Direkte intrabronchiale Verabreichung zur Verbesserung der selektiven Agentenablagerung innerhalb der Mauslunge

Zusammenfassung

Die intratracheale (IT) Verabreichung von Versuchsmitteln bei Mäusen führt oft zu einer asymmetrischen Abgabe in die distale Lunge.  In diesem Bericht beschreiben wir einen direkten intrabronchialen (IB) Ansatz, um jede Lunge bei lebenden Mäusen nicht operativ zu nulaten.  Dieser Ansatz kann verwendet werden, um Wirkstoffe selektiv in eine Lunge zu verabreichen, oder kann angepasst werden, um die symmetrische Wirkstoffabgabe in beide Lungen zu verbessern.

Zusammenfassung

Die intratracheale (IT) Verabreichung von experimentellen Wirkstoffen ist eine wesentliche Technik bei murinen Modellen diffuser Lungenerkrankungen, wie Bleomycin-induzierte Lungenfibrose.  Die Verteilung der intratracheal verabreichten Wirkstoffe auf die distale Mauslunge ist jedoch oft asymmetrisch, wobei die Lungenparenchymalkonzentrationen in der kleineren (aber ebenso zugänglichen) linken Lunge der Maus erhöht werden.  Beschrieben in diesem Bericht ist ein neuartiger intrabronchialer (IB) Ansatz, um die linke und/oder rechte Lunge lebender Mäuse nicht operativ zu kleben.  Es wird auch gezeigt, wie dieser Ansatz verwendet werden kann, um Wirkstoffe selektiv an eine Lunge zu verabreichen oder angepasst (über dosisangepasste IB-Abgabe), um die Links-Rechts-Symmetrie der Lungenabgabe von Versuchsmitteln zu verbessern und dadurch die Modelle diffuser Lungenerkrankungen wie Bleomycin-induzierte Lungenfibrose.

Einleitung

Die direkte Lungenverabreichung von Experimentellen Wirkstoffen bei Mäusen ermöglicht die Untersuchung von Lungenimmunreaktionen, akuten Lungenverletzungen und Lungenfibrose. Die direkte Lungenverabreichung erfolgt in der Regel über intratracheale (IT) Instillation, wie zuvor beschrieben^1,2,3. Dieser Ansatz ist jedoch nicht selektiv und wirkt sich auf beide Lungen in einer nicht gezielten und oft asymmetrischen Weise aus.  Experimentelle Modellierung von Lungenverletzungen kann von der Fähigkeit profitieren, selektiv auf eine bestimmte Lunge zu zielen, was die Verwendung der kontralateralen Lunge als Kontrolle ermöglicht. Umgekehrt profitiert eine genaue Modellierung menschlicher diffuser Lungenerkrankungen von der symmetrischen Verteilung experimenteller Wirkstoffe auf das bilaterale Lungenparenchym.

Das übergeordnete Ziel dieses Berichts besteht darin, ein Verfahren zur selektiven Abgabe von Versuchsmitteln auf die linke oder rechte Lunge einer Maus zu beschreiben (Abbildung 1). Dieser intrabronchiale (IB) Verabreichungsansatz ermöglicht eine einseitige Behandlung einer Mauslunge und kann leicht angepasst werden, um die gleiche Abgabe eines Mittels an die bilaterale Mainstammbronchi zu gewährleisten. Durch die Verwendung der IB-Verabreichung, um größere Dosen von Experimentellen Wirkstoffen an die größere rechte Lunge und kleinere Volumina an die kleinere linke Lunge zu liefern (d. h. dosisbereinigte IB-Verabreichung), die in diesem Bericht gezeigt wird, ist eine Verbesserung der Homogenität der lungenmonalen Lieferung von Versuchsmitteln, Optimierung des Modells der diffusen Lungenverletzung bei Mäusen. Daher kann dieser Bericht für Forscher, die entweder einseitig Versuchsstoffe an Mäuse verabreichen oder die Symmetrie der Arzneimittelablagerung in beiden Lungen verbessern wollen, einen Wert haben.

Protokoll

Alle Tierprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Colorado Denver genehmigt. Alle unten beschriebenen Verfahren (Abschnitte 4–7) wurden sowohl mit männlichen als auch mit weiblichen C57BL/6-Mäusen optimiert. Dieser Ansatz wurde mit Mäusen im Körpergewicht von 19 bis 40 g validiert.

1. Schaffung einer Plattform für die IB-Administration

1. Biegen Sie das Buchend aus dem ursprünglichen 90°-Winkel zwischen dem Basalflügel und dem stehenden Flügel auf 70° (Abbildung2A).
2. Bohren Sie ein Loch an der Mitte des stehenden Flügels des Metallbuchs (Abbildung 2A).
3. Bohren Sie ein Loch gleicher Größe an der entsprechenden Position der Kunststoffplatte. Bohren Sie zwei kleinere Löcher minderwertig und seitlich (Abbildung 2A).
4. Eine 4:0 Seidennaht zwischen diesen kleinen Löchern in der Kunststoffplatte (Abbildung2A) drapieren
5. Legen Sie den Haken und das Schleifenband am Rand der Kunststoffplatine (Abbildung 2A).
6. Montieren Sie die Kunststoffplatte mit der Schraube an das Metallbuchende (Abbildung 2B). Stellen Sie sicher, dass die Schraubmutter ausreichend fest ist, um die Platine in Position zu halten, während Sie bei Bedarf eine Winkeleinstellung ermöglichen.
7. Stellen Sie sicher, dass die Drehung der Kunststoffplatine im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn erfolgt und sich frei bewegt.
   HINWEIS: Bewegung im Uhrzeigersinn wird in diesem Bericht als (+) Graddrehung und gegen den Uhrzeigersinn als (-) Gradrotation dargestellt.
8. Verwenden Sie einen Winkelwinkel, um die Kunststoffplatte bei +30°, +86°, -30° und -74° zu positionieren und sie am Buchende zu markieren.

2. Erstellung von verlängerten Kathetern für die IB-Agentenverwaltung

1. Machen Sie einen rechten Winkel schnitt mit einer scharfen Klinge auf der Spitze eines ursprünglichen 22 G Katheter (25 mm, siehe Tabelle der Materialien) ( Abbildung3, Schritt 1a).
2. Verschrägen Sie die Spitze des anderen Originalkatheters (25 mm) mit der Klinge , dann im rechten Winkel von der Nabe abgeschnitten (Abbildung3, Schritt 1b).
3. Kleben Sie die beiden Katheter an ihren stumpfen Enden mit einem etwas weniger als 180° Winkel (Abbildung3, Schritt 2).
4. Blunt die abgeschrägte Spitze durch Schmelzen mit einer niedrigen Temperatur Kautery (siehe Tabelle der Materialien).
5. Den verlängerten Katheter mit Schleifpapier der Größe "0" auf der geklebten Fläche und der abgeschrägten Spitze des verlängerten Katheters polieren (Abbildung3, Schritt 3).
6. Markieren Sie den verlängerten Katheter mit verschiedenen Farben bei 25 mm, 30 mm und 35 mm (Abbildung3, Schritt 3).
7. Geben Sie die Abschrägungsseite des verlängerten Katheters an, indem Sie ihre Nabe mit Marker beschriften.
8. Spülen Sie den verlängerten Katheter mit DI-Wasser, gefolgt von Spülungen im Inneren des Katheters mit 70% Ethanol. Den Katheter lüften.
9. Sterilisieren Sie mit UV-Licht für 10 min vor Gebrauch.

3. Vorbereitung vor dem Verfahren

1. Machen Sie alle verabreichten Wirkstoffe in einer biologischen Sicherheitshaube unter steriler Technik.
2. Reinigen Sie den Arbeitsplatz mit 70% Ethanol.
3. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit 70% Ethanol.
4. Befestigen Sie die Basis der Arbeitsbühne direkt vor dem Forscher, indem Sie C-Klemmen am Basalflügel des Buchends anbringen.
5. Generieren Sie mehrere behelfsmäßige Spirometer, die Geräte sind, die die Detektion des Gezeitenluftstroms bei Mäusen ermöglichen. Kurz gesagt, legen Sie 60 l sterilisierte Saline in eine 1 ml Spritze (Plunger entfernt) mit einer Gel-Ladespitze ab.
   HINWEIS: Der abgelagerte Tropfen der Salzlinie verschließt das Fass und bewegt sich nach oben und unten, wenn er der Gezeitenbelüftung ausgesetzt ist³.
6. Befestigen Sie die Nabe eines 22 G verlängerten Katheters lose am behelfsmäßigen Spirometer.
7. Platzieren Sie jeden der Glastropfen auf jeder Seite der Plattform für einen einfachen Zugang.
8. Verbinden Sie die Isofluran-Induktionskammer mit der Nagetieranästhesiemaschine (siehe Materialtabelle) in einem isofluran-kompatiblen biologischen Sicherheitsschrank.

4. Nicht-operativer IT-Intubationsansatz

1. Anästhetisieren Sie eine C57BL/6-Maus (männlich oder weiblich, 8–10 Wochen, 25 g) mit Sauerstoff (2 l/min) und 5% Isofluran (siehe Materialtabelle)in einer Induktionskammer für 4 min.
2. Aspirieren Sie das zu liefernde Versuchsmittel (z. B. Evans Blaufarbstoff oder FITC-Dextran, wie in Abbildung 4gezeigt), in zwei Pipetten und legen Sie sie dann während der Sedierung an jeder Seite der Plattform ab.
3. Stellen Sie eine Atemfrequenz von ca. 24–30 Atemnot/min sicher, bevor Sie die Maus aus der Anästhesie-Induktionskammer entfernen.
   HINWEIS: Isoflurane Anästhesie dauert in der Regel für 4 min, ausreichend für alle IB-Verfahren. Wenn der Bediener mit der Technik nicht vertraut ist, kann Ketamin/Xylazin (80 mg/kg und 10 mg/kg intraperitoneal, siehe Materialtabelle) für längere Anästhesie verwendet werden.
4. Halten Sie die Maus durch ihre Schneidezähne auf der drapierten Nahtlinie in der Supine-Position. Sichern Sie die Maus mit zwei bis drei Hakenstücken und schleifen Sie das Band lose, um eine Einschränkung der Belüftung zu vermeiden.
5. Schalten Sie die LED-Glasfaserbeleuchtung ein (siehe Materialtabelle, Abbildung 2C).
6. Positionieren Sie den Bediener hinter der Plattform (dorsal zur Maus).
7. Richten Sie den Schwanenhals des Leuchters so aus, dass er den Kehlkopfbereich durch die Haut beleuchtet. Der Abstand zwischen Maus und Lichtquelle beträgt 2–3 cm (Abbildung 2C).
8. Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie mit einer Zehen-/Pfoten-Pinch, bevor Sie alle unten aufgeführten Verfahren durchführen.
9. Halten Sie die sterile Zange mit der dominanten Hand, dann ziehen Sie die Zunge aus der Mundhöhle mit der Zange.
10. Halten Sie den sterilen Depressivum mit der nicht dominanten Hand, dann glätten Sie die Wurzel der Zunge mit dem Depressor, um den Oropharynx weit zu belichten. Die Zange kann dann freigesetzt werden, wodurch die dominante Hand frei wird.
11. Verwenden Sie die dominante Hand, um den verlängerten Katheter über die Mundhöhle in die Luftröhre zu intubieren (Abbildung 2C).
12. Bestätigen Sie die Platzierung, indem Sie beobachten, ob sich die Blase in der Spritze mit jedem Atemzug nach oben und unten bewegt.
13. Weitere Details zur IT-Intubation wurden bereits veröffentlicht³. Die Gesamte Prozesszeit, ohne Anästhesie, dauert 10–15 s für einen gut ausgebildeten Bediener.

5. Nicht-operative IB-Intubations- und Lieferansätze

1. IB-Ansatz zur selektiven Lobar-Cannulation der distalen rechten Lunge
   1. Nach der DURCHFÜHRUNG der IT-Kanulation (Schritt 4.11) drehen Sie die Kunststoffplatte +30° (Abbildung 4A).
   2. Halten Sie die Nabe des Katheters und führen Sie ihn natürlich parallel zur Mausmittellinie, und erweitern Sie ihn auf gewichtsbasierte Tiefen, wie in Tabelle 1beschrieben.
      HINWEIS: Der Widerstand in diesen Tiefen sollte beachtet werden. An diesem Punkt wird die Maus leicht tachypnoisch, wie in den repräsentativen Ergebnissen erklärt. Für einen erfahrenen Bediener können ca. 90% der Versuche erfolgreich die rechte Lunge (mit Tachypnoe festgestellt) annieren.
   3. Liefern Sie 20 l 0,3% Evans Blaufarbstoff (EBD, siehe Tabelle der Materialien) mit einer Gel-Ladespitze.
   4. Geben Sie 1-2 Aliquots (je 0,1 ml) Luft mit dem Glastropfen.
      HINWEIS: Dies gewährleistet die Freiraumung der verbleibenden EBD-Lösung (oder Versuchsmittel) von innen aus dem Katheter.
   5. Ziehen Sie den Katheter ab, und halten Sie dann die Mausposition für 30 s.
   6. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.
2. IB-Ansatz zur selektiven segmentalen Cannulation der distalen linken Lunge
   1. Nach der DURCHFÜHRUNG der IT-Kanulation (Schritt 4.11) drehen Sie die Kunststoffplatte -74° (Abbildung 4B).
   2. Halten Sie die Nabe des Katheters und wenden Sie sanften Druck an, um den Katheter in den linken Mainstem Bronchus zu bringen, während Sie sowohl nach unten (90°) als auch in Richtung Buchende bescheidenen Druck ausüben. Bei tiefen, diein Tabelle 1 angegeben sind, sollte der Bediener Widerstand beachten, wenn die unteren Segmente der linken Lunge eingebunden sind. Wenn Tachypnoe auftritt, ziehen Sie den Katheter in die 20–25 mm Position, und versuchen Sie es erneut.
   3. Nach der Cannulation der linken unteren Lungensegmente ist eine Positionsänderung erforderlich, um Gravitationsunterstützung für die Agentenadministration zu ermöglichen. Drehen Sie die Kunststoffplatte -30° (Abbildung 4B).
   4. Liefern Sie 40 l 0,3% EBD mit einer Gel-Ladespitze.
      HINWEIS: Es ist möglich, ein größeres Volumen an Agenten zu liefern, da die linke Lunge nur einen Lappen hat.
   5. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit den Glastropfen.
      HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass alle verbleibenden EBD (oder Versuchsmittel) von innen aus dem Katheter frei werden.
   6. Ziehen Sie den Katheter ab, und halten Sie dann die Mausposition für 30 s.
   7. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.
3. Anpassung der IB-Administration, um die Lieferung des Mittels an die gesamte linke oder rechte Lunge zu ermöglichen
   HINWEIS: Wenn der Bediener versucht, Wirkstoffe nicht an einen bestimmten rechten Lungenlappen oder ein linkes Lungensegment zu liefern, sondern an die gesamte Lunge (rechte oder linke Lunge), sollte der Katheter leicht auf die jeweiligen Mainstammbronchien zurückgezogen werden, wie folgt.
   1. Richtige gesamte Lungenadministration
      1. Nach Schritt 4.11 drehen Sie die Kunststoffplatte +30° (Abbildung 5A).
      2. Halten Sie die Nabe des Katheters und führen Sie ihn natürlich parallel zur Mausmittellinie, bis sie in tiefen reicht, die für die rechtsseitige distale Lobar-Kanonulation notwendig sind (Tabelle 1).
      3. Bestätigen Sie das Aussehen des Tachypnea-Zeichens.
      4. Drehen Sie die Maus -74°, um die Schwerkraftunterstützung für die Agentenlieferung zu aktivieren (Abbildung 5B).
      5. Ziehen Sie den Katheter in eine Position, die dem Start des rechten Hauptstammbronchus entspricht (Tabelle 1). Stellen Sie sicher, dass die Abschrägung des Katheters nach unten zeigt (Abbildung 5B).
      6. Liefern Sie 30 l 0,3% EBD mit einer Gel-Ladespitze auf die rechte Lunge.
      7. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit einem Glastropfen aus.
      8. Ziehen Sie den Katheter ab, halten Sie dann die Mausposition für 30 s. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.
   2. Linke gesamte Lungenverwaltung
      1. Nach Schritt 4.11 drehen Sie die Kunststoffplatte -74° (Abbildung 6A). Alternativ kann die Rotation nach Schritt 5.3.1.8 erfolgen, indem der Katheter in die Luftröhre zurückgezogen wird, was die bilaterale Ib-Agentenverwaltung ermöglicht.
      2. Halten Sie die Nabe des Katheters und wenden Sie sanften Druck an, um den Katheter in den linken Hauptstammkatheter zu bringen, während sie sowohl nach unten (90°) als auch in Richtung Buchende bescheidenen Druck ausüben. Die Tiefe der Intubation wird durch Tabelle 1geleitet.
      3. Bestätigen Sie das No-Tachypnoe-Zeichen.
      4. Drehen Sie die Maus +86°, um schwerkraftunterstützende Hilfe bei der Agentenadministration zu ermöglichen.
      5. Ziehen Sie den Katheter nach links Mainstem bronchus (die gleichen Entfernungen wie die rechte Lunge sind ausreichend, Tabelle 1) und drehen Sie die Abschrägung der Katheterflächen nach unten (Abbildung 6B).
      6. Liefern Sie 30 l 0,3% EBD mit einer Gel-Ladespitze in die linke Lunge.
      7. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit einem Glastropfen aus.
      8. Ziehen Sie den Katheter ab, halten Sie dann die Mausposition für 30 s. Legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.

6. Verwendung sequenzieller IB-Kanulationsansätze zur Dosisbereinigten Wirkstoffmenge an jede Lunge

1. IT-Verwaltungsgruppe
   1. Führen Sie die IT-Cannulation wie in den Schritten 4.1–4.11 beschrieben durch.
   2. Liefern Sie 60 l von 0,05% FITC-dextran (siehe Materialtabelle) mit einer Gelladespitze (Abbildung 1B).
   3. Geben Sie 1-2 Aliquots (jeweils 0,1–0,3 ml) Luft mit den Glastropfen.
   4. Halten Sie die Position für 60 s und ermöglichen Sie die Mauswiederherstellung, wie oben beschrieben.
2. Symmetrische bilaterale IB-Verwaltung
   1. Führen Sie die Schritte 5.3.1.1–5.3.1.8 (rechte Lunge) und die Schritte 5.3.2.1–5.3.2.8 (linke Lunge) aus.
   2. Verabreichen Sie auf jeder Seite der Lunge gleiche Volumina (30 l) von 0,05 % FITC-Dextran (oder einem Versuchsmittel).
3. Dosisbereinigte bilaterale IB-Administration
   1. Führen Sie Schritt 5.3.1.1–5.3.1.8 (rechte Lunge) und Schritte 5.3.2.1–5.3.2.8 (linke Lunge) aus.
   2. Verabreichen Sie ein größeres Volumen (40 l) von 0,05 % FITC-Dextran an die größere rechte Lunge und ein kleineres Volumen (20 l) von 0,05 % FITC-Dextran auf die kleinere linke Lunge. Anstelle von FITC-dextran kann ein Versuchsmittel verabreicht werden.

7. Verwendung der dosisangepassten IB-Verabreichung zur Verbesserung der Symmetrie der Einzeldosis-Bleomycin (BLM)-induzierte Lungenverletzung

1. BLM-Verwaltungsgruppen
   1. Dosisbereinigtes IB-BLM (1,2 mg/kg, siehe Materialtabelle)Verwaltungsgruppe: 60 l (20 l für die linke Lunge bzw. 40 l für die rechte Lunge) der BLM-Lösung wurden an Mäuse geliefert (n = 5). Die Steuerelemente (n = 5) erhielten ähnliche Mengen an Saline.
      HINWEIS: Siehe die Schritte 5.3.1 und 5.3.2.
   2. IT-Verwaltungsgruppe: 60 L BLM-Lösung wurden mäusen mit IT-Verwaltungstechniken geliefert.
      HINWEIS: Siehe die Schritte 6.1.1–6.1.4.
2. Messung der Lungenfunktion
   1. An Tag 21 nach BLM oder Saline Mäuse mit einer intraperitonealen (IP) Injektion von Ketamin (160 mg/kg) und Xylazin (32 mg/kg) ansien.
   2. Nach der Bestätigung der Tiefe der Anästhesie durch Pfoten/Zehen-Pinch, führen Sie eine Tracheostomie mit einer 18 G Kanüle (siehe Tabelle der Materialien).
   3. Verbinden Sie Mäuse mit dem Beatmungsgerät und messen Sie die Atemmechanik wie zuvor beschrieben⁴.
3. Erfassung und Verarbeitung von Lungengewebe
   1. Nach Messung der Lungenmechanik, euthanisieren Sie die anästhesierten Mäuse durch Herzpunktion.
   2. Öffnen Sie die Brustwand und induzieren Sie bilaterale Pneumothoraces.
   3. Aufblasen der Lunge mit 1% niedriger Schmelzagarose (40 °C)⁵ in PBS bei einem konstanten Druck (42 cm H₂O).
   4. Vier bis fünf Teile der Lunge entlang der langen Achse quer schneiden, in 10% Formalin fixieren und in Paraffin einbetten.
   5. Schneiden Sie 5 'm Abschnitte und Flecken mit Masson s trichrome, um Kollagenablagerung zu visualisieren.

8 Nachverfahrenspflege

1. Am Ende der Überlebensverfahren, legen Sie das Tier auf eine wärmende Decke, bis es das Bewusstsein wiedererlangt. Die Wiederherstellung ist in der Regel innerhalb von 2 min abgeschlossen.

Ergebnisse

Selektive IB-Intubation zielt auf bestimmte Lappen (rechte Lunge) oder Basilarsegmente (linke Lunge).

Die IB-Verabreichung von EBD in die rechte Lunge wurde wie in Abschnitt 5.1 beschrieben durchgeführt. Nach Abschluss des Experiments wurde den Mäusen eine tödliche Dosis intraperitonealen Ketamins/Xylazins verabreicht, und die Lunge wurde geerntet, um die EBD-Verteilung zu demonstrieren (Abbildung

Diskussion

Lungenverletzungen wurden bei Nagetieren mit Hilfe der IT-Verabreichung von schädigenden Wirkstoffen wie BLM⁶klassisch modelliert. Eine solche IT-Administration führt jedoch nur zu lückenhaften Verletzungen, was den nicht gezielten Charakter der Lungenabgabe mit diesem Ansatz widerspiegelt⁷. Diese Einschränkungen der Modellierung von Lungenverletzungen sind lehrreiche Herausforderungen, vor denen bei dem Versuch, die IT-Lieferung von nicht-verletzenden experimentellen W...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine