Amministrazione intrabronchiale diretta per migliorare la deposizione selettiva dell'agente all'interno del polmone del mouse

Riepilogo

La somministrazione intratracheale (IT) di agenti sperimentali nei topi spesso si traduce in consegna asimmetrica ai polmoni distali.  In questa relazione, descriviamo un approccio intrabronchiale diretto (IB) per cannulare ogni polmone in topi viventi non chirurgici.  Questo approccio può essere utilizzato per somministrare selettivamente gli agenti a un polmone o può essere adattato per migliorare la somministrazione simmetrica dell'agente a entrambi i polmoni.

Abstract

La somministrazione intratracheale (IT) di agenti sperimentali è una tecnica essenziale nei modelli murini di malattie polmonari diffuse, come la fibrosi polmonare indotta dalla bleomicina.  Tuttavia, la distribuzione di agenti somministrati intratrachealmente al polmone del topo distale è spesso asimmetrica, con concentrazioni parenilmale polmonari aumentate nel polmone sinistro inferiore (ma ugualmente accessibile) del polmone sinistro del topo.  Descritto in questo rapporto è un nuovo approccio intrabronchiale (IB) per cannulare i polmoni sinistro e/o destro dei topi viventi in modo non chirurgico.  È inoltre dimostrato come questo approccio possa essere utilizzato per somministrare in modo selettivo gli agenti a un polmone o adattato(tramite somministrazione IB regolata mediante dose) per migliorare la simmetria sinistra-destra della somministrazione polmonare di agenti sperimentali, migliorando così i modelli di diffusione polmonare come la fibrosi polmonare indotta dalla bleomicina.

Introduzione

La somministrazione polmonare diretta di agenti sperimentali nei topi consente lo studio delle risposte immunitarie polmonari, delle lesioni polmonari acute e della fibrosi polmonare. La somministrazione polmonare diretta viene in genere eseguita tramite instillazione intratratracheale (IT), come descritto in precedenza^1,2,3. Tuttavia, questo approccio non è selettivo, interessando entrambi i polmoni in modo non mirato e spesso asimmetrico.  La modellazione sperimentale della lesione polmonare può beneficiare della capacità di colpire in modo selettivo un polmone specifico, consentendo l'uso del polmone contralaterale come controllo. Al contrario, una modellazione accurata delle malattie polmonari diffuse umane beneficia della distribuzione simmetrica di agenti sperimentali al parenchyma polmonare bilaterale.

L'obiettivo generale di questa relazione è descrivere un metodo per la consegna selettiva di agenti sperimentali al polmone sinistro o destro di un mouse (Figura 1). Questo approccio di somministrazione intrabronchiale (IB) consente il trattamento unilaterale di un polmone di topo e può essere facilmente adattato per garantire la consegna equa di un agente ai bronchi bispoli bisbici bilaterali. Utilizzando la somministrazione IB per fornire dosi più grandi di agenti sperimentali al polmone destro più grande e volumi più piccoli al polmone sinistro più piccolo (cioè la somministrazione IB regolata dalla dose), dimostrato nella presente relazione è un miglioramento dell'omogeneità delle pulmonie l'ottimizzazione del modello di lesione polmonare diffusa nei topi. Come tale, questa relazione può avere valore per gli investigatori che cercano di somministrare unilateralmente agenti sperimentali ai topi o migliorare la simmetria della deposizione di farmaci in entrambi i polmoni.

Protocollo

Tutti i protocolli animali sono stati approvati dall'Università del Colorado Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutte le procedure descritte di seguito (sezioni 4-7) sono state ottimizzate utilizzando topi C57BL/6 maschi e femmine. Questo approccio è stato convalidato utilizzando topi che vanno da 19 a 40 g di peso corporeo.

1. Creazione della piattaforma per l'amministrazione IB

1. Piegare il bookend dall'angolo originale di 90 gradi tra l'ala basale e l'ala in piedi a 70 gradi (Figura2A).
2. Forare un foro nella parte superiore centrale dell'ala in piedi del bookend metallico (Figura 2A).
3. Forare un foro di dimensioni identiche alla posizione corrispondente della scheda di plastica. Forare due fori più piccoli in modo inferiore e laterale (Figura 2A).
4. Drappo una sutura di seta 4:0 tra questi piccoli fori nella scheda di plastica (Figura 2A).
5. Posizionare il gancio e il nastro a loop sul bordo della scheda di plastica (Figura 2A).
6. Assemblare la scheda di plastica al bookend metallico con la vite (Figura 2B). Assicurarsi che il dado di vite sia sufficientemente stretto per tenere la scheda in posizione, consentendo al contempo la regolazione dell'angolo, se necessario.
7. Assicurarsi che la rotazione della scheda di plastica sia in senso orario e antiorario, muovendosi liberamente.
   NOTA: il movimento in senso orario è rappresentato in questo rapporto come una rotazione di gradi ( ) e in senso antiorario è rappresentato come una rotazione di gradi (-).
8. Utilizzare un goniometro angolare per posizionare la tavola di plastica a 30, 86 , -30 e -74 e contrassegnarli rispettivamente sul bookend.

2. Creazione di cateteri estesi per l'amministrazione degli agenti IB

1. Effettuare un taglio ad angolo retto con una lama affilata sulla punta di un catetere originale da 22 G (25 mm, vedere Tabella deimateriali) (Figura 3, passo 1a).
2. Spalanca la punta dell'altro catetere originale (25 mm) con la lama, quindi taglia ad angolo retto dall'hub (Figura3, passaggio 1b).
3. Incollare i due cateteri alle estremità smussate con un angolo leggermente inferiore a 180 gradi (Figura3, passaggio 2).
4. Smussare la punta smussata fondendosi con un cavolo a bassa temperatura (vedere Tabella dei materiali).
5. Polacco il catetere esteso con carta vetrata di dimensioni "0" sull'area incollata e la punta snella del catetere esteso (Figura3, passo 3).
6. Segnare sul catetere esteso con colori diversi a 25 mm, 30 mm e 35 mm (Figura3, passaggio 3).
7. Indicare il lato svelto del catetere esteso etichettandoil mozzo con il marcatore.
8. Risciacquare il catetere esteso con acqua DI, seguendo il lavaggio all'interno del catetere con 70% di etanolo. Asciugare il catetere.
9. Sterilizzare con luce UV per 10 min prima dell'uso.

3. Preparazione pre-procedura

1. Rendere tutti gli agenti somministrati in una cappa di sicurezza biologica in una tecnica sterile.
2. Pulire il posto di lavoro con il 70% di etanolo.
3. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con 70% etanolo.
4. Fissare la base della piattaforma di lavoro alla panca immediatamente di fronte al ricercatore apponendo i morsetti a C sull'ala basale del bookend.
5. Generare diversi spirometri di fortuna, che sono dispositivi che consentiranno il rilevamento del flusso d'aria di marea nei topi. In breve, depositare 60 L di salina sterilizzata in una siringa da 1 mL (rimosso) con una punta di carico gel.
   NOTA: Il calo depositato della salina occinga la canna e si muove verso l'alto e verso il basso quando esposto alla ventilazione delle maree³.
6. Attacca liberamente il mozzo di un catetere esteso da 22 G allo spirometro improvvisato.
7. Posizionare ciascuno dei contagocce di vetro su ogni lato della piattaforma per facilitare l'accesso.
8. Collegare la camera di induzione dell'isoflurano alla macchina per l'anestesia dei roditori (cfr. tabella deimateriali) in un armadietto di sicurezza biologico compatibile con l'isoflurane.

4. Approccio di intubazione IT non operativo

1. Anestesizzare un topo C57BL/6 (maschio o femmina, 8-10 settimane, 25 g) con ossigeno (2 L/min) e 5% isoflurane (vedi Tabella dei materiali) in una camera di induzione per 4 min.
2. Aspirare l'agente sperimentale da consegnare (ad esempio, colorante blu Evans o FITC-dextran, come illustrato nella Figura 4) in due pipette, quindi posizionarli su ciascun lato della piattaforma durante la sedazione.
3. Assicurarsi una frequenza respiratoria di circa 24-30 respiri/min prima di rimuovere il mouse dalla camera di induzione dell'anestesia.
   NOTA: L'anestesia di Isoflurane dura in genere per 4 min, sufficiente per tutte le procedure IB. Se l'operatore non è esperto con la tecnica, la chetamina/xylazina (80 mg/kg e 10 mg/kg intraperitonealmente, vedere Tabella dei materiali) può essere utilizzato per un'anestesia più prolungata.
4. Sospendere il mouse con i suoi incisivi sulla linea di sutura drappeggiata in posizione supina. Fissare il mouse con due o tre pezzi di gancio e far scorrere il nastro liberamente, evitando la limitazione della ventilazione.
5. Accendere l'illuminatore a fibra ottica LED (vedere Tabella dei materiali, Figura 2C).
6. Posizionare l'operatore dietro la piattaforma (dorsale al mouse).
7. Orientare il collo d'oca dell'illuminatore in modo che illumini l'area della lassa attraverso la pelle. La distanza tra il mouse e la sorgente luminosa è compresa tra 2 e 3 cm (Figura 2C).
8. Confermare la profondità dell'anestesia con un pizzico di dita/zampa prima di eseguire tutte le procedure riportate di seguito.
9. Tenere le pinze sterili con la mano dominante, quindi disegnare la lingua dalla cavità orale con le pinze.
10. Tenere il depressore sterile con la mano non dominante, quindi appiattire la radice della lingua con il depressore per esporre ampiamente l'oropharynx. Le pinze possono quindi essere rilasciate, liberando la mano dominante.
11. Utilizzare la mano dominante per intubare il catetere esteso nella trachea attraverso la cavità orale (Figura 2C).
12. Confermare il posizionamento osservando se la bolla nella siringa si muove su e giù ad ogni respiro.
13. Ulteriori dettagli sull'intubazione IT sono stati pubblicati in precedenza³. Il tempo totale di procedura, esclusa l'anestesia, dura 10-15 s per un operatore ben addestrato.

5. Approcci di intubazione e consegna IB non operativi

1. Approccio IB alla cannulazione selettiva del polmone destro discrepare
   1. Dopo l'esecuzione della canonazione IT (passaggio 4.11), ruotare la scheda di plastica di 30 gradi (Figura4A).
   2. Tenere il mozzo del catetere e guidarlo in modo naturale in parallelo alla linea mediana del mouse, estendendolo alle profondità basate sul peso, come descritto nella Tabella 1.
      NOTA: La resistenza a queste profondità deve essere notato. A questo punto, il mouse diventerà leggermente tachipigico, come spiegato nei risultati rappresentativi. Per un operatore esperto, circa il 90% dei tentativi cannula con successo il polmone destro (con tachipnea notato).
   3. Consegnare 20 - L di 0,3% di colorante blu Evans (EBD, vedi Tabella dei materiali) con una punta di carico gel.
   4. Distribuisci 1–2 aliquote (0,1 mL ciascuna) di aria utilizzando il contagocce di vetro.
      NOTA: Questo garantisce lo sgombero della soluzione Residua EBD (o agenti sperimentali) dall'interno del catetere.
   5. Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s.
   6. Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista conoscenza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
2. Approccio IB alla canonazione segmentale selettiva del polmone sinistro distale
   1. Dopo aver eseguito la canonulazione IT (passaggio 4.11), ruotare la scheda di plastica di -74 gradi (Figura4B).
   2. Tenere il mozzo del catetere e esercitare una leggera pressione per far avanzare il catetere nel bronco del tronco sinistro, posizionando una pressione modesta sia verso il basso (90o) che verso il bookend. Alle profondità indicate nella tabella1, l'operatore dovrebbe notare resistenza in quanto i segmenti inferiori del polmone sinistro sono impegnati. Se si verifica la tachipnea, ritirare il catetere nella posizione 20-25 mm e riprovare.
   3. Dopo aver cannulato i segmenti polmonari inferiori a sinistra, è necessario un cambiamento di posizione per consentire l'assistenza gravitazionale per la somministrazione dell'agente. Ruotare la scheda di plastica di -30 gradi (Figura4B).
   4. Consegnare 40 -L dello 0,3% EBD con una punta di carico gel.
      NOTA: è possibile fornire un volume maggiore di agente perché il polmone sinistro ha un solo lobo.
   5. Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando i contagocce di vetro.
      NOTA: Questo garantisce l'autorizzazione di qualsiasi EBD residuo (o agenti sperimentali) dall'interno del catetere.
   6. Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s.
   7. Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista conoscenza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
3. Adattamento della somministrazione IB per consentire la consegna dell'agente alla totalità del polmone sinistro o destro
   NOTA: Se l'operatore cerca di consegnare gli agenti non a uno specifico lobo polmonare destro o a un segmento polmonare sinistro, ma piuttosto all'intero polmone (polmone destro o sinistro), il catetere deve essere leggermente ritirato nei rispettivi bronchi del tronco principale, come indicato di seguito.
   1. Somministrazione polmonare a destra
      1. Dopo il passaggio 4.11, ruotare la scheda di plastica di plastica di 30 gradi (Figura5A).
      2. Tenere il mozzo del catetere e guidarlo naturalmente in parallelo alla linea mediana del topo, raggiungendola alle profondità necessarie per la canonazione della locanalena lato destro (Tabella1).
      3. Confermare l'aspetto del segno di tachipnea.
      4. Ruotare il mouse di -74 per consentire l'assistenza alla gravità per la consegna dell'agente (Figura5B).
      5. Ritirare il catetere in una posizione corrispondente al decollo del bronco tronco destro (Tabella 1). Assicurarsi che lo svelto del catetere sia rivolto verso il basso (Figura 5B).
      6. Consegnate al polmone destro 30 - L dello 0,3% con una punta di carico gel.
      7. Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando un contagocce di vetro.
      8. Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s. Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista coscienza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.
   2. L'intera somministrazione polmonare sinistra
      1. Dopo il passaggio 4.11, ruotare la scheda di plastica di -74 gradi (Figura6A). In alternativa, la rotazione può avvenire dopo la fase 5.3.1.8 ritirando il catetere alla trachea, consentendo l'amministrazione bilaterale degli agenti IB.
      2. Tenere il mozzo del catetere e esercitare una leggera pressione per far avanzare il catetere nel catetere del tronco sinistro, posizionando una pressione modesta sia verso il basso (90o) che verso il bookend. La profondità dell'intubazione è guidata dalla Tabella 1.
      3. Confermare il segno nessuna tachipnea.
      4. Ruotare il topo di 86 gradi per consentire l'assistenza alla gravità con l'amministrazione dell'agente.
      5. Ritirare il catetere al bronco principale sinistro (le stesse distanze del polmone destro sono sufficienti, Tabella 1) e ruotare la svelatura delle facce del catetere verso il basso (Figura6B).
      6. Consegnate al polmone sinistro 30 - L dello 0,3% con una punta di carico gel.
      7. Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando un contagocce di vetro.
      8. Ritirare il catetere, quindi mantenere la posizione del mouse per 30 s. Posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista coscienza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.

6. Uso di approcci sequenziali di cannolazione IB per fornire volumi di agente regolati dalla dose ad ogni polmone

1. Gruppo di amministrazione IT
   1. Eseguire la canonazione IT come descritto nei passaggi da 4.1 a 4.11.
   2. Consegnare 60 - L di 0,05% FITC-dextran (vedi Tabella dei materiali) con una punta di carico gel ( Figura1B).
   3. Distribuiscono 1–2 aliquote (0,1–0,3 mL ciascuna) di aria utilizzando i contagocce di vetro.
   4. Mantenere la posizione per 60 s e consentire il recupero del mouse come descritto sopra.
2. Amministrazione IB bilaterale simmetrica
   1. Eseguire i passaggi 5.3.1.1–5.3.1.8 (polmone destro) e i passi 5.3.2.1–5.3.2.8 (polmone sinistro).
   2. Amministrare gli stessi volumi (30 gradi centigradi) di 0,05% FITC-dextran (o un agente sperimentale) su ciascun lato del polmone.
3. Somministrazione IB bilaterale regolata in base alla dose
   1. Eseguire il passaggio 5.3.1.1–5.3.1.8 (polmone destro) e i passi 5.3.2.1–5.3.2.8 (polmone sinistro).
   2. Amministrare al polmone destro un volume maggiore (40 %) di 0,05% FITC-dextran al polmone destro maggiore e un volume minore (20) dello 0,05% FITC-dextran al polmone sinistro più piccolo. Al posto di FITC-dextran, un agente sperimentale può essere somministrato.

7. Uso della somministrazione IB regolata da dose per migliorare la simmetria delle lesioni polmonari indotte da bleomycina a dose singola (BLM)

1. Gruppi amministrativi BLM
   1. Il gruppo amministrativo IB-BLM (1,2 mg/kg, tabella deimateriali) regolato in base alla dose: 60 (20 -L per il polmone sinistro e 40 -L per il polmone destro, rispettivamente) della soluzione BLM della soluzione BLM (n . 5). I controlli (n - 5) hanno ricevuto volumi simili di salina.
      NOTA: fare riferimento ai passaggi 5.3.1 e 5.3.2.
   2. Gruppo di amministrazione IT: 60 unità BLM sono state consegnate ai topi con tecniche di amministrazione IT.
      NOTA: fare riferimento ai passaggi 6.1.1– 6.1.4.
2. Misurazione della funzione polmonare
   1. Il giorno 21 dopo BLM o salina, anestesizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale (IP) di ketamina (160 mg/kg) e xylazina (32 mg/kg).
   2. Dopo aver confermato la profondità di anestesia da zampa / toe pizzico, eseguire una tracheostomia con un 18 G cannula (vedi Tabella dei Materiali).
   3. Collegare i topi al ventilatore e misurare la meccanica respiratoria come descritto in precedenza⁴.
3. Raccolta e lavorazione dei tessuti polmonari
   1. Dopo la misurazione della meccanica polmonare, eutanasia i topi anestesiti mediante puntura cardiaca.
   2. Aprire la parete toracica e indurre pneumothoraces bilaterali.
   3. Gonfiare i polmoni con agarose a bassa fusione dell'1% (40 gradi centigradi)⁵ in PBS ad una pressione costante (42 cm H₂O).
   4. Tagliare quattro o cinque pezzi del polmone lungo l'asse lungo trasversalmente, fissare in formalina al 10% e incorporare in paraffina.
   5. Tagliare 5 sezioni di m e macchiare con il tricromo di Masson per visualizzare la deposizione di collagene.

8 Cura post-procedurale

1. Alla fine delle procedure di sopravvivenza, posizionare l'animale su una coperta riscaldante fino a quando non riacquista conoscenza. Il recupero è in genere completo entro 2 min.

Risultati

L'intubazione IB selettiva è destinata a lobi specifici (polmone destro) o segmenti basilari (polmone sinistro).

La somministrazione IB di EBD al polmone destro è stata eseguita come descritto nella sezione 5.1. Dopo il completamento dell'esperimento, ai topi è stata somministrata una dose letale di ketamina/xylazina intraperitoneale, e i polmoni sono stati raccolti per la dimostrazione della distribuzione EB...

Discussione

La lesione polmonare è stata modellata in modo classico nei roditori utilizzando la somministrazione IT di agenti dannosi come BLM⁶. Tale amministrazione IT, tuttavia, porta solo a lesioni irregolari, riflettendo la natura non mirata della consegna polmonare con questo approccio⁷. Queste limitazioni della modellazione delle lesioni polmonari sono sfide istruttive affrontate quando si tenta la consegna IT di agenti sperimentali non dannosi, come farmaci, siRNA o terapie cel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G shielded IV Catheter	BD	381423
Bleomycin	Enzo life sciences	BML-AP302-0010
Compact Mini rodent anesthesia machine	DRE Veterinary	9280
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129
FITC-dextran	Sigma-Aldrich	FD150
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC
LED-30W Fiber Optic Dual Gooseneck Lights Microscope Illuminator	AmScope	LED-30W
Low temperature cautery with fine tip	Bovie	AA02
Precisionglide needle, 18G x 1"	BD	305195	Beveled tip, 12 mm in length
Xylazine	AKORN	NDC 59399-110-20
Zatamine	VetOne	NDC 13985-702-10	Ketamine