Administração Intrabronquial direta para melhorar a deposição do agente seletivo dentro do pulmão do rato

Resumo

A administração intratraqueal (TI) de agentes experimentais em camundongos geralmente resulta em parto assimétrico para os pulmões distais.  Neste relatório, nós descrevemos uma aproximação intrabronchial direta (IB) para canular cada pulmão em ratos vivos não-operatively.  Essa abordagem pode ser usada para administrar seletivamente agentes a um pulmão ou pode ser adaptada para melhorar a entrega do agente simétrico para ambos os pulmões.

Resumo

A administração intratraqueal (TI) de agentes experimentais é uma técnica essencial em modelos murinos de doenças pulmonares difusas, como a fibrose pulmonar induzida por bleomicina.  Entretanto, a distribuição de agentes intratracheally-administrados ao pulmão longe do ponto de origem do rato é frequentemente assimétrica, com as concentrações parenquimatosas do pulmão aumentadas no pulmão esquerdo menor (mas ingualmente acessível) do rato.  Descrito neste relatório é uma aproximação intrabronchial (IB) nova para canular os pulmões esquerdos e/ou direito de ratos vivos não-operatively.  Também é demonstrado como essa abordagem pode ser usada para administrar seletivamente os agentes a um pulmão ou adaptado (via parto IB ajustado pela dose) para melhorar a simetria esquerda-direita da entrega pulmonar de agentes experimentais, melhorando assim os modelos de difuso doença pulmonar, como a fibrose pulmonar induzida por bleomicina.

Introdução

A administração pulmonar direta de agentes experimentais em camundongos permite o estudo de respostas imunes pulmonares, lesão pulmonar aguda e fibrose pulmonar. A administração pulmonar direta é tipicamente realizada via intratraqueal (IT) instilação, como descrito anteriormente^1,2,3. Entretanto, esta aproximação é nonselective, afetando ambos os pulmões em uma forma nonalvejada e frequentemente assimétrica.  A modelagem experimental de lesão pulmonar pode se beneficiar da capacidade de segmentar seletivamente um pulmão específico, permitindo o uso do pulmão contralateral como controle. Inversamente, a modelagem precisa de doenças pulmonares difusas humanas beneficia da distribuição simétrica de agentes experimentais para o parênquima pulmonar bilateral.

O objetivo geral deste relato é descrever um método para a entrega seletiva de agentes experimentais ao pulmão esquerdo ou direito de um camundongo (Figura 1). Esta aproximação da administração do intrabronchial (IB) permite o tratamento unilateral de um pulmão do rato e pode facilmente ser adaptada para assegurar a entrega igual de um agente aos brônquios bilaterais do do mainstem. Ao usar a administração de IB para entregar doses maiores de agentes experimentais ao pulmão direito maior e volumes menores ao pulmão esquerdo menor (isto é, administração dose-ajustada de IB), demonstrado neste relatório é uma melhoria na homogeneidade de pulmonar entrega de agentes experimentais, otimizando o modelo de lesão pulmonar difusa em camundongos. Como tal, este relatório pode prender o valor para investigadores que procuram unilateralmente administrar agentes experimentais aos ratos ou melhorar a simetria da deposição da droga em ambos os pulmões.

Protocolo

Todos os protocolos de animais foram aprovados pela Universidade de Colorado Denver Comitê de cuidados e uso de animais institucionais (IACUC). Todos os procedimentos descritos abaixo (secções 4 – 7) foram otimizados com ratos machos e fêmeas C57BL/6. Esta aproximação foi validada usando os ratos que variam de 19 – 40 g no peso corporal.

1. criação de plataforma para administração de IB

1. Dobre o bookend do ângulo 90 ° original entre a asa basal e a asa de pé para 70 ° (Figura 2a).
2. Faça um furo no centro-parte superior da asa de pé do bookend do metal (Figura 2a).
3. Perfure um furo do tamanho idêntico na posição correspondente da placa plástica. Perfure dois furos menores inferiormente e lateralmente (Figura 2a).
4. Drapeje uma sutura de seda 4:0 entre estes pequenos furos na placa plástica (Figura 2a).
5. Coloque a fita de gancho e laço na borda da placa plástica (Figura 2a).
6. Montar a placa plástica no bookend de metal com o parafuso (Figura 2b). Assegure-se de que o parafuso-porca esteja suficientemente apertado para prender a placa na posição ao permitir o ajuste do ângulo, se necessário.
7. Assegure-se de que a rotação da placa plástica seja no sentido horário e anti-horário, movendo-se livremente.
   Nota: o movimento no sentido horário é representado neste relatório como uma rotação do grau (+), e no sentido anti-horário é representado como uma rotação do grau (-).
8. Use um transferidor do ângulo para posicionar a placa plástica em + 30 °, + 86 °,-30 °, e-74 ° e marcá-los no bookend, respectivamente.

2. criação de cateteres prolongados para administração de agentes IB

1. Faça um corte de ângulo reto com uma lâmina afiada na ponta de um cateter original de 22 G (25 mm, ver tabela de materiais) (Figura 3, etapa 1a).
2. Chanfro (~ 50 ° – 60 °) a ponta do outro cateter original (25 mm) com a lâmina, em seguida, cortada no ângulo reto do cubo (Figura 3, Etapa 1b).
3. Cole os dois cateteres em suas extremidades sem corte com um ângulo ligeiramente inferior a 180 ° (Figura 3, etapa 2).
4. Blunt a ponta chanfrada derretendo com um cauterização da baixa temperatura (veja a tabela dos materiais).
5. Polir o cateter estendido com lixa de tamanho "0" na área colada e a ponta chanfrada do cateter estendido (Figura 3, etapa 3).
6. Marcar no cateter estendido com cores diferentes a 25 mm, 30 mm e 35 mm (Figura 3, etapa 3).
7. Indique o lado chanfrado do cateter prolongado etiquetando seu cubo com marcador.
8. Enxague o cateter estendido com água DI, seguindo por rubor dentro do cateter com etanol a 70%. Airdry o cateter.
9. Esterilizar com luz UV para 10 min antes de usar.

3. preparação do pré-procedimento

1. Faça todos os agentes administrados em uma capa de segurança biológica a técnica estéril.
2. Limpe o local de trabalho com 70% de etanol.
3. Esterilizar todas as ferramentas cirúrgicas com 70% de etanol.
4. Fixar a base da plataforma de trabalho para o banco imediatamente na frente do pesquisador, afixando C-grampos para a asa basal do bookend.
5. Gere vários espirômetros improvisados, que são dispositivos que permitirão a detecção de fluxo de ar corrente em camundongos. Momentaneamente, deposite 60 μL de soro fisiológico esterilizado numa seringa de 1 mL (êmbolo removido) com uma ponta de carga em gel.
   Nota: a gota depositada de soro fisiológico fecha o barril e move-se para cima e para baixo quando exposto à ventilação de maré³.
6. Fixe frouxamente o cubo de um cateter prolongado de 22 G ao espirômetro improvisado.
7. Coloque cada um dos conta-gotas de vidro para cada lado da plataforma para facilitar o acesso.
8. Ligue a câmara de indução de isoflurano à máquina de anestesia de roedores (ver tabela de materiais) num gabinete de segurança biológico compatível com isoflurano.

4. não-operatório de ti de intubação abordagem

1. Anestesie um rato C57BL/6 (macho ou fêmea, 8 – 10 semanas, ~ 25 g) com oxigénio (2 L/min) e 5% isoflurano (ver tabela de materiais) numa câmara de indução durante 4 min.
2. Aspirar o agente experimental a ser entregue (por exemplo, corante azul de Evans ou FITC-Dextran, como demonstrado na Figura 4) em duas pipetas, em seguida, colocá-los para cada lado da plataforma durante a sedação.
3. Assegure uma taxa respiratória de aproximadamente 24 – 30 respirs/minuto antes de remover o rato da câmara da indução da anestesia.
   Nota: a anestesia com isoflurano normalmente dura 4 min, suficiente para todos os procedimentos de IB. Se o operador não for proficiente com a técnica, a cetamina/xilazina (80 mg/kg e 10 mg/kg intraperitonealmente, ver tabela de materiais) pode ser usada para anestesia mais prolongada.
4. Suspenda o rato pelos seus incisivos na linha de sutura drapeada na posição supina. Prenda o rato com duas a três partes de gancho e laço a fita frouxamente, evitando a limitação da ventilação.
5. Ligue o iluminador de fibra óptica LED (ver tabela de materiais, Figura 2C).
6. Posicione o operador atrás da plataforma (dorsal para o mouse).
7. Oriente o gooseneck do iluminador de modo que ilumina a área da laringe através da pele. A distância entre o rato e a fonte luminosa é de 2 – 3 cm (Figura 2C).
8. Confirme a profundidade da anestesia com uma pitada do dedo do pé/pata antes de executar todos os procedimentos abaixo.
9. Segure o fórceps estéril com a mão dominante, em seguida, tirar a língua para fora da cavidade oral com o fórceps.
10. Segure o depressor estéril com a mão não dominante, em seguida, aplainar a raiz da língua com o depressor para expor a orofaringe amplamente. O fórceps pode então ser liberado, liberando a mão dominante.
11. Use a mão dominante para intubar o cateter estendido na traquéia através da cavidade oral (Figura 2C).
12. Confirme a colocação observando se a bolha na seringa se move para cima e para baixo com cada respiração.
13. Detalhes adicionais de intubação de ti foram publicados anteriormente³. O tempo total do procedimento, excluindo a anestesia, dura 10 – 15 s para um operador bem treinado.

5. não-operatório de intubação IB e abordagens de entrega

1. Abordagem IB para a canulação lobar seletiva do pulmão direito distal
   1. Após a realização da canulação de ti (etapa 4,11), gire a placa plástica + 30 ° (figura 4a).
   2. Segure o cubo do cateter e guie-o naturalmente paralelamente à linha média do mouse, estendendo-a para profundidades à base de peso, conforme descrito na tabela 1.
      Nota: a resistência nestas profundidades deve ser anotada. Neste ponto, o mouse se tornará ligeiramente taquipneico, como explicado nos resultados representativos. Para um operador experiente, aproximadamente 90% das tentativas canular com sucesso o pulmão direito (com taquipneia anotado).
   3. Entregar 20 μL de 0,3% de corante azul Evans (EBD, ver tabela de materiais) com uma ponta de carga em gel.
   4. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 mL cada) de ar usando o conta-gotas de vidro.
      Nota: Isto assegura o afastamento da solução residual de EBD (ou de agentes experimentais) do interior do cateter.
   5. Retire o cateter e, em seguida, mantenha a posição do rato por 30 s.
   6. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.
2. Abordagem IB para a canulação segmentar seletiva do pulmão esquerdo distal
   1. Após a realização da canulação de ti (etapa 4,11), gire a placa plástica-74 ° (Figura 4B).
   2. Segure o cubo do cateter e aplique uma pressão suave para avançar o cateter no brônquio do pilar esquerdo, enquanto coloca pressão modesta para baixo (90 °) e para o bookend. Nas profundidades anotadas na tabela 1, o operador deve anotar a resistência enquanto os segmentos mais baixos do pulmão esquerdo são acoplados. Se ocorrer taquipnea, retire o cateter para a posição de 20 – 25 mm e tente novamente.
   3. Após canulação os segmentos inferiores esquerdos do pulmão, uma mudança na posição é exigida para permitir o auxílio gravitacional para a administração do agente. Gire a placa plástica-30 ° (Figura 4B).
   4. Entregue 40 μL de 0,3% de EBD com uma ponta de carga de gel.
      Nota: é viável entregar um maior volume de agente porque o pulmão esquerdo tem apenas um lobo.
   5. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando os conta-gotas de vidro.
      Nota: Isto assegura o afastamento de todo o EBD residual (ou agentes experimentais) do interior do cateter.
   6. Retire o cateter e, em seguida, mantenha a posição do rato por 30 s.
   7. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.
3. Adaptação da administração de IB para permitir a entrega do agente à totalidade do pulmão esquerdo ou direito
   Nota: se o operador procura entregar agentes não a um lobo do pulmão direito específico ou segmento de pulmão esquerdo, mas em vez de todo o pulmão (pulmão direito ou esquerdo), o cateter deve ser ligeiramente retirado para os respectivos brônquios do pilar, como se segue.
   1. Administração pulmonar inteira direita
      1. Após a etapa 4,11, gire a placa plástica + 30 ° (Figura 5a).
      2. Segure o cubo do cateter e guie-o naturalmente paralelamente à linha média do rato, atingindo-o até às profundidades necessárias para a canulação lobar distal do lado direito (tabela 1).
      3. Confirme a aparência do sinal de taquipnea.
      4. Gire o mouse-74 ° para permitir a assistência de gravidade para a entrega do agente (Figura 5b).
      5. Retire o cateter para uma posição que corresponda à decolagem do brônquio do pilar direito (tabela 1). Assegure-se de que o chanfro do cateter enfrenta para baixo (Figura 5b).
      6. Forneça 30 μL de 0,3% de EBD com uma ponta do carregamento do gel ao pulmão direito.
      7. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando um conta-gotas de vidro.
      8. Retire o cateter, em seguida, manter a posição do mouse para 30 s. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.
   2. Administração pulmonar inteira esquerda
      1. Após a etapa 4,11, gire a placa plástica-74 ° (Figura 6a). Alternativamente, a rotação pode ocorrer após a etapa 5.3.1.8 retirando o cateter à traquéia, permitindo a administração bilateral do agente IB.
      2. Segure o cubo do cateter e aplique uma pressão suave para avançar o cateter no cateter do pilar esquerdo, enquanto coloca pressão modesta para baixo (90 °) e para o bookend. A profundidade de intubação é guiada pela tabela 1.
      3. Confirme o sinal sem taquipnea.
      4. Gire o mouse + 86 ° para permitir a assistência por gravidade com a administração do agente.
      5. Retire o cateter para o brônquio do pilar esquerdo (as mesmas distâncias que o pulmão direito são suficientes, tabela 1) e gire o chanfro das faces do cateter para baixo (Figura 6B).
      6. Forneça 30 μL de 0,3% de EBD com uma ponta de carga de gel para o pulmão esquerdo.
      7. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando um conta-gotas de vidro.
      8. Retire o cateter, em seguida, manter a posição do mouse para 30 s. Coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.

6. uso de abordagens seqüenciais de canulação IB para entregar volumes ajustados por dose de agente a cada pulmão

1. Grupo de administração de ti
   1. Realize a canulação de ti conforme descrito nas etapas 4.1 – 4.11.
   2. Entregar 60 μL de 0, 5% FITC-Dextran (ver tabela de materiais) com uma ponta de carregamento de gel (Figura 1b).
   3. Dispense 1 – 2 alíquotas (0,1 – 0,3 mL cada) de ar usando os conta-gotas de vidro.
   4. Mantenha a posição para 60 s e permitir a recuperação do mouse como descrito acima.
2. Administração bilateral simétrica de IB
   1. Realize etapas 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (pulmão direito) e etapas 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (pulmão esquerdo).
   2. Administrar volumes iguais (30 μL) de 0, 5% FITC-Dextran (ou um agente experimental) para cada lado do pulmão.
3. Administração bilateral de IB ajustada pela dose
   1. Execute a etapa 5.3.1.1 – 5.3.1.8 (pulmão direito) e os passos 5.3.2.1 – 5.3.2.8 (pulmão esquerdo).
   2. Administrar maior volume (40 μL) de 0, 5% FITC-Dextran para o pulmão direito maior, e um volume menor (20 μL) de 0, 5% FITC-Dextran para o pulmão esquerdo menor. Em vez de FITC-Dextran, um agente experimental pode ser administrado.

7. uso da administração de IB ajustada por dose para melhorar a simetria da bleomicina de dose única (BLM)-lesão pulmonar induzida

1. Grupos de administração BLM
   1. Grupo de administração de IB-BLM (1,2 mg/kg, ver tabela de materiais) ajustado pela Dose: 60 μl (20 μl para o pulmão esquerdo e 40 μl para o pulmão direito, respectivamente) da solução BLM foram entregues em camundongos (n = 5). Os controles (n = 5) receberam volumes similares de soro fisiológico.
      Nota: consulte as etapas 5.3.1 e 5.3.2.
   2. Grupo de administração de ti: 60 μL de solução BLM foram entregues a camundongos com técnicas de administração de ti.
      Nota: consulte as etapas 6.1.1 – 6.1.4.
2. Medição da função pulmonar
   1. No dia 21 após BLM ou soro fisiológico, anestesiam camundongos com injeção intraperitoneal (IP) de cetamina (160 mg/kg) e xilazina (32 mg/kg).
   2. Depois de confirmar a profundidade da anestesia por pinça pata/dedo do pé, realize uma traqueostomia com uma cânula de 18 G (ver tabela de materiais).
   3. Conecte os camundongos ao ventilador e meça a mecânica respiratória como descrito anteriormente⁴.
3. Coleta e processamento de tecido pulmonar
   1. Após a mensuração da mecânica pulmonar, eutanizar os camundongos anestesiados por punção cardíaca.
   2. Abra a parede torácica e induza pneumothoraces bilaterais.
   3. Inflar os pulmões com 1% de agarose de baixa fusão (40 ° c)⁵ em PBS a uma pressão consistente (42 cm H₂O).
   4. Corte quatro a cinco partes do pulmão ao longo da linha central longa transversalmente, repare em formalin de 10%, e incorpore na parafina.
   5. Corte 5 μm secções e mancha com Tricrômico de Masson para visualizar a deposição de colágeno.

8 cuidados pós-processuais

1. No final dos procedimentos de sobrevivência, coloque o animal em um cobertor de aquecimento até que recupere a consciência. A recuperação é tipicamente completa dentro de 2 min.

Resultados

A intubação seletiva IB tem como alvo lóbulos específicos (pulmão direito) ou segmentos basilares (pulmão esquerdo).

A administração de IB de EBD para o pulmão direito foi realizada conforme descrito na seção 5,1. Após a conclusão do experimento, camundongos foram administrados uma dose letal de cetamina/xilazina intraperitoneal, e os pulmões foram colhidos para demonstração da distribuição de ...

Discussão

A lesão pulmonar foi classicamente modelada em roedores usando a administração de ti de agentes prejudiciais como o BLM⁶. Tal administração de ti, no entanto, só leva a lesões irregulares, refletindo a natureza não direcionada do parto pulmonar com essa abordagem⁷. Estas limitações da modelagem de lesão pulmonar são desafios instrutivo enfrentados ao tentar a entrega de ti de agentes experimentais não-prejudiciais, tais como drogas, siRNA, ou terapias celulares...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine