Administración intrabronquial directa para mejorar la deposición selectiva del agente dentro del pulmón del ratón

Resumen

La administración intratraal (IT) de agentes experimentales en ratones a menudo resulta en un parto asimétrico a los pulmones distales.  En este informe, describimos un enfoque intrabronquial directo (IB) para canalizar cada pulmón en ratones vivos de forma no operativa.  Este enfoque se puede utilizar para administrar selectivamente agentes a un pulmón o puede adaptarse para mejorar el suministro de agentes simétricos a ambos pulmones.

Resumen

La administración intratraqueal (IT) de agentes experimentales es una técnica esencial en modelos murinos de enfermedades pulmonares difusas, como la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina.  Sin embargo, la distribución de agentes administrados por vía intratratal al pulmón del ratón distal es a menudo asimétrica, con concentraciones parénquimas pulmonares incrementadas en el pulmón izquierdo más pequeño (pero igualmente accesible) del ratón.  En este informe se describe un nuevo enfoque intrabronquial (IB) para canalizar los pulmones izquierdo y/o derecho de ratones vivos de forma no operativa.  También se demuestra cómo este enfoque puede utilizarse para administrar selectivamente agentes a un pulmón o adaptados (mediante la administración de IB ajustada por dosis) para mejorar la simetría izquierda-derecha de la administración pulmonar de agentes experimentales, mejorando así los modelos de difusión difundido enfermedad pulmonar como la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina.

Introducción

La administración pulmonar directa de agentes experimentales en ratones permite el estudio de las respuestas inmunitarias pulmonares, la lesión pulmonar aguda y la fibrosis pulmonar. La administración pulmonar directa se realiza típicamente a través de la instilación intratrahealal (IT), como se describió anteriormente^1,2,3. Sin embargo, este enfoque no es selectivo, afectando ambos pulmones de una manera no objetivo y a menudo asimétrica.  El modelado experimental de la lesión pulmonar puede beneficiarse de la capacidad de apuntar selectivamente a un pulmón específico, permitiendo el uso del pulmón contralateral como control. Por el contrario, el modelado preciso de las enfermedades pulmonares difusas humanas se beneficia de la distribución simétrica de agentes experimentales al parénquima pulmonar bilateral.

El objetivo general de este informe es describir un método para la entrega selectiva de agentes experimentales al pulmón izquierdo o derecho de un ratón (Figura 1). Este enfoque de administración intrabronquial (IB) permite el tratamiento unilateral de un pulmón ratón y se puede adaptar fácilmente para garantizar la entrega equitativa de un agente a los bronquios bilaterales del tronco principal. Mediante el uso de la administración del IB para administrar dosis mayores de agentes experimentales en el pulmón derecho más grande y volúmenes más pequeños en el pulmón izquierdo más pequeño (es decir, la administración del IB ajustada a la dosis), demostrada en este informe es una mejora en la homogeneidad de la agentes experimentales, optimizando el modelo de lesión pulmonar difusa en ratones. Como tal, este informe puede tener valor para los investigadores que buscan administrar unilateralmente agentes experimentales a ratones o mejorar la simetría de la deposición de fármacos en ambos pulmones.

Protocolo

Todos los protocolos de animales han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus) de la Universidad de Colorado denver. Todos los procedimientos descritos a continuación (secciones 4–7) se han optimizado utilizando ratones C57BL/6 masculinos y femeninos. Este enfoque ha sido validado utilizando ratones que van de 19-40 g en peso corporal.

1. Creación de una plataforma para la administración del IB

1. Doblar el extremo del libro desde el ángulo original de 90o entre el ala basal y el ala de pie a 70o (Figura2A).
2. Taladre un agujero en la parte superior central del ala de pie del libro de metal (Figura2A).
3. Taladre un agujero de tamaño idéntico en la posición correspondiente de la placa de plástico. Taladre dos agujeros más pequeños inferior y lateralmente (Figura2A).
4. Cubra una sutura de seda 4:0 entre estos pequeños agujeros en la placa de plástico (Figura2A).
5. Coloque el gancho y la cinta de bucle en el borde de la placa de plástico (Figura2A).
6. Montar la placa de plástico en el bookend de metal con el tornillo (Figura 2B). Asegúrese de que la tuerca de tornillo esté lo suficientemente apretada para mantener la placa en posición mientras permite ajustar el ángulo, si es necesario.
7. Asegúrese de que la rotación de la placa de plástico sea en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj, moviéndose libremente.
   NOTA: El movimiento en el sentido de las agujas del reloj se representa en este informe como una rotación de grado (+) y en sentido contrario a las agujas del reloj se representa como una rotación de grado (-).
8. Utilice un transportador angular para colocar la placa de plástico a +30o, +86o, -30o y -74o y márquelos en el extremo del libro, respectivamente.

2. Creación de catéteres extendidos para la administración de agentes del IB

1. Haga un corte en ángulo recto con una cuchilla afilada en la punta de un catéter original de 22 G (25 mm, ver Tabla de materiales)(Figura3, paso 1a).
2. Biselado (50o–60o) la punta del otro catéter original (25 mm) con la cuchilla y, a continuación, corte en ángulo recto desde el cubo (Figura3, paso 1b).
3. Pegue los dos catéteres en sus extremos contundentes con un ángulo ligeramente inferior a 180o (Figura3, paso 2).
4. Desnatar la punta biselada derritiéndose con una cadencia a baja temperatura (ver Tabla de Materiales).
5. Pulir el catéter extendido con papel de lija de tamaño "0" en el área encolada y la punta biselada del catéter extendido (Figura3, paso 3).
6. Marque en el catéter extendido con diferentes colores a 25 mm, 30 mm y 35 mm (Figura3, paso 3).
7. Indique el lado biselado del catéter extendido etiquetando su cubo con marcador.
8. Enjuague el catéter extendido con agua DI, después de lavar el interior del catéter con 70% de etanol. Seque el catéter.
9. Esterilice con luz UV durante 10 minutos antes de su uso.

3. Preparación previa al procedimiento

1. Hacer todos los agentes administrados en una campana de seguridad biológica bajo técnica estéril.
2. Limpie el lugar de trabajo con un 70% de etanol.
3. Esterilice todas las herramientas quirúrgicas con un 70% de etanol.
4. Fije la base de la plataforma de trabajo al banco inmediatamente delante del investigador mediante la colocación de abrazaderas C en el ala basal del extremo del libro.
5. Generar varios espirómetros improvisados, que son dispositivos que permitirán la detección del flujo de aire de marea en ratones. En resumen, deposite 60 ml de salina esterilizada en una jeringa de 1 ml (plunger eliminado) con una punta de carga de gel.
   NOTA: La gota depositada de oclusión salina el barril y se mueve hacia arriba y hacia abajo cuando se expone a la ventilación de marea³.
6. Fije libremente el cubo de un catéter extendido de 22 G al espirómetro improvisado.
7. Coloque cada uno de los cuentagotas de vidrio a cada lado de la plataforma para facilitar el acceso.
8. Conecte la cámara de inducción de isoflurano a la máquina de anestesia de roedores (ver Tabla de Materiales)en un gabinete de seguridad biológica compatible con isoflurano.

4. Enfoque de intubación de TI no operativo

1. Anestetizar un ratón C57BL/6 (masculino o femenino, 8-10 semanas, 25 g) con oxígeno (2 L/min) y 5% de isoflurano (ver Tabla de Materiales)en una cámara de inducción durante 4 min.
2. Aspirar el agente experimental a entregar (por ejemplo, tinte azul Evans o FITC-dextran, como se muestra en la Figura 4) en dos pipetas, luego colóquelas a cada lado de la plataforma durante la sedación.
3. Asegurar una frecuencia respiratoria de aproximadamente 24–30 respiraciones/min antes de extraer el ratón de la cámara de inducción de anestesia.
   NOTA: La anestesia con isoflurano suele durar 4 minutos, suficiente para todos los procedimientos del IB. Si el operador no es competente con la técnica, se puede utilizar ketamina/xilazina (80 mg/kg y 10 mg/kg por vía intraperitoneal, ver Tabla de materiales)para una anestesia más prolongada.
4. Suspenda el ratón por sus incisivos en la línea de sutura cubierta en la posición supina. Asegure el ratón con dos o tres piezas de gancho y coloque la cinta libremente, evitando la restricción de la ventilación.
5. Encienda el iluminador de fibra óptica LED (consulte Tabla de materiales, Figura 2C).
6. Coloque al operador detrás de la plataforma (dorsal al ratón).
7. Orientar el cuello de cisne del iluminador para que ilumine la zona de la laringe a través de la piel. La distancia entre el ratón y la fuente de luz es de 2-3 cm (Figura2C).
8. Confirme la profundidad de la anestesia con un pellizco de dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del dedo del toque antes de realizar todos los procedimientos a continuación.
9. Sostenga los fórceps estériles con la mano dominante, luego extraiga la lengua de la cavidad oral con los fórceps.
10. Sostenga el depresor estéril con la mano no dominante, luego aplanar la raíz de la lengua con el depresor para exponer la orofaringe ampliamente. Los fórceps pueden ser liberados, liberando la mano dominante.
11. Utilice la mano dominante para intubar el catéter extendido en la tráquea a través de la cavidad oral (Figura2C).
12. Confirme la colocación observando si la burbuja de la jeringa se mueve hacia arriba y hacia abajo con cada respiración.
13. Los detalles adicionales de la intubación de TI se han publicado previamente³. El tiempo total del procedimiento, excluyendo la anestesia, dura de 10 a 15 s para un operador bien entrenado.

5. Enfoques de intubación y entrega del IB no operativos

1. Enfoque IB para la cannulación selectiva de lobar del pulmón derecho distal
   1. Después de realizar la cannulación de TI (paso 4.11), gire la placa de plástico +30o (Figura4A).
   2. Sostenga el cubo del catéter y guíelo naturalmente en paralelo a la línea media del ratón, extendiéndolo a profundidades basadas en el peso como se describe en la Tabla1.
      NOTA: Debe tenerse en cuenta la resistencia a estas profundidades. En este punto, el ratón se volverá ligeramente taquipneico, como se explica en los resultados representativos. Para un operador experimentado, aproximadamente el 90% de los intentos cannuarán con éxito el pulmón derecho (con taquipnea observada).
   3. Proporcione 20 ml de tinte azul Evans al 0,3% (EBD, ver Tabla de materiales)con una punta de carga de gel.
   4. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1 ml cada una) de aire mediante el uso del gotero de vidrio.
      NOTA: Esto garantiza el aclaramiento de la solución residual de EBD (o agentes experimentales) desde el interior del catéter.
   5. Retire el catéter y, a continuación, mantenga la posición del ratón durante 30 s.
   6. Coloque el animal sobre una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.
2. Enfoque IB para la cannulación segmental selectiva del pulmón izquierdo distal
   1. Después de realizar la cannulación de TI (paso 4.11), gire la placa de plástico -74o (Figura4B).
   2. Sostenga el cubo del catéter y aplique una presión suave para avanzar el catéter en el bronquio del tronco principal izquierdo, mientras coloca una presión modesta tanto hacia abajo (90o) como hacia el extremo del libro. A las profundidades indicadas en la Tabla 1, el operador debe observar la resistencia a medida que se enganchan los segmentos inferiores del pulmón izquierdo. Si se produce taquipnea, retire el catéter a la posición de 20-25 mm y vuelva a intentarlo.
   3. Después de cánular los segmentos pulmonares inferiores izquierdos, se requiere un cambio de posición para permitir la asistencia gravitacional para la administración del agente. Gire la placa de plástico -30o (Figura4B).
   4. Proporcione 40 ml de EBD al 0,3% con una punta de carga de gel.
      NOTA: Es factible entregar un mayor volumen de agente porque el pulmón izquierdo tiene solo un lóbulo.
   5. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire utilizando los goteros de vidrio.
      NOTA: Esto garantiza el aclaramiento de cualquier EBD residual (o agentes experimentales) desde el interior del catéter.
   6. Retire el catéter y, a continuación, mantenga la posición del ratón durante 30 s.
   7. Coloque el animal sobre una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.
3. Adaptación de la administración del IB para permitir la administración del agente a la totalidad del pulmón izquierdo o derecho
   NOTA: Si el operador busca entregar agentes no a un lóbulo pulmonar derecho específico o segmento pulmonar izquierdo, sino más bien a todo el pulmón (pulmón derecho o izquierdo), el catéter debe retirarse ligeramente a los respectivos bronquios del tronco principal, como se indica a continuación.
   1. Administración pulmonar completa correcta
      1. Después del paso 4.11, gire la placa de plástico +30o (Figura5A).
      2. Sostenga el cubo del catéter y guíelo naturalmente en paralelo a la línea media del ratón, llegando a las profundidades necesarias para la cannulación de lobar distal del lado derecho (Tabla 1).
      3. Confirme la aparición del signo de taquipnea.
      4. Gire el ratón -74o para habilitar la asistencia por gravedad para la entrega del agente (Figura5B).
      5. Retirar el catéter a una posición que corresponda al despegue del bronquio del tronco principal derecho (Tabla 1). Asegúrese de que el bisel del catéter esté mirando hacia abajo (Figura5B).
      6. Entregar 30 sl de EBD al 0,3% con una punta de carga de gel en el pulmón derecho.
      7. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire con un gotero de vidrio.
      8. Retire el catéter, luego mantenga la posición del ratón durante 30 s. Coloque el animal en una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.
   2. Administración pulmonar entera a la izquierda
      1. Después del paso 4.11, gire la placa de plástico -74o (Figura6A). Alternativamente, la rotación puede ocurrir después del paso 5.3.1.8 retirando el catéter a la tráquea, lo que permite la administración bilateral del agente del IB.
      2. Sostenga el cubo del catéter y aplique una presión suave para avanzar el catéter en el catéter del tronco principal izquierdo, mientras coloca una presión modesta tanto hacia abajo (90o) como hacia el bookend. La profundidad de la intubación se guía por la Tabla1.
      3. Confirme la señal de no taquipnea.
      4. Gire el ratón +86o para permitir la asistencia de gravedad con la administración del agente.
      5. Retirar el catéter al bronquio del tronco principal izquierdo (las mismas distancias que el pulmón derecho son suficientes, Tabla 1) y gire el bisel del catéter hacia abajo (Figura6B).
      6. Entregar 30 sl de EBD al 0,3% con una punta de carga de gel en el pulmón izquierdo.
      7. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire con un gotero de vidrio.
      8. Retire el catéter, luego mantenga la posición del ratón durante 30 s. Coloque el animal en una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.

6. Uso de enfoques secuenciales de cánula IB para administrar volúmenes de agente ajustados a la dosis a cada pulmón

1. Grupo de administración de TI
   1. Realice la cánula ción de TI como se describe en los pasos 4.1–4.11.
   2. Entregar 60 ml de 0,05% FITC-dextran (ver Tabla de Materiales)con una punta de carga de gel (Figura1B).
   3. Dispensar 1–2 alícuotas (0,1–0,3 ml cada una) de aire utilizando los goteros de vidrio.
   4. Mantenga la posición durante 60 s y permita la recuperación del ratón como se describió anteriormente.
2. Administración bilateral simétrica del IB
   1. Realice los pasos 5.3.1.1–5.3.1.8 (pulmón derecho) y los pasos 5.3.2.1–5.3.2.8 (pulmón izquierdo).
   2. Administrar volúmenes iguales (30 l) de 0,05% FITC-dextran (o un agente experimental) a cada lado del pulmón.
3. Administración bilateral del IB ajustada a la dosis
   1. Realice los pasos 5.3.1.1–5.3.1.8 (pulmón derecho) y los pasos 5.3.2.1–5.3.2.8 (pulmón izquierdo).
   2. Administrar un volumen mayor (40 l) de 0,05% de FITC-dextran al pulmón derecho más grande, y un volumen más pequeño (20 l) de 0,05% DE FITC-dextran al pulmón izquierdo más pequeño. En lugar de FITC-dextran, se puede administrar un agente experimental.

7. Uso de la administración del IB ajustada por dosis para mejorar la simetría de una lesión pulmonar inducida por bleomicina monodosis (BLM)

1. Grupos de administración de BLM
   1. IB-BLM ajustado a la dosis (1,2 mg/kg, ver Tabla de materiales) grupo de administración: 60 l (20 l para el pulmón izquierdo y 40 l para el pulmón derecho, respectivamente) de solución de BLM se administraron en ratones (n .5). Los controles (n x 5) recibieron volúmenes similares de salina.
      NOTA: Consulte los pasos 5.3.1 y 5.3.2.
   2. Grupo de administración de TI: se entregaron 60 l de solución de BLM a ratones con técnicas de administración de TI.
      NOTA: Consulte los pasos 6.1.1–6.1.4.
2. Medición de la función pulmonar
   1. El día 21 después de BLM o salina, los ratones anestetizan con una inyección intraperitoneal (IP) de ketamina (160 mg/kg) y xilazina (32 mg/kg).
   2. Después de confirmar la profundidad de la anestesia por pellizco de pata/dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo, realice una traqueotomía con una cánula de 18 G (ver Tabla de Materiales).
   3. Conecte los ratones al respirador y mida la mecánica respiratoria como se describió anteriormente⁴.
3. Recolección y procesamiento de tejido pulmonar
   1. Tras la medición de la mecánica pulmonar, eutanasia a los ratones anestesiados por punción cardíaca.
   2. Abra la pared torácica e induzca neumotóramos bilaterales.
   3. Inflar los pulmones con 1% de agarosa de fusión baja (40 oC)⁵ en PBS a una presión constante (42 cm H₂O).
   4. Cortar de cuatro a cinco trozos del pulmón a lo largo del eje largo transversalmente, fijar en 10% de formalina, e incrustar en parafina.
   5. Corta 5 secciones y tensa con el tricromo de Masson para visualizar la deposición de colágeno.

8 Atención postprocesal

1. Al final de los procedimientos de supervivencia, coloque al animal en una manta de calentamiento hasta que recupere la conciencia. La recuperación suele completarse en un plazo de 2 minutos.

Resultados

La intubación selectiva del IB se dirige a lóbulos específicos (pulmón derecho) o segmentos basilares (pulmón izquierdo).

La administración del IB de EBD al pulmón derecho se realizó como se describe en la sección 5.1. Después de la finalización del experimento, a los ratones se les administró una dosis letal de ketamina/xilazina intraperitoneal, y los pulmones fueron cosechados para la demostración...

Discusión

La lesión pulmonar se ha modelado clásicamente en roedores queutilizan la administración de TI de agentes perjudiciales como BLM 6. Sin embargo, esta administración de TI sólo conduce a lesiones irregulares, lo que refleja la naturaleza no específica del parto pulmonar con este enfoque⁷. Estas limitaciones de modelar lesiones pulmonares son desafíos instructivos que se enfrentan al intentar la entrega de TI de agentes experimentales no lesivos, como medicamentos, siR...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine