Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف العزلة والذبح من الغضروف الشرح من الركبتين البقري. يوفر هذا الأسلوب أداه سهله ويمكن الوصول اليها لوصف التغيرات في الانسجه استجابه للمؤثرات البيولوجية أو العلاجات الجديدة التي تستهدف المفصل.

Abstract

تغطي أنظمه الثقافة المجرية السابقة مجموعه واسعه من التجارب المخصصة لدراسة الانسجه والوظائف الخلوية في بيئة أصليه. الغضروف هو نسيج فريد من نوعه مهم للوظيفة المناسبة لمفصل الزليلي ويتكون من مصفوفة كثيفه خارج الخلية (ECM) ، غنيه في بروتيجليكان والكولاجين من النوع الثاني. غضروفي هي نوع الخلية الوحيدة الموجودة داخل الغضروف وواسعة الانتشار ومنخفضه نسبيا في العدد. المحفزات الخارجية المتغيرة والإشارات الخلوية يمكن ان تؤدي إلى تغييرات في تكوين ECM والتدهور ، والتي هي السمات المرضية الهامه في امراض مثل هشاشة العظام (الزراعة العضوية) والتهاب المفاصل الروماتويدي.

نماذج الغضروف الفيفو السابقة تسمح 1) التنميط من التعديلات غضروفي توسط من دوران الانسجه الغضروف, 2) تصور الغضروف تكوين ECM, و 3) غضروفي أعاده ترتيب مباشره في الانسجه. التنميط هذه التعديلات استجابه لمحفزات أو العلاجات ذات اهميه عاليه في جوانب مختلفه من البيولوجيا الغضروف ، وتكمله التجارب في المختبر في الغضروفي المعزولة ، أو نماذج أكثر تعقيدا في الكائنات الحية حيث الظروف التجريبية أكثر صعوبة للسيطرة عليها.

يقدم المفسرون الغضروف طريقه قابله للوصول بسهوله لتقييم أعاده عرض الانسجه في الغضروف ECM في الإعدادات التي يمكن التحكم فيها. هنا ، ونحن وصف بروتوكول لعزل والذبح الحية الغضروف البقري الشرح. يستخدم الأسلوب الانسجه من الركبة البقري ، والتي يمكن الوصول اليها بسهوله من المجزرة المحلية. ويمكن تحليل كل من الشرح والمتوسطة ثقافة مكيفه للتحقيق في دوران الانسجه ، وتكوين ECM ، ووظيفة غضروفي ، التالي التنميط ECM التحوير.

Introduction

غضروفي إنتاج وصيانة مصفوفة الغضروف. من أجل دراسة بيولوجيا غضروفي وكيف يتفاعلون مع المحفزات الخارجية ، فمن الضروري استجوابهم في بيئتهم الاصليه1،2. دراسة دوران الانسجه الغضروف مهم لزيادة فهم أليات الكامنة في الامراض المشتركة مثل الزراعة العضوية ، وهو المرض الذي لا يوجد حاليا اي مرض تعديل العلاج. التالي ، هناك حاجه كبيره لتحسين نماذج الترجمة2.

وصف الجسم الحيوي السابق للآثار الخلوية والانسجه ضروري لتكمله النماذج السريرية الأخرى ، سواء في المختبر ، مثل ثقافات غضروفي أحاديه الطبقة ، وفي الجسم الآخر ، مثل نماذج الزراعة العضوية المستحثة بالجراحة أو نموذج التهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين المناعي الذاتي (CIA ). وقد أبرزت العديد من الدراسات الاختلافات بين كيفيه تصرف الخلايا في الثقافات أحاديه الطبقة 2d وهياكل 3d أو في الانسجه الاصليه3,4. تعتمد العديد من الخلايا في الطبقات ثنائيه الابعاد مورفولوجيس غير طبيعيه ، بما في ذلك الاختلافات في قطبيه الخلية ومرفق الانسجه ، مما يؤدي إلى اختلافات بصريه ووظيفية في الخلايا داخل الانسجه الاصليه5. الاختلافات واضحة أيضا في وظائف الخلايا ، والتي قد تحول التعبير البروتين ، مما يؤدي إلى تغيير جذري أنماط التمايز ، واليه التنظيمية ، ووظائف الخلية5،6،7 ،8.

الغضروف ECM يتكون أساسا من النوع الثاني الكولاجين توفير اطار مصفوفة ، و aggrecan ، بروتيجليكان ان يساعد علي الاحتفاظ بالسوائل داخل الانسجه. جزيئات مصفوفة أخرى مثل الكولاجين من النوع الرابع ، السادس ، التاسع ، العاشر ، الحادي عشر ، الثاني عشر ، الفيبرونكتين ، الغضروف بروتين القلة (COMP) ، biglycan ، ديكور ، و perlecan هي أيضا الحاضر9.

في حين ان الحساسية من الزراعة العضوية لا تزال غير واضحة10,11, ويعتقد ان ظهور المرض بسبب الاختلالات في دوران الانسجه وعمليات الإصلاح12,13. تدهور الغضروف المفصلي هو السمة المميزة للزراعة العضوية. الغضروف المقيم غضروفي أو الخلايا في الانسجه المحيطة بها زيادة إطلاقها من السايتوكينات, تحفيز إنتاج مرتفعه من بروتينيه مثل مصفوفة ميتالبروتينيساسات (MMPs) و aggrecanases, التي تزيد من تدهور الغضروف ECM 14-ويؤدي هذا التدهور إلى الإفراج عن شظايا البروتين الصغيرة الفريدة التي يطلق عليها الجديدة ، والتي يمكن قياسها كميا في المصل أو البول أو الثقافة المتوسطة15. عند تشكيل ونضوج الكولاجين ، يتم أيضا الإفراج عن ما يسمي الشظايا. ويمكن قياس هذه الكمية كمقياس لإنتاج المصفوفة16.

والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج الغضروف الفيفو السابقة للمقارنة بين تاثير التحفيز و/أو العلاج المخدرات علي دوران الانسجه ECM. يتم موجز دوران الغضروف عن طريق قياس المصفوفات المشتقة الجديدة العلامات الحيوية مباشره في الوسط ثقافة مكيفه باستخدام ELISA: AGNx1 (تعكس النشاط aggrecanase) ، C2M (تعكس النشاط التناسبية مصفوفة) ، و ProC2 (يعكس نوع الثاني الكولاجين تشكيل). يمكن التحقق من النتائج عن طريق تلطيخ النسيجية من ECM ، والتي تصور أيضا تنظيم غضروفي في الشرح الفردية. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لاختبار تاثير العلاجات الجديدة علي وظيفة غضروفي ودوران الغضروف في المحتوي. وقد استخدم عدد من الدراسات النازعون الغضروف لوصف العمليات البيولوجية أو تاثير التدخل علي المفسرين التحدي السايسيسين باستخدام النسيجية الكمية أو النهج مناعي ، mRNA ، والتعبير عن البروتين ، أو بروتيميكس2 و17و18. ومع ذلك ، فان هذه البروتوكولات تقع خارج نطاق المخطوطة الحالية.

Protocol

1. عزل الانسجه

  1. مصادر الانسجه
    1. أداء القسم بأكمله مصادر الانسجه خارج غطاء محرك التيار الصفحي في بيئة معقمه.
    2. من المسلخ المحلي ، احصل علي مفصل الركبة البقري الطازج بأكمله من العجول بين 1.5 و 2 سنه من العمر.
    3. تشريح الركبة برفق عن طريق أزاله اللحم الزائد أولا ، والكشف عن المفاصل ، والغضروف المفصلي ، والأوتار ، والغشاء الزليلي. قطع الأوتار والغشاء الزليلي ، مما يسمح لمفصل لdismember. أزاله الغضروف المفصلي للكشف عن الملتصقة الفخذ.
    4. عزل المفسرين من المنطقة الحاملة للمخروطيات الفخذية باستخدام الخزعة بحجم 3 مم وإطلاقها من السطح المفصلي بالقطع بالتوازي مع مشرط القرب من عظمه الغضروف الفقري قدر الإمكان. وينبغي ان الهيكل الصلب للعظام تحت الغضروف ضمان ان المفسرين لا تحتوي علي مصفوفة متكلسة. السعي لشرح مع ارتفاع موحد.
    5. علي الفور تخزين ومزج الشرح في DMEM/F12-جلوساماكس + 1 ٪ P/S الثقافة المتوسطة في أنبوب 50 mL أو طبق بيتري. لا تخلط الشرح من ركبتي البقرة المختلفتين ولكن تبقي منفصلة لكل دراسة.
  2. خياطه الانسجه
    1. نقل التفسيرات إلى لوحه معقمه 96 جيدا في غطاء التيار الرقائقي.
    2. اغسل الشرح 3 مرات في الثقافة المتوسطة أو تلفزيوني والثقافة لهم في 200 μL من الثقافة المتوسطة في بئر حتى بداية التجربة. استخدم فتره غسيل لمده يوم واحد لمزامنة النشاط الخلوي لخزعة والإفراج الحيوي السلبي.
    3. ثقافة الشرح حتى 10 أسابيع في 37 درجه مئوية حاضنه مع 5 ٪ CO2. وضع كل النسخ المتماثلة داخل كل مجموعه قطريا في لوحه الثقافة للتقليل من التباين الناجم عن التبخر. ان يزيد يتفادى تبخر من ال [سوبرننت], أضفت [ببس] إلى الآبار خارجيه من الثقافة لوحه.

2. علاج الغضروف البقري المفسر وتقييم النشاط الأيضي

  1. ثقافة التغيير المتوسط والعلاج
    1. تغيير المتوسطة الثقافية كل 2-3 يوما في غطاء التيار الرقائقي.
    2. إذا كان تطبيق اي علاج ، واعداد هذه قبل تغيير المتوسطة. اعداد العلاجات للتركيز المطلوبين في الآبار المفسرة عن طريق التخفيف في الوسط الثقافي.
    3. برفق أزاله ماده طافي من كل بئر ونقله إلى لوحه جديده 96 جيدا. تخزين ماده طافي مع ختم الشريط في − 20 درجه مئوية لتحليل المؤشرات الحيوية لدوران الانسجه والتعبير عن البروتين.
    4. فورا أضافه 200 μL من الثقافة الطازجة المتوسطة أو العلاج في البئر. لا تدع الشرح يجف خلال التغيير المتوسط والتاكد من ان جميع المفسرين مغمورة تماما في الوسط الجديد.
  2. تلطيخ اللازوردية
    1. قياس النشاط الأيضي مره واحده أسبوعيا كقياس غير مباشر لبقاء الخلية. يعد اختبار أعاده البيع طريقه سهله لتقييم ما إذا كان النشاط الأيضي لمفسري الشرح يتدهور لشرح فردي بسبب موت الخلايا أو التغيرات الخلوية. الشرح في الثقافة المتوسطة وحدها لديها مستقره نسبيا resلازوردي القراءة طوال فتره التجربة.
    2. اصنع محلولا من الثقافة المتوسطة مع 10% من أعاده البيع.
    3. حصاد ماده طافي كما هو موضح في الخطوة 2-1-3.
    4. تزج الشرح في 10 ٪ resلازوردي الحل ل 3 ح في 37 درجه مئوية أو حتى السوبر بدوره الأرجواني. وتشمل 4 الآبار دون الشرح كعناصر التحكم في الخلفية.
    5. نقل التحكم المشروط والخلفية resلازوردي الحل للوحه عيار مكروي السوداء وقياس مضان في 540 nm الاثاره/590 نانومتر الانبعاثات.
    6. يغسل جيدا 3 مرات في الثقافة المتوسطة أو التلفزيونية وتحت دمج المفسرين في غسل المتوسطة لمده 5-10 دقيقه للسماح لل resلازوردي لمنتشر تماما خارج. أضافه المتوسطة الثقافة الجديدة أو العلاجات إذا ما استخدمت.

3-الإنهاء والتثبيت وتخزين العينات

  1. إنهاء فتره الذبح
    1. قياس النشاط الأيضي كما هو موضح في الخطوة 2.2. أضافه 200 μL من تلفزيوني لكل بئر.
  2. التثبيت والتخزين
    1. أزاله تلفزيوني ، أضافه 200 μL من الفورمالديهايد في بئر ، وترك ل 2 ح في درجه حرارة الغرفة.
    2. التخلص من الفورمالديهايد وأضافه 200 μL من تلفزيوني لكل بئر. تغطيه لوحه مع ختم الشريط ، وتخزين في 4 درجه مئوية للتحليل الكيميائي النسيجي. نوصي باجراء التحليل الكيميائي النسيجي في غضون 3 أشهر.

4. دوران الانسجه البيولوجية (اليسا)

  1. التنافسية غير المباشرة ELISAs
    1. معطف الصفيحة العقديه مع المقايسة المحددة الهدف-الببتيد المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (100 μL لكل بئر) لمده 30 دقيقه في 20 درجه مئوية.
    2. يغسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل القياسية وأضافه عينه-supernatant (20 μL لكل بئر) مع الأجسام المضادة الاحاديه الاوليه ضد الهدف المقايسة-الببتيد المخفف 1:93.3 ل ProC2 و 1:100 في المخزن المؤقت لمقايسة AGNx1 (100 μL لكل بئر) واحتضان ل 2 ح في 20 درجه مئوية مع اهتزاز ل ProC2 و 3 ح في 20 درجه مئوية ل AGNx1.
      ملاحظه: يتم أخذ وحده التخزين العينة مباشره من لوحات ماده طافي المخزنة. إذا كان التركيز المقاسه خارج نطاق قياس المقايسة ، تمييع ماده طافي في لوحه التخفيف القاع في الحاجز التلفزيوني أو الفحص العازلة.
    3. غسل 5 مرات مع العازلة القياسية الغسيل واحتضان مع الأجسام المضادة المسمي البيروكسيديز الثانوية المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (100 μL لكل بئر) ل 1 ح في 20 درجه مئوية.
    4. يغسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل القياسية واحتضان مع الاهتزاز لمده 15 دقيقه في الظلام عند 20 درجه مئوية مع tetramايثيل البنزيدين (TMB) كركيزة البيروكسيديز (100 μL لكل بئر).
    5. إنهاء رد الفعل مع الحل وقف القياسية ، 0.1 M H2SO4 (100 μl لكل بئر).
    6. قراءه رد الفعل اللوني في الامتصاص 450 nm باستخدام الامتصاص المرجعي في 650 nm علي قارئ لوحه المختبر القياسية.
  2. اليساس التنافسية المباشرة لقياس دوران الانسجه الغضروف في سوبرناتانت
    ملاحظه: هذا ثبت قيمه C2M.
    1. معطف العقديات-لوحه مع محدده الهدف المقايسة الحيوية-الببتيد المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (100 μL لكل بئر) لمده 30 دقيقه في 20 درجه مئوية.
    2. غسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل وأضافه عينه-supernatant جنبا إلى جنب مع 100 μL من البيروكسيديز المسمي الأجسام المضادة الاحاديه ضد الهدف المقايسة-الببتيد المخفف 1:100 في المخزن المؤقت المقايسة (20 μL لكل بئر). احتضان لمده 20 ساعة في 2 – 8 درجه مئوية مع الاهتزاز.
      ملاحظه: يتم أخذ وحده التخزين العينة مباشره من لوحات ماده طافي المخزنة. إذا كان التركيز المقاسه خارج نطاق قياس المقايسة ، تمييع ماده طافي في لوحه التخفيف القاع في الحاجز التلفزيوني أو الفحص العازلة.
    3. يغسل 5 مرات مع المخزن المؤقت الغسيل القياسية واحتضان مع اهتزاز لمده 15 دقيقه في الظلام في 20 درجه مئوية مع TMB كركيزة البيروكسيديز (100 μL لكل بئر).
    4. إنهاء رد الفعل مع الحل وقف القياسية ، 0.1 M H2SO4 (100 μl لكل بئر).
    5. قراءه رد الفعل اللوني في الامتصاص 450 nm مع الامتصاص المرجعي في 650 nm علي قارئ لوحه المختبر القياسية.
  3. AGNx1
    1. القياس الكمي للتدهور الناجم عن الAGNx1 الجديدة. وتستهدف هذه المقايسة غير المباشرة التنافسية ELISA الببتيد C-المحطة الطرفية (NITEGE373) التي تم إنشاؤها بواسطة ادامتس-4 و 5 الانقسام. الأجسام المضادة الاحاديه تعترف بكل الشظايا مع مرمه NITEGE المكشوفة. نشرت التفاصيل تجريبية من الفحص في مكان آخر19.
  4. Proc2
    1. كميه تشكيل الكولاجين النوع الثاني عن طريق قياس الإفراج عن profragment من النوع الثاني من الكولاجين. هذه المقايسة غير المباشرة التنافسية ELISA تستهدف المرضبه من بروببتيد PIIBNP (QDVRQPG) المتولدة من N-بروبيبتياسيس اثناء تقليم الكولاجين من النوع الثاني التوليف حديثا. وقد نشرت التفاصيل التجريبية لمقايسة في مكان آخر16.
  5. C2M
    1. قياس النوع الثاني من تحلل الكولاجين من خلال الإفراج عن الجزء الC2M الجديد. هذه اليسا التنافسية المباشرة تعترف التناسبية المشقوقة C-الطرفية الببتيد (KPPGRDGAAG1053). هذا الفحص يختلف عن AGNx1 و ProC2 كما هو الأجسام المضادة الاساسيه التي هي البيروكسيديز-المسمي التالي ، وتستخدم ككاشف. نشرت التفاصيل تجريبية من الفحص في مكان آخر20.

5. التحليل النسيجي

  1. التسلل والتضمين والقطع
    1. ضع الشرح المثبت (انظر الخطوة 3.2) في أشرطه الكاسيت المسمية بشكل فردي. تضمين كل من التسمية داخل الكاسيت وأشرطه التسمية لضمان التعريف.
    2. انقل الشرائط التي تحتوي علي الشرح إلى اله معالجه الانسجه. ثم التسلل الشرح مع البارافين في سلسله من الجفاف والخطوات تسرب البارافين.
      1. ديهيدرات مع 96 ٪ الايثانول لمده 90 دقيقه مع عدم وجود تعديل في درجه الحرارة. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
      2. مسح الايثانول مع تولوين لمده 90 دقيقه مع عدم وجود تعديل في درجه الحرارة. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
      3. مسح الايثانول مع تولوين ل 90 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      4. التسلل مع شمع البارافين لمده 30 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      5. التسلل مع شمع البارافين لمده 60 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      6. التسلل مع شمع البارافين لمده 90 دقيقه في 60 درجه مئوية.
      7. لكل خطوه ، أضافه الحلول إلى غرفه العينة مع بطء ضخ التدريجي وضخ في التدفقات تحت 33-34 كيلو باسكال. تشغيل عمليه التسلل في دوره الضغط/فراغ مع الفراغ الأقصى من − 65 إلى − 70 kPa.
    3. بعد التسلل ، ضع الكاسيت علي كتله تسخين للسماح بازاله الشرح بعناية من الكاسيت. أدمج برفق المفسرين المخترقين في كتل البارافين الفردية. مع ملقط ساخن ، ضع الشرح مع الغضروف المفصلي السطحي والجوانب العظام تحت الغضروف عمودي علي سطح القطع ، وضمان التصور من طبقات الغضروف مختلفه داخل كل قسم العينة.
    4. قطع 5 μm أقسام من البارافين المبردة كتل مع الشرح جزءا لا يتجزا من ميكروتومي. نقل أقسام قطع إلى حمام المياه الباردة. إذا لزم الأمر ، يمكن فصل الأقسام باستخدام اما مشرط أو غطاء زجاجي.
    5. باستخدام شريحة زجاجيه غير مغلفه بعناية ، نقل الأقسام إلى حمام الماء الدافئ (50 درجه مئوية) ، حيث تتكشف الأقسام. رفع كل مقطع علي شريحة غطاء المسمي ووضع علي صفيحه ساخنه لمده 30 دقيقه.
    6. وضع الشرائح في سله واحتضان في 60 درجه مئوية لمده 1 ساعة ومن ثم الاحتفاظ بها بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية. الاخره ، تخزين الشرائح في حاويات مغلقه في 4 درجه مئوية حتى تلطيخ.
  2. سافانين O/الأخضر السريع تلطيخ والتصور
    1. ضع الشرائح لتكون ملطخه في سله واحتضان الشرائح في 60 درجه مئوية لمده 1 ساعة.
    2. اعداد وتصفيه جميع الكواشف مع فلتر 0.45 mm.
    3. في التحضير لتلطيخ ، صب الكواشف المصفاة في أكواب إلى وحده تخزين تسمح للحلول لتغطيه تماما الشرائح عند دمج السلة. الأكواب المستخدمة المطلوبة حجم 250 mL لتغطيه الشرائح.
    4. المغادرين الشرائح ذاب من خلال دمج سله في تولوين لمده 10 دقيقه مرتين ، 99 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، 96 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، و 70 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين. ثم ، هيدرات الشرائح في الماء لمده 2 دقيقه.
    5. وصمه عار المنزلقات والشرائح المائية من خلال دمج السلة في Weigert في محلول الحديد الهيلوكسيلين (pH 1.5) لمده 10 دقيقه ، وتراجع في 1 ٪ HCl مره واحده ، وشطف مع تشغيل مياه الصنبور لمده 5 دقائق تقريبا أو حتى اللون الزائد قد جرفت.
    6. المقبل ، وصمه عار في 0.05 ٪ الحل الأخضر السريع (pH: 5.75) لمده 5 دقائق ، وتراجع في 1 ٪ CH3cooh مره واحده ، ووصمه عار في 0.1 ٪ سافانين O (ph: 6.5) لمده 20 دقيقه.
    7. ديهيدرات ومسح الشرائح عن طريق غمس مرتين في 70 ٪ الايثانول ، 96 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، 99 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه مرتين ، والتولوين 2 دقيقه مرتين.
    8. جبل الشرائح الزجاجية غير المصقولة مع متوسطه راتنجيه تغطي الشرائح الانسجه.

النتائج

الأبقار الكاملة العمق الشرح كانت معزولة ، مثقف ، ومعالجتها لمده 3 أسابيع (الشكل 1). تم تغيير الوسط الثقافي مع أضافه العلاج 3 مرات في الأسبوع. مره واحده أسبوعيا ، تم قياس النشاط الأيضي من قبل الفحص resلازوردي. وقد قيست المؤشرات الحيوية لدوران المحتوي في القائمة البيولوجية التي ?...

Discussion

البروتوكول المعروض هنا لتحديد ملامح دوران الانسجه الغضروف في التفسيرات الغضروف البقري يمكن استخدامها لتوصيف اثار العلاج من أنواع كثيره من المخدرات, بما في ذلك مثبطات المسارات التهابيه داخل الخلايا, مثبطات الانزيمات البروتينية ، أو عوامل النمو الابتنائيه.

تم وصف اثنين من ?...

Disclosures

لجنه العلم والتكنولوجيا ، ACBJ و MK هم موظفو العلوم الحيوية الشمالية. ACBJ و MK يحمل أسهم في العلوم الحيوية الشمال. والمؤلفون الباقيون ليس لديهم ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفون الموظفين الفنيين في العلوم البيولوجية الاسكندنافيه علي الدعم المختبري ، فضلا عن مؤسسه البحوث الدانمركية للدعم العام لأبحاثنا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
45% Iron(III) chloride solutionSigma-Aldrich12322
Acetic acidMerck1.00056.2500
Alamar BlueLife tech InvitrogenDAL1100
Biopsy processing cassettes – greenIHCWORLDBC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)ScandidatMTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)Local slaughterhouse
C2MNordic BioscienceFee for service
Corning 96-well plateSigma-AldrichCLS7007
Cover Glass Ø 13 mmVWR631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPESGibco31331-028
Ethanol ≥96%VWR83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%VWR83813.36
exAGNx1Nordic BioscienceFee for service
exPRO-C2Nordic BioscienceFee for service
Fast greenSigma-AldrichF7252
Formaldehyde solution 4%Merck1004965000
GM6001Sigma-AldrichM5939-5MG
HematoxylinSigma-AldrichH3136
Hydrochloric acidMerck30721-M
IGF-1Sigma-AldrichI3769-50UG
Oncostatin MSigma-AldrichO9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)Sigma-AldrichP4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)HistoLab811
Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Safranin OSigma-AldrichS2255
Sterile Standard ScalpelsIntegra Miltex12-460-451
Sulfuric acidSigma-Aldrich30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope SlidesThermo scientificJ1800AMNT
TNF-alphaR&D Systems210-TA-100
TolueneMerck1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-FiltermaxTPP99955

References

  1. Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of osteoarthritis: the good, the bad and the promising. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (2), 230-239 (2018).
  2. Thysen, S., Luyten, F. P., Lories, R. J. U. Targets, models and challenges in osteoarthritis research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 17-30 (2015).
  3. Reker, D., et al. Articular cartilage from osteoarthritis patients shows extracellular matrix remodeling over the course of treatment with sprifermin (recombinant human fibroblast growth factor 18). Osteoarthritis and Cartilage. 26, S43 (2018).
  4. Kjelgaard-Petersen, C., et al. Synovitis biomarkers: ex vivo characterization of three biomarkers for identification of inflammatory osteoarthritis. Biomarkers. 20 (8), 547-556 (2015).
  5. Henriksen, K., et al. A specific subtype of osteoclasts secretes factors inducing nodule formation by osteoblasts. Bone. 51 (3), 353-361 (2012).
  6. Gigout, A., et al. Sprifermin (rhFGF18) enables proliferation of chondrocytes producing a hyaline cartilage matrix. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (11), 1858-1867 (2017).
  7. Reker, D., et al. Sprifermin (rhFGF18) modulates extracellular matrix turnover in cartilage explants ex vivo. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 3560 (2017).
  8. Karsdal, M. A. Introduction. Biochemistry of Collagens, Laminins and Elastin. , (2016).
  9. Heinegård, D., Saxne, T. The role of the cartilage matrix in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 50-56 (2011).
  10. Karsdal, M. A., et al. Osteoarthritis– a case for personalized health care?. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (1), 7-16 (2014).
  11. Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. C., Henriksen, K., Christiansen, C. The pathogenesis of osteoarthritis involves bone, cartilage and synovial inflammation: may estrogen be a magic bullet?. Menopause International. 18 (4), 139-146 (2012).
  12. Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis and Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
  13. Goldring, M. B., Goldring, S. R. Osteoarthritis. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 626-634 (2007).
  14. Karsdal, M. A., et al. The coupling of bone and cartilage turnover in osteoarthritis: opportunities for bone antiresorptives and anabolics as potential treatments?. Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (2), 336-348 (2014).
  15. Genovese, F., Karsdal, M. A. Protein degradation fragments as diagnostic and prognostic biomarkers of connective tissue diseases: understanding the extracellular matrix message and implication for current and future serological biomarkers. Expert Review of Proteomics. 13 (2), 213-225 (2016).
  16. Gudmann, N. S., et al. Cartilage turnover reflected by metabolic processing of type II collagen: a novel marker of anabolic function in chondrocytes. International Journal of Molecular Sciences. 15 (10), 18789-18803 (2014).
  17. Madej, W., van Caam, A., Davidson, E. B., Buma, P., van der Kraan, P. M. Unloading results in rapid loss of TGFβ signaling in articular cartilage: role of loading-induced TGFβ signaling in maintenance of articular chondrocyte phenotype?. Osteoarthritis and Cartilage. 24 (10), 1807-1815 (2016).
  18. Kjelgaard-Petersen, C. F., et al. Translational biomarkers and ex vivo models of joint tissues as a tool for drug development in rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 70 (9), 1419-1428 (2018).
  19. Wang, B., et al. Suppression of MMP activity in bovine cartilage explants cultures has little if any effect on the release of aggrecanase-derived aggrecan fragments. BMC Research Notes. 2 (4), 259 (2009).
  20. Bay-Jensen, A. C., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISAs) for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope, CIIM—Increased serum CIIM in subjects with severe radiographic osteoarthritis. Clinical Biochemistry. 44 (5-6), 423-429 (2011).
  21. Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43-49 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved