מינהל הארגון הישיר כדי לשפר את הסוכן הסלקטיבי התצהיר בתוך הריאה של העכבר

Summary

Intratracheal (IT) המינהל של סוכנים ניסיוניים בעכברים לעתים קרובות מביא משלוח אסימטרי הריאות המרוחק.  בדוח זה, אנו מתארים גישה ישירה בלתי-מרורונצ'יאל (ליברות) כדי לאגור כל ריאה בעכברים חיים שאינם מבצעית.  גישה זו יכולה לשמש באופן סלקטיבי לניהול סוכנים לריאה אחת או להתאים כדי לשפר את מסירת הסוכן הסימטרי לשתי הריאות.

Abstract

Intratracheal (IT) המינהל של סוכנים ניסיוניים היא טכניקה חיונית במודלים murine של מחלות ריאות מפוזר, כגון פיברוזיס ריאתי ליאומיצין.  עם זאת, הפצה של סוכנים מנוהל intratracheally לריאות העכבר הקטן הוא אסימטרי לעתים קרובות, עם הריכוזים של הריאה בתוך הריאות הגדילה את הריאה הקטנה (אבל נגיש באותה מידה) שמאל של העכבר.  המתואר בדו ח זה הוא הרומן הבלתי מטרורוציאל (ליברות) הגישה לצינורית השמאלית ו/או הימנית של עכברים חיים שאינם מבצעית.  הוא גם הוכיח כיצד גישה זו יכולה לשמש לניהול באופן סלקטיבי סוכנים לריאה אחת או מותאם (באמצעות משלוח מותאם מינון מסירה) כדי לשפר את הסימטריה הימנית השמאלית של משלוח הריאות של סוכני ניסיוני, ובכך לשפר את המודלים של לפזר מחלות ריאות כגון פיברוזיס של הריאות ליאומיצין המושרה.

Introduction

מינהל ריאתי ישיר של סוכני ניסיוני בעכברים מאפשר לימוד של תגובות החיסון לריאות, פציעה בריאה חריפה, פיברוזיס ריאות. מינהל ריאתי ישיר מבוצע בדרך כלל באמצעות intratracheal (זה), כמתואר בעבר^1,2,3. עם זאת, גישה זו אינה סלקטיבית, להשפיע על שתי הריאות בצורה לא ממוקדת לעתים קרובות אסימטרית.  מידול ניסיוני של פגיעה בריאה עשוי להועיל מהיכולת באופן סלקטיבי היעד ריאה ספציפית אחת, ומאפשר להשתמש בריאה הצלעות בתור שליטה. לעומת זאת, דוגמנות מדויקת של מחלות ריאה מפוזר האדם היתרונות של התפלגות סימטרית של סוכני ניסיוני על הריאה הדו כימומה.

המטרה הכוללת של דו ח זה היא לתאר שיטה למסירה סלקטיבית של סוכנים ניסיוניים לריאה השמאלית או הימנית של העכבר (איור 1). הגישה הזאת לניהול הארגון מאפשרת טיפול חד צדדי בריאות העכבר וניתן להתאים בקלות כדי להבטיח משלוח שווה של סוכן לברוצ הגזע הדו. על-ידי שימוש בניהול ה-, כדי לספק מינונים גדולים יותר של סוכני ניסוי לריאה הימנית הגדולה יותר ולאמצעי אחסון קטנים יותר לריאה השמאלית הקטנה יותר (כלומר, מנהל מינון מותאם במינון), הפגינו בדו ח זה שיפור בהומוגניות של הריאות משלוח של סוכני ניסיוני, אופטימיזציה של המודל של פגיעה ריאה מפוזר בעכברים. ככזה, דו ח זה עשוי להכיל ערך לחוקרים המבקשים לנהל באופן חד-צדדי סוכנים ניסיוניים לעכברים או לשפר את הסימטריה של התצהיר בשתי הריאות.

Protocol

כל הפרוטוקולים בעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו דנבר טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה להשתמש (IACUC). כל ההליכים המתוארים להלן (סעיפים 4 – 7) כבר ממוטבים באמצעות זכר ונקבה C57BL/6 עכברים. גישה זו אומתה באמצעות עכברים הנע בין 19 – 40 g במשקל הגוף.

1. יצירת פלטפורמה לניהול המערכת

1. כופפו את המטרה מזווית 90 המקורית בין הכנף הבזוית לכנף העמידה 70 ° (איור 2A).
2. קדוח חור במרכז העליון של הכנף העמידה של קצה המתכת (איור 2A).
3. מקדחה חור בגודל זהה במיקום המקביל של לוח פלסטיק. מקדחה שני חורים קטנים יותר מפורטים (איור 2A).
4. לעטוף את תפר המשי 4:0 בין החורים הקטנים האלה בלוח הפלסטיק (איור 2A).
5. הצב את הקרס ואת סרט הלולאה בקצה לוח הפלסטיק (איור 2A).
6. הכנס את לוח הפלסטיק לסוף המתכת עם הבורג (איור 2B). ודא שהבורג-אגוז מתוח מספיק כדי להחזיק את הלוח במקומו תוך מתן התאמה של זווית, במידת הצורך.
7. הקפידו שסיבוב של לוח הפלסטיק יהיה בכיוון השעון ונגד כיוון השעון.
   הערה: תנועה בכיוון השעון מיוצגת בדוח זה כסיבוב מדרגה, וכנגד כיוון השעון מיוצגת כסיבוב מדרגה (-).
8. להשתמש בזווית מד למקם את לוח פלסטיק ב + 30 °, + 86 °,-30 °, ו-74 ° ולסמן אותם על הקצה, בהתאמה.

2. יצירת קטטרים מורחבות למינהל הסוכנים

1. להפוך זווית ימין לחתוך עם להב חדה על קצה המקורי 22 גרם הצנתר (25 מ"מ, ראה טבלת חומרים) (איור 3, שלב 1a).
2. שיקוע (~ 50 ° – 60 °) קצה הצנתר המקורי השני (25 מ"מ) עם הלהב, ולאחר מכן לגזור בזווית הנכונה מן הרכזת (איור 3, שלב 1b).
3. הדבק את שני הקטטרים בקצוות קהה עם זווית קצת פחות מ 180 ° (איור 3, שלב 2).
4. קהה את הטיפ משופע על ידי התכה עם החום נמוך הזנב (ראה שולחן חומרים).
5. פולנית קטטר מורחב עם "0" גודל נייר זכוכית על האזור המודבק ואת קצה משופע של קטטר מורחב (איור 3, שלב 3).
6. סמן על קטטר מורחב עם צבעים שונים ב 25 מ"מ, 30 מ"מ, ו 35 מ"מ (איור 3, שלב 3).
7. לציין את הצד המשופעת של הקטטר המורחבת על ידי תיוג הרכזת שלה עם סמן.
8. לשטוף את הקטטר המורחבת עם מים DI, בעקבות שטיפה בתוך הקטטר עם 70% אתנול. . לייבש את הצנתר
9. לחטא עם אור UV עבור 10 דקות לפני השימוש.

3. הכנה לפני הליך

1. הפוך את כל סוכני מנוהל במכסה בטיחות ביולוגית תחת טכניקה סטרילית.
2. לנקות את מקום העבודה עם 70% אתנול.
3. לחטא את כל כלי הניתוח עם 70% אתנול.
4. לתקן את הבסיס של פלטפורמת העבודה על הספסל מיד מול החוקר על ידי דבקת C-התפסים לכנף הבסיס של הסוף.
5. צור מספר מטרים זמניים, שהם התקנים שיאפשרו זיהוי של זרימת אוויר גאות בעכברים. בקצרה, הפקדה 60 μL של תמיסת מלח מעוקר לתוך מזרק 1 מ ל (בבוכנה הוסר) עם טיפ הטעינה ג'ל.
   הערה: ירידה מלוחים של מלין לאוטם את החבית נע כלפי מעלה כלפי מטה כאשר נחשף אוורור גאות³.
6. לצרף באופן רופף את הרכזת של הצנתר 22 גרם מורחב לספימטר מאולתר.
7. מניחים כל אחד מכלי הזכוכית לכל צד של הפלטפורמה כדי להקל על הגישה.
8. חבר את החדר האינדוקציה isof, למכונה הרדמה מכרסם (ראה שולחן חומרים) בארון ביטחון ביולוגי התואם isofלאנה.

4. גישה באמצעות צנרור IT שאינה אופרטיבית

1. מורדם C57BL/6 העכבר (זכר או נקבה, 8 – 10 שבועות, ~ 25 גרם) עם חמצן (2 L/דקות) ו 5% isofלכאן (ראה טבלת חומרים) בחדר אינדוקציה עבור 4 דקות.
2. מנושף את הסוכן הניסיוני כדי להישלח (למשל, לצבוע אוונס כחול או FITC-dextran, כפי שמתואר באיור 4) לשני פיפטות, ואז למקם אותם לכל צד של הפלטפורמה במהלך הרגעה.
3. ודא שקצב הנשימה של כ -24 – 30 נשימות/דקות לפני הסרת העכבר מחדר אינדוקציה ההרדמה.
   הערה: הרדמה Isofלוריאן בדרך כלל נמשך 4 דקות, מספיק עבור כל הליכי ליברות. אם המפעיל אינו מיומן עם הטכניקה, קטמין/xylazine (80 מ"ג/ק"ג ו 10 מ"ג/ק"ג intraperitoneally, ראה טבלת חומרים) ניתן להשתמש להרדמה ממושכת יותר.
4. להשעות את העכבר על ידי חותכות על קו תפר עטוף במצב פרקדן. לאבטח את העכבר עם שניים עד שלוש פיסות וו לולאה הסרט באופן רופף, הימנעות הגבלה של אוורור.
5. הפעל את מאייר סיבים אופטיים LED (ראה טבלת חומרים, איור 2c).
6. הצב את האופרטור מאחורי הפלטפורמה (מאחור לעכבר).
7. כוון את הגוסנאק של המאיר כך שהוא מאיר את אזור הגרון דרך העור. המרחק בין העכבר למקור האור הוא 2 – 3 ס מ (איור 2C).
8. לאשר את עומק ההרדמה עם צביטה בבוהן/כפה לפני ביצוע כל ההליכים להלן.
9. להחזיק את מלקחיים סטרילי עם היד הדומיננטית, ואז לצייר את הלשון מתוך חלל הפה עם מלקחיים.
10. החזיקו את הדיכאון הסטרילי או עם היד הלא-דומיננטית, ולאחר מכן שטחו את השורש של הלשון עם המקלות או כדי לחשוף את הoropharynx במידה רבה. לאחר מכן ניתן לשחרר את הלקחיים, לשחרר את היד הדומיננטית.
11. השתמש ביד דומיננטי כדי לצנרור את הצנתר המורחב לתוך קנה הנשימה דרך חלל הפה (איור 2c).
12. לאשר את המיקום על ידי התבוננות אם הבועה במזרק נע למעלה ולמטה עם כל נשימה.
13. פרטים נוספים של צנרור IT פורסמו בעבר³. סה כ זמן ההליך, למעט הרדמה, נמשך 10-15 s עבור אופרטור מיומן היטב.

5. גישה לצנרור וגישות מסירה שאינן פעילות

1. גישה ל-ליברות בעזרת צינורית לוורת בריאה הצודקת ביותר
   1. לאחר ביצוע צינורית ה-IT (שלב 4.11), סובב את לוח הפלסטיק + 30 ° (איור 4A).
   2. להחזיק את הרכזת של הצנתר ולהנחות אותו באופן טבעי במקביל לעכבר האמצע קו, הרחבת אותו משקל מבוסס במעמקי כמתואר בטבלה 1.
      הערה: יש לציין את ההתנגדות במעמקים. בשלב זה, העכבר יהפוך מעט התחנומית, כפי שהוסבר בתוצאות הנציג. עבור מפעיל מנוסה, כ-90% מהניסיונות בהצלחה לסדר את הריאה הימנית (באמצעות שגיאה מציינת).
   3. לספק 20 μL של 0.3% הצבע הכחול של אוונס (EBD, ראה טבלת חומרים) עם טיפ טעינת ג'ל.
   4. מוותר 1 – 2 הבליטים (0.1 mL כל אחד) של אוויר באמצעות טפטפת זכוכית.
      הערה: הדבר מבטיח אישור של פתרון EBD שיורית (או סוכנים ניסיוניים) מתוך הקטטר.
   5. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר 30 s.
   6. הנח את החיה על שמיכה מחממת עד שתחזור להכרה. השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.
2. הגישה לכלי לצינורית סלנטלית סלקטיבית של הריאה השמאלית המרוחק
   1. לאחר ביצוע צינורית ה-IT (שלב 4.11), סובב את לוח הפלסטיק-74 ° (איור 4B).
   2. להחזיק את הרכזת של הקטטר ולהחיל לחץ עדין כדי לקדם את הקטטר לתוך הסמפון השמאלי גזע מימין, תוך הצבת לחץ צנוע הן כלפי מטה (90 °) ולקראת הקצה. בעומק המצוין בטבלה 1, על המפעיל לשים לב להתנגדות כאשר החלקים הנמוכים יותר של הריאה השמאלית מאורסים. אם המצב מתרחש, למשוך את הקטטר אל המיקום 20-25 מ"מ, ולנסות שוב.
   3. לאחר קבלת מקטעי הריאה השמאלית התחתונה, שינוי בעמדה נדרש כדי לאפשר סיוע כבידה עבור מינהל הסוכנים. סובב את לוח הפלסטיק 30 ° (איור 4B).
   4. ספק 40 μL של 0.3% EBD עם קצה הטעינה ג'ל.
      הערה: ניתן לספק נפח גדול יותר של סוכן כי הריאה השמאלית יש רק אונה אחת.
   5. מוותר 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות הזכוכית מטפטפת.
      הערה: הדבר מבטיח אישור של כל שרידי EBD (או סוכנים ניסיוניים) מתוך הקטטר.
   6. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר 30 s.
   7. הנח את החיה על שמיכה מחממת עד שתחזור להכרה. השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.
3. הסתגלות של מינהל ליברות כדי לאפשר אספקת סוכן לשלמותו או לריאה שמאל או ימין
   הערה: אם המפעיל מבקש לספק סוכנים לא לאונה ריאה מסוימת או מקטע ריאה שמאל, אלא על הריאה כולה (מימין או שמאל ריאה), הקטטר צריך להיות מעט מסוגר על הברוצ גזע המתאים, כדלקמן.
   1. מינהל הריאות כולו
      1. לאחר שלב 4.11, לסובב את הלוח פלסטיק + 30 ° (איור 5A).
      2. להחזיק את הרכזת של הקטטר ולהנחות אותו באופן טבעי במקביל לעכבר האמצע קו, להגיע אליו במעמקי הצורך הימני הצדדי הצינורית (שולחן 1).
      3. אשר את הופעת. סימן הנשימה
      4. לסובב את העכבר-74 ° כדי לאפשר סיוע הכבידה עבור משלוח הסוכן (איור 5B).
      5. למשוך את הצנתר למצב המתאים להמראה של ברופון הגזע הימני (שולחן 1). ודא כי שיקוע של הקטטר פונה כלפי מטה (איור 5B).
      6. לספק 30 μL של 0.3% EBD עם ג'ל טעינת טיפ לריאה הימנית.
      7. מדבקות 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות טפטפת זכוכית.
      8. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר עבור 30 s. מניחים את החיה על שמיכה. מחממת עד שתחזור להכרה השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.
   2. מינהל הריאות השמאלי
      1. לאחר שלב 4.11, לסובב את לוח הפלסטיק-74 ° (איור 6A). לחילופין, הסיבוב עלול להתרחש לאחר שלב 5.3.1.8 על ידי נסיגה הקטטר לקנה הנשימה, המאפשר לניהול הסוכן הדו.
      2. להחזיק את הרכזת של קטטר ולהחיל לחץ עדין כדי לקדם את הקטטר לתוך קטטר גזע שמאל, תוך הצבת לחץ צנוע הן כלפי מטה (90 °) ולקראת הקצה. עומק של צנרור מונחה על-ידי שולחן 1.
      3. . אשר את סימן הנשימה
      4. לסובב את העכבר + 86 ° כדי לאפשר סיוע כבידה עם מינהל הסוכן.
      5. למשוך את הקטטר אל הברופון השמאלי הגבעול (באותו מרחקים כמו הריאה הימנית מספיקים, שולחן 1) ולסובב את השיקוע של הקטטר פונה כלפי מטה (איור 6b).
      6. לספק 30 μL של 0.3% EBD עם ג'ל טעינת טיפ לריאה שמאל.
      7. מדבקות 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות טפטפת זכוכית.
      8. למשוך את הצנתר, ולאחר מכן לשמור על מיקום העכבר עבור 30 s. מניחים את החיה על שמיכה. מחממת עד שתחזור להכרה השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.

6. שימוש בגישות של הצינורית הרציפה לאספקת אמצעי אחסון מנוכי מינון של סוכן לכל ריאה

1. קבוצת מינהל IT
   1. בצעו צינורית IT כמתואר בצעדים 4.1 – 4.11.
   2. ספק 60 μL של 0.05% FITC-dextran (ראה טבלת חומרים) עם קצה העמסה ג'ל (איור 1b).
   3. מוותר 1 – 2 הזגגים (0.1 – 0.3 mL כל אחד) של האוויר באמצעות הזכוכית מטפטפת.
   4. לשמור על המיקום של 60 s ולאפשר שחזור העכבר כמתואר לעיל.
2. מנהל ליברות דו-ממדי סימטרי
   1. בצע שלבים 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (ריאה ימנית) ושלבים 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (ריאה שמאל).
   2. ניהול אמצעי אחסון שווים (30 μL) של 0.05% FITC-dextran (או סוכן ניסיוני) לכל צד של הריאה.
3. מינהל ליברות
   1. בצע שלב 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (ריאה ימנית) ושלבים 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (ריאה שמאל).
   2. ניהול נפח גדול יותר (40 μL) של 0.05% FITC-dextran לריאה הימנית הגדולה יותר, ואמצעי אחסון קטן יותר (20 μL) של 0.05% FITC-dextran לריאה השמאלית הקטנה יותר. במקום FITC-dextran, סוכן ניסיוני יכול להינתן.

7. השימוש במינון מותאם לניהול ליברות כדי לשפר את הסימטריה של ליאומיצין מנה אחת (BLM)-פציעת ריאה הנגרמת

1. קבוצות ניהול של BLM
   1. מינון-ליברות-BLM (1.2 מ"ג/ק"ג, ראה טבלת חומרים) קבוצת הניהול: 60 μl (20 μl עבור ריאה שמאל ו40 μl עבור הריאה הימנית, בהתאמה) של פתרון blm נמסרו עכברים (n = 5). פקדים (n = 5) קיבלו כמויות דומות של תמיסת מלח.
      הערה: עיין בשלבים 5.3.1 ו-5.3.2.
   2. קבוצת מינהל IT: 60 μL של פתרון BLM נמסרו לעכברים עם טכניקות ניהול ה-IT.
      הערה: עיין בצעדים 6.1.1 – 6.1.4.
2. מדידת תפקודי ריאה
   1. ביום 21 לאחר BLM או תמיסת מלח, עכברים מורדם עם הזרקת הצפק (IP) הזרקה של קטמין (160 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (32 מ"ג/ק"ג).
   2. לאחר שתאשר עומק של הרדמה על ידי צביטה/הבוהן, לבצע הקנה הנשימה עם הצינורית 18 G (ראה טבלת חומרים).
   3. לחבר עכברים למכונת ההנשמה ולמדוד מכניקת הנשימה כפי שתוארה בעבר⁴.
3. איסוף ועיבוד רקמות ריאות
   1. לאחר המדידה של מכניקת הריאות, המתת החסד של העכברים המכאניקה על ידי ניקוב לב.
   2. תפתח את קיר החזה ותגרום. לדו-הינע הפנאומטי
   3. מנפח את הריאות עם 1% להמיס ממיסים נמוך (40 ° c)⁵ ב PBS בלחץ עקבי (42 ס"מ H₂O).
   4. חותכים ארבע עד חמש חתיכות של הריאה לאורך הציר הארוך, לתקן 10% פורמאלין, ולהטביע פרפין.
   5. גזור 5 יקרומטר סעיפים וכתם עם trichrome של מאסנה כדי להמחיש את התצהיר קולגן.

8 לאחר טיפול פרוצדורלי

1. בסוף הליכי ההישרדות, הנח את החיה על שמיכה מחממת עד שתחזור להכרה. השחזור מושלם בדרך כלל בתוך 2 דקות.

תוצאות

צנרור בררני מטרות האונות הספציפיות (הריאה הימנית) או מקטעי בזיאר (שמאל ריאה).

מינהל ה-ליברות של EBD לריאה הימנית בוצע כמתואר בסעיף 5.1. לאחר סיום הניסוי, היו לעכברים מנה קטלנית של קטמין/xylazine, והריאות נקצרו להדגמה של התפלגות EBD (

Discussion

פגיעה בריאה כבר מעוצבת באופן קלאסי במכרסמים באמצעות מינהל IT של סוכנים מזיק כגון BLM⁶. עם זאת, מינהל IT מסוג זה מוביל לפציעה בלתי אחידה, ומשקף את האופי הלא ממוקד של משלוח ריאות עם גישה זו⁷. מגבלות אלה של פגיעה בריאות מידול הם אתגרים לימודיים מול כאשר מנסים את משלוח ה-IT ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine