마우스 폐 내 선택적 에이전트 침착을 개선하기 위한 직접 기관내 투여

요약

쥐에서 실험제의 INTracheal (IT) 투여는 종종 말단 폐에 비대칭 전달을 초래한다.  이 보고에서는, 우리는 살아있는 마우스에 있는 각 폐를 비 작동가능하게 캐뉼기 위하여 직접적인 기관내 (IB) 접근을 기술합니다.  이러한 접근법은 하나의 폐에 제제를 선택적으로 투여하기 위해 사용될 수 있거나 또는 두 폐에 대한 대칭에이전트 전달을 개선하기 위해 적응될 수 있다.

초록

실험제의 INTratracheal (IT) 투여는 출혈성 폐 섬유증과 같은 확산 폐 질환의 뮤린 모델에서 필수적인 기술이다.  그러나, 말단 마우스 폐에 경부 투여 에이전트의 분포는 종종 비대칭, 폐 실치 농도가 마우스의 작은 (그러나 동등하게 접근) 왼쪽 폐에서 증가와.  본 보고서에 기재된 것은 살아있는 마우스의 왼쪽 및/또는 우측 폐를 비수술적으로 캐뉼로 하는 새로운 기관내(IB) 접근법이다.  또한 이 접근법이 실험제의 폐 전달의 좌우 대칭성을 개선하기 위해 하나의 폐에 제제를 선택적으로 투여하거나 적응(투여량 조정 IB 전달을 통해)하는 데 사용될 수 있는 방법을 입증하여 확산 모델을 개선하는 방법을 입증하였다. 청혈유도 폐 섬유증과 같은 폐 질환.

서문

마우스에서 실험제의 직접 폐 투여는 폐 면역 반응, 급성 폐 손상, 및 폐 섬유증의 연구를 허용한다. 직접 폐 투여는 전형적으로 설명된 바와 같이, 내강내(IT) 주입을 통해 수행된다^1,2,3. 그러나, 이 접근은 비선택적이고, 비표적및 수시로 비대칭 적인 방식으로 두 폐에 영향을 미칩니다.  폐 손상의 실험 적인 모델링은 선택적으로 대조군으로 반대쪽 폐의 사용을 허용하는 1개의 특정 폐를 표적으로 하는 기능에서 유익할 수 있습니다. 반대로, 인간 확산 폐 질환의 정확한 모델링은 양측 폐 실치종에 대한 실험제의 대칭 분포로부터 유익합니다.

이 보고서의 전체적인 목표는 마우스의 왼쪽 또는 오른쪽 폐에 실험제제를 선택적으로전달하는 방법을 설명하는 것이다(도 1). 이러한 기관내(IB) 투여 접근법은 마우스 폐의 일방적인 치료를 허용하고 양측 메인스템 기관지에게 제제의 동등한 전달을 보장하기 위해 용이하게 적응될 수 있다. IB 투여를 사용하여 더 큰 우측 폐에 더 큰 용량의 실험제제를 전달하고 더 작은 좌측 폐(즉, 투여량 조정 IB 투여)에 더 작은 부피를 전달함으로써, 이 보고서에서 입증된 폐의 균질성의 개선은 폐의 균질성의 개선이다. 실험 에이전트의 전달, 마우스에서 확산 폐 손상의 모델을 최적화. 이와 같이, 이 보고는 마우스에 실험에이전트를 일방적으로 관리하거나 두 폐에 있는 약 증착의 대칭을 향상하기 위하여 노력하는 조사자들을 위한 가치를 보유할 수 있습니다.

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프로토콜

모든 동물 프로토콜은 콜로라도 덴버 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 아래에 설명 된 모든 절차 (섹션 4-7) 남성과 여성 C57BL/6 마우스를 사용 하 여 최적화 되었습니다. 이 접근은 체중에 있는 19-40 g에 구역 수색하는 마우스를 사용하여 유효했습니다.

1. IB경영을 위한 플랫폼 구축

1. 기저 날개와 스탠딩 윙 사이의 원래 90° 각도에서 북엔드를 70°(그림2A)로구부립니다.
2. 금속 북엔드의 스탠딩 윙중앙에 구멍을 뚫습니다(그림2A).
3. 플라스틱 보드의 해당 위치에서 동일한 크기의 구멍을 뚫습니다. 두 개의 작은 구멍을 열등하고 측면으로 드릴합니다(그림2A).
4. 플라스틱 보드의 작은 구멍 사이에 4:0 실크 봉합사를 드레이프(그림2A).
5. 후크와 루프 테이프를 플라스틱 보드 의가장자리에 놓습니다(그림 2A).
6. 플라스틱 보드를 나사로 금속 북엔드에 조립합니다(그림2B). 필요한 경우 나사 너트가 보드를 제자리에 고정할 수 있도록 충분히 단단히 고정하고 각도를 조정할 수 있는지 확인합니다.
7. 플라스틱 보드의 회전이 시계 방향과 반시계 방향으로 자유롭게 움직이도록 하십시오.
   주: 시계 방향 모션은 이 보고서에서 (+) 정도 회전으로 표시되고 시계 반대 방향은 (-) 정도 회전으로 표시됩니다.
8. 각도 각도기를 사용하여 플라스틱 보드를 +30°, +86°, -30°및 -74°로 배치하고 북엔드에 각각 표시합니다.

2. IB 제제 투여를 위한 확장 카테터 생성

1. 원래 22G 카테터 (25mm, 재료 표참조)의 끝에 날카로운 블레이드로 직각 컷을 합니다 (그림3, 단계 1a).
2. 블레이드가 있는 다른 원래 카테터(25mm)의 팁을 베벨(~50°-60°)한 다음 허브에서 직각으로 잘라냅니다(그림3, 1b 단계).
3. 무딘 끝에 두 카테터를 180 ° 각도보다 약간 적게 붙입니다 (그림3, 2 단계).
4. 저온 소작으로 녹여 서 절제 된 팁을 무디게하십시오 (재료 표참조).
5. 확장 카테터를 접착 된 부위와 확장 카테터의 경종 끝에 "0"크기의 사포로 연마하십시오 (그림3, 단계 3).
6. 확장된 카테터에 25mm, 30mm 및 35mm(그림3, 3단계)로 서로 다른 색상으로 표시합니다.
7. 허브에 마커로 레이블을 지정하여 확장 카테터의 경사면을 표시합니다.
8. 확장 된 카테터를 DI 물로 헹구고 카테터 내부를 70 % 에탄올로 씻어 내세요. 카테터를 에어드라이.
9. 사용하기 전에 10 분 동안 자외선으로 살균하십시오.

3. 사전 절차 준비

1. 멸균 기술하에 생물학적 안전 후드에 투여된 모든 제제를 만드십시오.
2. 70% 에탄올로 작업공간을 청소하십시오.
3. 70% 에탄올로 모든 수술 도구를 살균하십시오.
4. C-클램프를 북엔드의 기초 날개에 부착하여 작업 플랫폼의 베이스를 연구원 바로 앞의 벤치에 고정합니다.
5. 마우스의 조수 기류를 감지할 수 있는 장치인 여러 임시 척추계를 생성합니다. 간단히, 겔 로딩 팁으로 멸균 된 식염수 60 μL을 1 mL 주사기 (플런저 제거)에 침전.
   참고 : 식염수의 증착 된 방울은 배럴을 가리고 조수 환기에 노출될 때 위쪽과 아래쪽으로 이동합니다^3.
6. 22G 확장 카테터의 허브를 임시 폐활량계에 느슨하게 부착합니다.
7. 접근의 용이성을 위해 각 유리 드롭퍼를 플랫폼의 각 측면에 놓습니다.
8. 이소플루란 유도 챔버를 설치류 마취 기계에 연결합니다(재료 표참조)를 이소플루란 호환 생물학적 안전 캐비닛에 연결합니다.

4. 비운영 IT 삽관 접근 방식

1. C57BL/6 마우스(남성 또는 여성, 8-10주, ~25g)를 산소(2L/min) 및 5% 이소플루란(재료 표참조)으로 4분 동안 유도 챔버에 마취시요.
2. 전달될 실험제(예를 들어, 에반스블루 염료 또는 FITC-dextran)를 두 개의 파이펫으로 전달한 다음, 침전 동안 플랫폼의 각 측면에 배치한다.
3. 마취 유도실에서 마우스를 제거하기 전에 약 24-30 호흡 / 분의 호흡 속도를 확인합니다.
   참고: 이소플루란 마취는 일반적으로 4분 동안 지속되며 모든 IB 절차에 충분합니다. 작업자가 이 기술에 능숙하지 않은 경우 케타민/자일라진(80 mg/kg 및 10 mg/kg 의 복강 내)은 더 장기간 마취에 사용될 수 있습니다.
4. 스파인 자세의 드레이프 봉합사 라인의 앞니에 마우스를 일시 중단합니다. 2~3개의 후크로 마우스를 고정하고 테이프를 느슨하게 반복하여 환기의 제한을 피하십시오.
5. LED 광섬유 조명을 켭니다(재료 표, 그림 2C참조).
6. 운영자를 플랫폼 뒤에 배치합니다(마우스에 등대).
7. 피부를 통해 후두 영역을 조명되도록 조명기의 구즈넥을 배향하십시오. 마우스와 광원 사이의 거리는 2-3cm(그림 2C)입니다.
8. 아래의 모든 절차를 수행하기 전에 발가락 / 발 핀치로 마취의 깊이를 확인하십시오.
9. 지배적 인 손으로 멸균 집게를 잡고 집게로 구강에서 혀를 꺼낸다.
10. 비지배적 인 손으로 멸균 우울기를 잡고, 구인두를 널리 노출시키기 위해 우울기로 혀의 뿌리를 평평하게하십시오. 그런 다음 집게를 풀어 주어 지배적인 손을 자유롭게 할 수 있습니다.
11. 지배적 인 손을 사용하여 구강을 통해 기관으로 확장 된 카테터를 삽관하십시오 (그림2C).
12. 주사기의 거품이 숨을 쉴 때마다 위아래로 움직이는지 관찰하여 배치를 확인합니다.
13. IT 삽관에 대한 추가 세부정보는 이전에 3. 마취를 제외한 총 시술 시간은 잘 훈련된 작업자의 경우 10-15s입니다.

5. 비수술적 IB 삽관 및 납품 접근법

1. IB 접근법은 말단 우측 폐의 선택적 엽 통조림에 대한 접근법
   1. IT 캐니풀을 수행한 후(단계 4.11), 플라스틱 보드+30°(그림 4A)를 회전시다.
   2. 카테터의 허브를 잡고 마우스 미드라인에 병렬로 자연스럽게 안내하여 표1에 설명된 대로 중량 기반 깊이로 확장합니다.
      참고 : 이러한 깊이에서 저항을 주목해야한다. 이 시점에서, 마우스는 대표결과에 설명된 바와 같이 약간 빈시프니가 될 것이다. 숙련 된 연산자의 경우 약 90 %의 시도가 오른쪽 폐를 성공적으로 캔누 (빈시 프네아)로 할 것입니다.
   3. 젤 로딩 팁으로 0.3% 에반스 블루 염료(EBD, 재료 표참조)의 20 μL을 전달합니다.
   4. 유리 드롭퍼를 사용하여 공기의 1-2 알리쿼트 (각각 0.1 mL)를 분배하십시오.
      참고: 이는 카테터 내부에서 잔류 EBD 용액(또는 실험제)의 클리어런스를 보장합니다.
   5. 카테터를 철회한 다음 마우스 위치를 30s로 유지합니다.
   6. 동물을 의식을 되찾을 때까지 따뜻하게 담요에 놓습니다. 복구는 일반적으로 2 분 이내에 완료됩니다.
2. 말단 좌폐의 선택적 세그먼트 캐널에 대한 IB 접근법
   1. IT 캐니풀을 수행 한 후 (단계 4.11),플라스틱 보드 -74 ° 회전 (그림 4B).
   2. 카테터의 허브를 잡고 카테터를 왼쪽 메인 스템 기관지로 전진시키기 위해 부드러운 압력을 가하면서 아래쪽 (90°)과 북엔드쪽으로 적당한 압력을 가합니다. 표1에 기거된 깊이에서, 작업자는 왼쪽 폐의 하부 세그먼트가 관여할 때 저항을 주목해야 한다. 빈시프네가 발생하면 카테터를 20-25mm 위치로 철회하고 다시 시도하십시오.
   3. 왼쪽 하부 폐 세그먼트를 캐뉼링 한 후 에이전트 관리를위한 중력 지원을 허용하려면 위치 변경이 필요합니다. 플라스틱 보드를 회전 -30° (그림 4B).
   4. 겔 로딩 팁으로 0.3% EBD의 40 μL을 전달합니다.
      참고 : 왼쪽 폐에는 하나의 엽만 있기 때문에 더 많은 양의 제를 전달하는 것이 가능합니다.
   5. 유리 드롭퍼를 사용하여 공기의 1-2 알리쿼트 (각각 0.1-0.3 mL)를 분배하십시오.
      참고: 이는 카테터 내부에서 잔류 EBD(또는 실험제)의 클리어런스를 보장합니다.
   6. 카테터를 철회한 다음 마우스 위치를 30s로 유지합니다.
   7. 동물을 의식을 되찾을 때까지 따뜻하게 담요에 놓습니다. 복구는 일반적으로 2 분 이내에 완료됩니다.
3. 왼쪽 또는 오른쪽 폐 전체에 에이전트의 전달을 허용하는 IB 행정의 적응
   참고: 작업자가 특정 우측 폐 엽 또는 좌폐 세그먼트가 아닌 전체 폐(오른쪽 또는 왼쪽 폐)에 제제를 전달하려는 경우 카테터는 다음과 같이 각 메인스템 기관지로 약간 인출되어야 합니다.
   1. 오른쪽 전체 폐 관리
      1. 4.11단계 후 플라스틱 보드 +30°(그림5A)를돌이키십시오.
      2. 카테터의 허브를 잡고 마우스 미드라인에 평행하게 자연스럽게 안내하여, 오른쪽 양면 말단 엽 캐니언에필요한 깊이까지 도달합니다(표 1).
      3. 타키프네아 기호의 모양을 확인합니다.
      4. 마우스를 -74° 회전하여 에이전트 전달을위한 중력 지원을 활성화합니다(그림 5B).
      5. 카테터를 오른쪽 주스템 기관지의 이륙에 대응하는 위치로 인출한다(표 1). 카테터의 경사가 아래쪽을 향하도록 합니다(그림5B).
      6. 오른쪽 폐에 겔 로딩 팁을 사용하여 0.3% EBD의 30 μL을 전달합니다.
      7. 유리 드롭퍼를 사용하여 공기1-2알구(각각 0.1-0.3 mL)를 분배합니다.
      8. 카테터를 철회한 다음 마우스 위치를 30대 유지합니다. 복구는 일반적으로 2 분 이내에 완료됩니다.
   2. 왼쪽 전체 폐 관리
      1. 4.11단계 후 플라스틱 보드를 -74°(그림6A)로돌이십시오. 대안적으로, 5.3.1.8 단계 후에 카테터를 기관으로 인출하여, 양측 IB 제제 투여를 가능하게 함으로써 회전이 발생할 수 있다.
      2. 카테터의 허브를 잡고 카테터를 왼쪽 메인 스템 카테터로 전진시키기 위해 부드러운 압력을 가하면서 아래쪽 (90°)과 북엔드쪽으로 적당한 압력을 가합니다. 삽관 깊이는 표 1에의해 안내됩니다.
      3. 타키프네아 기호없음을 확인합니다.
      4. 마우스 +86°를 회전하여 에이전트 관리에 중력을 지원합니다.
      5. 카테터를 왼쪽 메인스템 기관지(오른쪽 폐와 동일한 거리가 충분하다, 표1)로 철회하고 카테터의 경사를 아래쪽으로 회전시다(도6B).
      6. 왼쪽 폐에 겔 로딩 팁을 사용하여 0.3% EBD의 30 μL을 전달합니다.
      7. 유리 드롭퍼를 사용하여 공기1-2알구(각각 0.1-0.3 mL)를 분배합니다.
      8. 카테터를 철회한 다음 마우스 위치를 30대 유지합니다. 복구는 일반적으로 2 분 이내에 완료됩니다.

6. 각 폐에 투여 량 조정 된 양의 에이전트를 전달하기 위해 순차적 인 IB 캐니언 접근법사용

1. IT 관리 그룹
   1. 4.1-4.11 단계에 설명된 대로 IT 캐니언을 수행합니다.
   2. 0.05% FITC-dextran(재료 표참조)의 60 μL을 젤 로딩 팁(그림1B)으로전달합니다.
   3. 유리 드롭퍼를 사용하여 공기의 1-2 알리쿼트 (각각 0.1-0.3 mL)를 분배하십시오.
   4. 60s의 위치를 유지하고 위에서 설명한 대로 마우스 복구를 허용합니다.
2. 대칭 양측 IB 관리
   1. 단계 5.3.1.1-5.3.1.8(오른쪽 폐)을 수행하고 5.3.2.1-5.3.2.8(왼쪽 폐)을 수행합니다.
   2. 폐의 각 측면에 0.05% FITC-dextran (또는 실험제)의 동일한 부피 (30 μL)를 투여하십시오.
3. 투여량 조정 양측 IB 투여
   1. 단계 5.3.1.1-5.3.1.8 (오른쪽 폐)을 수행하고 단계 5.3.2.1-5.3.2.8 (왼쪽 폐)을 수행합니다.
   2. 더 큰 우측 폐에 0.05% FITC-dextran의 더 큰 부피(40 μL)를 투여하고, 더 작은 부피(20 μL)를 0.05% FITC-dextran의 더 작은 좌측 폐에 투여한다. FITC-dextran 대신에, 실험제가 투여될 수 있다.

7. 단일 용량 블로마이신 (BLM)-유도 폐 손상의 대칭을 개선하기 위해 투여 량 조정 IB 투여의 사용

1. BLM 관리 그룹
   1. 투여량-조정 된 IB-BLM (1.2 mg/kg, 재료 표참조) 투여 군: 60 μL (좌측 폐에 대한 20 μL 및 우측 폐에 대한 40 μL 각각) BLM 용액을 마우스에 전달하였다 (n = 5). 컨트롤(n = 5)은 비슷한 양의 식염수를 받았습니다.
      참고: 5.3.1 단계와 5.3.2 단계를 참조하십시오.
   2. IT 투여 군: 60 μL의 BLM 용액을 IT 투여 기술로 마우스에 전달하였다.
      참고: 6.1.1-6.1.4 단계를 참조하십시오.
2. 폐 기능 측정
   1. BLM 또는 식염수 후 21일째에 케타민(160 mg/kg)과 자일라진(32 mg/kg)을 주입한 복강 내(IP) 주사로 마우스를 마취시다.
   2. 발 / 발가락 핀치로 마취의 깊이를 확인 한 후 18 G 캐뉼라로 기관 절제술을 수행하십시오 (재료 표참조).
   3. 마우스를 인공호흡기에 연결하고 앞서 설명한 대로호흡 역학을 측정합니다 4.
3. 폐 조직 수집 및 처리
   1. 폐 역학의 측정에 따라, 심장 천자에 의해 마취 된 마우스를 안락사.
   2. 가슴 벽을 열고 양측 기흉을 유도합니다.
   3. 일관된 압력(42 cm H₂O)에서 PBS에서 1% 낮은 용융 아가로즈(40°C)로 폐를 팽창시.
   4. 긴 축을 따라 폐의 4 ~5 개를 가로로 자르고 10 % 포르말린을 수정하고 파라핀에 포함시다.
   5. 콜라겐 침착을 시각화하기 위해 5 μm 섹션을 자르고 마손의 삼조로 얼룩을 가합니다.

8 절차 후 관리

1. 생존 절차가 끝나면 동물을 의식을 되찾을 때까지 따뜻하게 담요에 놓습니다. 복구는 일반적으로 2 분 이내에 완료됩니다.

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결과

선택적 IB 삽관은 특정 로브 (오른쪽 폐) 또는 바실라 세그먼트 (왼쪽 폐)를 대상으로합니다.

오른쪽 폐에 대한 EBD의 IB 투여는 섹션 5.1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 실험이 완료된 후, 마우스는 복강내 케타민/자일라진의 치명적인 용량을 투여하였고, 폐는 EBD 분포의 데모를 위해 수확되었다(도4A...

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토론

폐 상해는 BLM 6과 같은 해로운 에이전트의 IT 행정을사용하여 설치류에서 고전적으로 모델링되었습니다. 그러나 이러한 IT 관리는 이러한 접근법을 통해 폐 전달의 비표적 특성을반영하여 누덕거리는 상해로 이어질 뿐이다 7. 폐 상해 모델링의 이러한 제한은 약물, siRNA 또는 세포 치료와 같은 비 해로운 실험 에이전트의 IT 전달을 시도할 때 직면한 유익한 과제?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine