продемонстрировано в настоящем докладе, является улучшение однородности легочной доставка экспериментальных агентов, оптимизация модели диффузной травмы легких у мышей. Таким образом, этот доклад может иметь значение для исследователей, стремящихся либо в одностороннем порядке управлять экспериментальных агентов для мышей или улучшить симметрию осаждения наркотиков в обоих легких.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все протоколы животных были одобрены Университетом Колорадо Денвер институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Все процедуры, описанные ниже (разделы 4-7), были оптимизированы с использованием как мужских, так и женских мышей C57BL/6. Этот подход был подтвержден с использованием мышей, начиная от 19-40 г в весе тела.

1. Создание платформы для администрирования IB

1. Согните bookend от первоначально угла 90 'между базальным крылом и стоящим крылом до 70»(рисунок 2A).
2. Просверлите отверстие в центральной верхней части стоящего крыла металлического букенда(рисунок 2A).
3. Просверлите отверстие одинакового размера в соответствующем положении пластиковой доски. Просверлите два небольших отверстия неполноценно и спотерально(рисунок 2A).
4. Drape 4:0 шелковый шов между этими небольшими отверстиями в пластиковой доске(Рисунок 2A).
5. Поместите крючок и петлю ленты на краю пластиковой доски(рисунок 2A).
6. Соберите пластиковую доску для металлического букенда с винтом(Рисунок 2B). Убедитесь, что винт-орех достаточно плотно держать доску в положении, обеспечивая при необходимости регулировку угла.
7. Убедитесь, что вращение пластиковой доски по часовой стрелке и против часовой стрелки, свободно перемещаясь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Движение по часовой стрелке представлено в настоящем отчете в виде вращения градуса, а против часовой стрелки — в вращении (-) степени.
8. Используйте наклонный протрактор, чтобы расположить пластиковую доску на уровне 30, 86, -30 и -74 и пометить их на книжке, соответственно.

2. Создание расширенных катетеров для администрирования агентов IB

1. Сделайте прямой угол вырезать с острым лезвием на кончике оригинального 22 G катетер (25 мм, см. Таблица материалов) (Рисунок3, шаг 1a).
2. Бевел (50-60 евро) кончик другого оригинального катетера (25 мм) с лезвием, затем отрезается под прямым углом от коня(рисунок 3, шаг 1b).
3. Клей два катетера на их тупые концы с чуть менее 180 "угол (Рисунок 3, шаг 2).
4. Затухать смелый кончик, плавя с низкой температурой каутери (см. Таблицаматериалов).
5. Польский расширенный катетер с наждачной бумагой "0" на клееной области и сбитому кончиком расширенного катетера(рисунок 3, шаг 3).
6. Отметьте на удлинении катетера разного цвета на 25 мм, 30 мм и 35 мм(рисунок 3, шаг 3).
7. Укажите скобелевую сторону расширенного катетера, пометив его концентратор маркером.
8. Промыть расширенный катетер с di воды, после промывки внутри катетера с 70% этанола. Воздушный катетер.
9. Стерилизовать с ультрафиолетовым светом в течение 10 минут перед использованием.

3. Предпроцедурная подготовка

1. Сделайте все управляемые агенты в капюшоне биологической безопасности под стерильной техникой.
2. Очистите рабочее место с 70% этанола.
3. Стерилизовать все хирургические инструменты с 70% этанола.
4. Закрепите основание рабочей платформы на скамейке непосредственно перед исследователем, прикрепив C-зажимы к базальному крылу книжного крыла.
5. Создайте несколько самодельных спирометров, которые являются устройствами, которые позволят обнаружить приливный поток воздуха у мышей. Кратко, депозит 60 л стерилизованного солевого раствора в шприц 1 мл (плинтер удален) с наконечником погрузки геля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Отложенное падение сольника окклюзии баррель и движется вверх и вниз при воздействии приливной вентиляции³.
6. Свободно прикрепите концентратор 22 G расширенный катетер к импровизированному спирометру.
7. Поместите каждый из стаканчиков с каждой стороны платформы для облегчения доступа.
8. Соедините изофлюранскую индукционную камеру к аппарату анестезии грызунов (см. ТаблицаМатериалов) в изофруранском шкафе биологической безопасности.

4. Неоперативный подход к интубации ИТ

1. Анестезия C57BL/6 мышь (мужчина или женщина, 8-10 недель, 25 г) с кислородом (2 л / мин) и 5% изофлуран (см. Таблица материалов) в индукционной камере в течение 4 мин.
2. Прикрепляйте экспериментальный агент, который будет доставлен (например, синий краситель Evans или FITC-dextran, как показано на рисунке 4) в две пипетки, а затем поместите их в каждую сторону платформы во время седации.
3. Убедитесь, что частота дыхания составляет примерно 24-30 вдохов/мин, прежде чем удалить мышь из индукционной камеры анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изофлуранская анестезия обычно длится 4 мин, достаточная для всех процедур IB. Если оператор не владеет техникой, кетамин/ксилазин (80 мг/кг и 10 мг/кг интраперитоненалически, см. Таблица материалов)может быть использован для более длительной анестезии.
4. Приостановить мышь его резцы на драпированные шовлинии в положении лежа. Закрепите мышь двумя-тремя кусками крючка и свободно завязайте ленту, избегая ограничения вентиляции.
5. Включите светодиодный волоконно-оптический иллюминатор (см. Таблица материалов, Рисунок 2C).
6. Расположите оператора за платформой (спинс к мыши).
7. Ориентируйте гусиную шею осветители так, чтобы он освещал область гортани через кожу. Расстояние между мышью и источником света составляет 2-3 см(рисунок 2C).
8. Подтвердите глубину анестезии с ног / лапы щепотку перед выполнением всех процедур ниже.
9. Держите стерильные щипчи с доминирующей рукой, а затем вытащить язык из полости рта с щипками.
10. Держите стерильный депрессор с недоминирующей стороны, а затем сгладить корень языка с депрессором подвергать роофаинкс широко. Затем щипцы могут быть освобождены, освобождая доминирующую руку.
11. Используйте доминирующую руку, чтобы интубировать расширенный катетер в трахею через полость рта (рисунок2C).
12. Подтвердите размещение, наблюдая, если пузырь в шприц движется вверх и вниз с каждым вдохом.
13. Дополнительные сведения об Интубации ИТ были опубликованы ранее³. Общее время процедуры, за исключением анестезии, длится 10-15 с для хорошо подготовленного оператора.

5. Неоперативные подходы к интубации и доставке IB

1. ПОДХОД IB к селективной лобарной каннулации дистального правого легкого
   1. После выполнения ИТ-каниляции (шаг 4.11), поверните пластиковую доску(рисунок 4A).
   2. Держите концентратор катетера и направьте его естественным путем параллельно средней линии мыши, расширяя его до глубины, основанной на весе, как описано в таблице1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сопротивление на этих глубинах должно быть отмечено. В этот момент мышь станет слегка тахипнейной, как поясняется в репрезентативном результатах. Для опытного оператора, примерно 90% попыток будет успешно канюлязировать правое легкое (с тагипноной отметил).
   3. Доставьте 20 л 0,3% Синий краситель Эванс (EBD, см. Таблица материалов) с гель загрузки отзыв.
   4. Распределите 1-2 aliquots (0,1 мл каждый) воздуха с помощью стеклоуистого капельница.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает очистку остаточного раствора EBD (или экспериментальных агентов) изнутри катетера.
   5. Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с.
   6. Поместите животное на согреваемые одеяла, пока он не приходит в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
2. Подход IB к селективной сегментальной каниляции дистального левого легкого
   1. После выполнения ИТ-каниляции (шаг 4.11), поверните пластиковую доску -74 "(рисунок 4B).
   2. Держите концентратор катетера и применять мягкое давление для продвижения катетера в левый основной бронхов, при этом размещение скромное давление как вниз (90 ") и к bookend. На глубинах, отмеченных в таблице1, оператор должен отметить сопротивление, так как нижние сегменты левого легкого заняты. При тагипноне снимите катетер в положение 20-25 мм и повторите попытку.
   3. После канюляции левого нижнего сегмента легких, изменение позиции требуется, чтобы гравитационная помощь для агентадминистрациии. Поверните пластиковую доску -30 "(рисунок 4B).
   4. Доставьте 40 л 0,3% EBD с наконечником погрузки геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это возможно, чтобы доставить больший объем агента, потому что левое легкое имеет только одну долбу.
   5. Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стеклокапель.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает очистку любых остаточных EBD (или экспериментальных агентов) изнутри катетера.
   6. Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с.
   7. Поместите животное на согреваемые одеяла, пока он не приходит в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
3. Адаптация администрации IB, чтобы обеспечить доставку агента в полном объеме левого или правого легкого
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если оператор стремится доставить агентов не к определенной правой доли легких или левого сегмента легких, а для всего легкого (правое или левое легкое), катетер должен быть слегка снят с соответствующего основного бронха, а следующим образом.
   1. Правая вся администрация легких
      1. После шага 4.11 поверните пластиковую доску(рисунок 5A).
      2. Держите концентратор катетера и направлять его естественным путем параллельно средней линии мыши, достигая его до глубины, необходимой для правой односторонней дистальной лобарной канноизоляции(Таблица 1).
      3. Подтвердите появление знака тагипноя.
      4. Поверните мышь -74 ", чтобы гравитационная помощь для доставки агента(рисунок 5B).
      5. Снимите катетер до позиции, которая соответствует взлету правого основного бронха(таблица 1). Убедитесь, что скобы катетера обращены вниз(рисунок 5B).
      6. Доставьте 30 л 0,3% EBD с наконечником погрузки геля в правое легкое.
      7. Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стекловыки.
      8. Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с. Поместите животное на согреваеемые одеяла, пока оно не придет в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.
   2. Левая вся администрация легких
      1. После шага 4.11, поверните пластиковую доску -74 "(рисунок 6A). Кроме того, вращение может произойти после шага 5.3.1.8 путем снятия катетера к трахеее, что позволяет двустороннее управление агентом IB.
      2. Держите концентратор катетера и приложите мягкое давление, чтобы продвинуть катетер в левый катетер главного калибра, при этом устанавливая умеренное давление как вниз (90 градусов), так и к букенду. Глубина интубации руководствуется таблицей1.
      3. Подтвердите отсутствие знака тагипноа.
      4. Поверните мышь (86) для оказания помощи в управлении агентом.
      5. Снимите катетер в левый основной бронх (тех же расстояний, что и правое легкое, таблица 1) и поверните скотовод лица катетера вниз (рисунок6B).
      6. Доставьте 30 л 0,3% EBD с кончиком понабочной нагрузки геля в левое легкое.
      7. Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стекловыки.
      8. Снимите катетер, затем сохраните положение мыши в течение 30 с. Поместите животное на согреваеемые одеяла, пока оно не придет в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.

6. Использование последовательных подходов к консервации IB для доставки скорректированных на дозу объемов агента в каждое легкое

1. Группа ИТ-администрирования
   1. Выполните ИТ-каннулуляцию, описанную в шагах 4.1-4.11.
   2. Доставка 60 л 0,05% FITC-dextran (см. Таблица материалов) с наконечником погрузки геля (рисунок1B).
   3. Распределить 1-2 aliquots (0,1-0,3 мл каждый) воздуха с помощью стеклокапель.
   4. Держите положение в течение 60 с и позволяют для восстановления мыши, как описано выше.
2. Симметричное двустороннее управление IB
   1. Выполните шаги 5.3.1.1-5.3.1.8 (правое легкое) и шаги 5.3.2.1-5.3.2.8 (левое легкое).
   2. Администрирование равных объемов (30 л) 0,05% FITC-dextran (или экспериментального агента) в каждой стороне легких.
3. Скорректированная на дозу двусторонняя администрация IB
   1. Выполните шаг 5.3.1.1-5.3.1.8 (правое легкое) и шаги 5.3.2.1-5.3.2.8 (левое легкое).
   2. Администрирование большего объема (40 л) 0,05% FITC-dextran в более крупное правое легкое, и меньший объем (20 л) 0,05% FITC-dextran в меньшее левое легкое. Вместо FITC-dextran может быть введен экспериментальный агент.

7. Использование дозы скорректированной администрации IB для улучшения симметрии однодозовых бломицин (BLM)-индуцированной травмы легких

1. Группы администрирования BLM
   1. Скорректированная на дозу IB-BLM (1,2 мг/кг, см. Таблица Материалов) административная группа: 60 qL (20 л для левого легкого и 40 л для правого легкого, соответственно) раствора BLM были доставлены мышам (n No 5). Элементы управления (n No 5) получили аналогичные объемы сольения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагам 5.3.1 и 5.3.2.
   2. Группа ИТ-администрирования: 60 зл раствора BLM были доставлены мышам с помощью методов ИТ-администрирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к шагам 6.1.1.1.1.4.
2. Измерение функции легких
   1. На 21 день после BLM или сольника, анестезируют мышей с интраперитонеальной (IP) инъекцией кетамина (160 мг/кг) и ксилазина (32 мг/кг).
   2. После подтверждения глубины анестезии по лапам / ног щепотку, выполнить трахеостомию с 18 G канюли (см. Таблица материалов).
   3. Подключите мышей к аппарату искусственной вентиляции легких и измерить дыхательную механику, как ранее описано⁴.
3. Сбор и обработка тканей легких
   1. После измерения легочной механики, эвтаназии анестезирует мышей с помощью сердечного прокола.
   2. Откройте грудную стенку и нависните двусторонними пневмоторасами.
   3. Надуть легкие с 1% низким расплава агарозы (40 градусов по Цельсию)⁵ в PBS при постоянном давлении (42 см H₂O).
   4. Вырезать от четырех до пяти частей легкого вдоль длинной оси поперечно, исправить в 10% формалин, и вставлять в парафин.
   5. Вырезать 5 мкм разделов и пятно с трихромом Массона, чтобы визуализировать осаждение коллагена.

8 Постпроцедурный уход

1. В конце процедуры выживания, поместите животное на согревающий одеяло, пока он не приходит в сознание. Восстановление, как правило, завершено в течение 2 минут.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Селективная интубация IB нацелена на определенные доли (правое легкое) или базилярные сегменты (левое легкое).

ИБ администрирование ЭБД в правом легком было выполнено, как описано в разделе 5.1. После завершения эксперимента мыш?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Травма легких была классически смоделирована у грызунов с использованием ИТ-администрирования вредных агентов, таких как BLM⁶. Такое ИТ-администрирование, однако, только приводит к пятнистый травмы, отражающие нецелевой характер доставки легких с этим подходом⁷

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine