Vivo לשעבר התרבות רקמה מודל של שיפוץ הסחוס של הברך שור בעלי מפעלים

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר בידוד ו-culturing של הסחוס לאקצמחים מן הברכיים של הפרה. שיטה זו מספקת כלי קל ונגיש כדי לתאר שינויי רקמה בתגובה גירויים ביולוגיים או רומן therapeutics מיקוד המפרק.

Abstract

לשעבר מערכות תרבות vivo לכסות מגוון רחב של ניסויים המוקדש ללמוד רקמות ותפקוד הסלולר בסביבה מקורית. סחוס הוא רקמה ייחודית חשוב לתפקוד הנכון של משותפת אמתחת והוא היווה על ידי מטריקס מסחטות צפופה (ecm), עשיר פרוטאוגליקן וקולגן סוג II. כונדרוציטים הם סוג התא היחיד הנמצא בתוך הסחוס הם נפוצים יחסית נמוך במספר. גירויים חיצוניים שהשתנו ואיתות סלולרי יכולים להוביל לשינויים בקומפוזיציה ובהתדרדרות של ECM, שהם סימנים פתולוגיים חשובים במחלות כגון אוסטיאוארתריטיס (OA) ודלקת מפרקים שגרונית.

Vivo לשעבר הסחוס מודלים לאפשר 1) הפרופילים של כchondrocyte שינויים בתיווך של מחזור רקמות הסחוס, 2) מדמיין את הרכב ECM הסחוס, ו 3) כchondrocyte הסידור מחדש ישירות ברקמה. יצירת פרופילים של שינויים אלה בתגובה לגירויים או טיפולים הם בעלי חשיבות גבוהה בהיבטים שונים של ביולוגיה של הסחוס, ומשלימים את הניסויים במבחנה בתוך כונדרוציטים מבודדים, או מודלים מורכבים יותר בבעלי חיים בהם התנאים הניסיוניים קשה יותר לשלוט בהם

Explants סחוס להציג שיטה בקלות ונגיש עבור הערכת שיפוץ רקמות ב ECM הסחוס בהגדרות לשליטה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול עבור בידוד ו culturing חיות הסחוס הפרה החיה. השיטה משתמשת ברקמה מן הברך הפרה, אשר נגיש בקלות מן הבוצ המקומי. ניתן לנתח הן את האקסוצמחים והן את אמצעי התרבות הממוזג כדי לחקור מחזור רקמות, הרכב ECM, ותפקוד כchondrocyte, ובכך ליצור פרופילים של אפנון ECM.

Introduction

כונדרוציטים לייצר ולתחזק את מטריצת הסחוס. כדי ללמוד את הביולוגיה של כונדרוציטים וכיצד הם ו-ecm המקיפים מגיבים לגירויים חיצוניים, חשוב לחקור אותם בסביבתם הטבעית^1,2. לימוד מחזור רקמות הסחוס חשוב להגדיל את ההבנה של המנגנונים הבסיסיים במחלות משותפות כגון OA, מחלה שאין כרגע מחלה שינוי הטיפול. כתוצאה מכך, יש צורך משמעותי במודלים תרגום².

האפיון vivo Ex של השפעות התאים והרקמה הוא חיוני כדי להשלים מודלים קדם קליניים אחרים, הן בתוך מבחנה, כגון תרבויות מונאולייר כונדרוגיה, ובvivo, כגון מודלים OA המושרה או מודל דלקת מפרקים אוטואימונית המושרה (CIA ). מחקרים רבים הדגישו את ההבדלים בין כיצד תאים להתנהג בתרבויות 2d מונאולייר ומבנים תלת-ממדיים או ברקמה הטבעית שלהם^3,4. תאים רבים בשכבות דו-ממדיות לאמץ מורפולוגיות לא טבעיות, כולל הבדלים של קוטביות התא והחזקה רקמות, וכתוצאה מכך הן הבדלים חזותיים ופונקציונליים בתאים בתוך רקמות יליד⁵. ההבדלים גם ברור בפונקציונליות של התאים, אשר עשוי לנוע ביטוי חלבון, המוביל דפוסי בידול עמוק שונה, מכונות רגולציה, ופונקציונליות תא^{5,6,7 ,8}.

ECM הסחוס מורכב בעיקר מסוג II קולגן מתן מסגרת מטריצה, וצובר, פרוטנוגליקן המסייע לשמור על הנוזלים בתוך הרקמה. מולקולות אחרות של מטריקס כגון קולגן סוג IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectin, הסחוס oligomeric חלבון (COMP), biglycan, קישוט, ו perlecan הם גם הנוכחי⁹.

בעוד זה של OA נשאר ברור^10,11, התחלתה של המחלה הוא האמין להיגרם על ידי חוסר איזון במחזור רקמות ותהליכי תיקון^12,13. השפלה של הסחוס הפרקולארית הוא סימן ההיכר של OA. הסחוס-תושב כונדרוציטים או תאים ברקמות הסובבות להגדיל את שחרורם של ציטוקינים, עירור הייצור הגבוה של פרוטטינוסים כגון מטריקס מטאלוסים (MMPs) ו-מוספים, אשר להגדיל את השפלה של ECM הסחוס ¹⁴. השפלה זו גורמת לשחרורו של שברי חלבון ייחודיים קטנים המכונים ניאו-אפיסקופים, שניתן לכמת בסרום, בשתן או בתרבות בינונית^-15. עם היווצרות והתבגרות של קולגן, שברים שנקרא גם profragments הם שוחרר; אלה ניתן לכמת כמדד של ייצור מטריקס¹⁶.

מטרת פרוטוקול זה היא להקים מודל הסחוס vivo ex כדי להשוות את ההשפעה של גירוי ו/או טיפול בסמים על מחזור רקמות ECM. מחזור סחוס הוא הפרופיל על ידי מדידת מטריקס-נגזר בסמנים ניאו-אפירופה באופן ישיר במדיום התרבות הממוזגת באמצעות אליסה: AGNx1 (המשקף פעילות צובר), C2M (המשקף פעילות MMP מטריצה), ו ProC2 (המשקף סוג II קולגן מבנה). הממצאים יכולים להיות מאומת על ידי כתמים היסטולוגית של ECM, אשר גם לדמיין את הארגון של כונדרוציטים ב explants בודדים. הפרוטוקול המתואר ניתן להשתמש כדי לבדוק את ההשפעה של טיפולים חדשניים על הפונקציה כchondrocyte ומחזור ECM הסחוס. מספר מחקרים השתמשו explants הסחוס לתאר תהליכים ביולוגיים או את ההשפעה של התערבות על explants האתגר cytokine באמצעות היסטולוגית כמותית או אימונוהיסטויוכימיים גישות, mRNA, ביטוי חלבון, או פרוטאומניקס^{2 ,17,18}. עם זאת, פרוטוקולים אלה נמצאים מחוץ לטווח של כתב היד הנוכחי.

Protocol

1. בידוד רקמות

1. לחיזוי רקמות
   1. לבצע את כל הרקמות לחיזוי המקטע מחוץ מכסה הזרימה למינארי בסביבה אספטי.
   2. מתוך המטבחיים המקומי, לקבל מפרק הברך החדש של השור מוסרי המפרק מעגלים בין 1.5 ו 2 שנים של גיל.
   3. בעדינות לנתח את הברך העגל על ידי הסרת הבשר העודף, חשיפת הקונדיקלס, מניסקוס, הגידים, ו קרום אמתחת. חותכים את הגידים ואת קרום אמתחת, לאפשר את המפרק לפירוק. להסיר את המנסקוס. כדי לחשוף את הירך
   4. לבודד explants מאזור הנושאת העומס של condyles הירך באמצעות אגרופן ביופסיה 3 מ"מ ולשחרר אותם מן המשטח הפרקיות חיתוך עם אזמל מקביל וקרוב לעצם subchondral ככל האפשר. המבנה הקשה של העצם הsubchondral צריך להבטיח כי explants אינם מכילים מטריצה מסויד. שואפים לאקסוצמחים בגובה אחיד.
   5. מיד לאחסן ולערבב את האקסוצמחים ב-DMEM/F12-גלוטמקס + 1% P/S תרבות בינונית בצינור 50 mL או צלחת פטרי. אין לערבב הרחבות של ברכיים פרה שונים, אבל לשמור בנפרד עבור כל מחקר.
2. רקמת רקמה
   1. להעביר את הexplants לצלחת 96-באר סטרילי במכסה זרם למינארי.
   2. שטוף את האקסוצמחים 3 פעמים במדיום התרבות או PBS ותרבות אותם ב-200 μL של התרבות בינונית לכל הטוב עד תחילת הניסוי. השתמש בתקופה כשלון של 1 יום כדי לסנכרן פעילות תאית ביופסיה ושחרור בסמנים פסיבי.
   3. תרבות האקסוצמחים עד 10 שבועות בחממה 37 ° c עם 5% CO₂. מניחים את כל המשכפלת בתוך כל קבוצה באלכסון בלוח התרבות כדי למזער את הווריאציה הנגרמת על ידי אידוי. כדי למנוע התאיידות נוספת של סופרנטאנט, הוסיפו את ה-PBS לבארות החיצוניות של לוחית התרבות.

2. הסחוס לחקור את הטיפול והערכה של פעילות מטבולית

1. שינוי בינוני בתרבות וטיפול
   1. לשנות את מדיום התרבות כל 2-3 ימים במכסה של זרם למינארי.
   2. אם מיישמים טיפולים כלשהם, הכינו אותם לפני שינוי המדיום. הכינו את הטיפולים לריכוז המבוקש של בארות ההסבר באמצעות דילול במדיום התרבותי.
   3. להסיר בעדינות את הסופרנטאנט מכל באר ולהעביר אותו לצלחת חדשה 96 היטב. לאחסן את הסופרנטנט עם איטום על-גבי 20 ° צ' לניתוח ביוסיבי של מחזור רקמות וביטוי חלבון.
   4. מיד להוסיף 200 μL של מדיום תרבות טרייה או טיפול לכל טוב. אל תתנו לאקסוצמחים להתייבש במהלך השינוי הבינוני ולהבטיח כי כל האקסוצמחים הם שקוע לחלוטין במדיום החדש.
2. מכתים מחדש
   1. מדידת פעילות מטבולית פעם בשבוע כמדידה עקיפה של הכדאיות בתאים. הבדיקה resazurin היא דרך קלה להעריך אם הפעילות המטבולית של האקסוצמחים מתדרדר לחקור בודדים בשל מוות תאים או שינויים סלולריים. Explants בינוני בתרבות בלבד יש resazurin יציב יחסית לקרוא במהלך תקופת הניסוי.
   2. הפוך פתרון בינוני תרבותי עם 10% resazurin.
   3. לקצור את סופרנטנט כפי שמתואר בשלב 2.1.3.
   4. לטבול את explants ב 10% resazurin פתרון עבור 3 h ב 37 ° צ' או עד הסופרנטנמלים להפוך סגול. כלול 4 בארות ללא explants כפקדי רקע.
   5. העבר את השליטה הממוזגת והרקע resazurin לצלחת microtiter שחור ולמדוד פלואורסצנט ב 540 הריגוש ננומטר/590 ננומטר פליטה.
   6. לשטוף ביסודיות 3 פעמים בתוך התרבות בינונית או PBS ולהטביע את explants בינונית לשטוף עבור 5-10 דקות כדי לאפשר resazurin כדי לנטרל לחלוטין את. הוסיפו מדיום תרבות או טיפולים חדשים במידה ונעשה בהם שימוש.

3. הפסקת הסיום, קיבוע והאחסון לדוגמה

1. הפסקת תקופת הקולטיורינג
   1. מדוד את פעילות חילוף החומרים כמתואר בשלב 2.2. הוסף 200 μL של PBS לכל טוב.
2. קיבוע ואחסון
   1. להסיר את ה-PBS, להוסיף 200 μL של פורמלדהיד לכל טוב, ולהשאיר 2 h בטמפרטורת החדר.
   2. להיפטר פורמלדהיד ולהוסיף 200 μL של PBS לכל טוב. לכסות את הצלחת עם איטום קלטת, ולאחסן ב 4 ° c עבור ניתוח היסטכימית. אנו ממליצים לבצע אנליזה היסטכימית בתוך 3 חודשים.

4. ביוסמנים למחזור רקמות (אליסה)

1. אליאס תחרותי
   1. מעיל streptavidin-צלחת עם מטרה מיוחדת ביוטילת היעד-פפטיד מדולל 1:100 במאגר הסגולי (100 μL לכל טוב) עבור 30 דקות ב 20 ° c.
   2. לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל ולהוסיף לדוגמה-supernatant (20 μL לכל טוב) יחד עם נוגדן חד שבטיים העיקרי נגד היעד-פפטיד מדולל 1:93.3 עבור ProC2 ו 1:100 במאגר הקבוע עבור AGNx1 (100 μL לכל טוב) ו דגירה עבור 2 h ב 20 ° c עם טלטול עבור ProC2 ו-3 h ב -20 ° c עבור AGNx1.
      הערה: עוצמת הדגימה מתבצעת ישירות מלוחות הסופרנטאנט המאוחסנים. אם הריכוז הנמדד מחוץ לטווח המדידה, מדלל את הסופרנטנט בצלחת דילול בעלת התחתית ב-PBS או במאגר התקשוב.
   3. לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל הדגירה עם peroxidase-משני המסומנים נוגדן מדולל 1:100 במאגר משנה (100 μL לכל טוב) עבור 1 h ב 20 ° c.
   4. לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל מקרין עם טלטול עבור 15 דקות בחושך ב 20 ° c עם טטרמתילבנזיל (TMB) כמצע peroxidase (100 μL לכל טוב).
   5. סיים את התגובה עם פתרון עצירה סטנדרטית, 0.1 M H₂SO₄ (100 μl לכל טוב).
   6. קרא את תגובת הצביעה ב-450 בספיגת ננומטר באמצעות ספיגת התייחסות ב-650 nm בקורא לוחית מעבדה סטנדרטי.
2. מדידת מחזור רקמות הסחוס ב-סופרנטנט תחרותי
   הערה: הדבר מכמת את C2M.
   1. מעיל streptavidin-צלחת עם מטרה מיוחדת ביולוגית היעד-פפטיד מדולל 1:100 בתוך מאגר הנתון (100 μL לכל טוב) עבור 30 דקות ב 20 ° c.
   2. לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה ולהוסיף לדוגמה-supernatant יחד עם 100 μL של נוגדן חד שבטיים peroxidase נגד היעד מטרה-פפטיד מדולל 1:100 במאגר הטיפול (20 μL לכל טוב). דגירה של 20 h ב 2 – 8 ° צ' עם רעד.
      הערה: עוצמת הדגימה מתבצעת ישירות מלוחות הסופרנטאנט המאוחסנים. אם הריכוז הנמדד מחוץ לטווח המדידה, מדלל את הסופרנטנט בצלחת דילול בעלת התחתית ב-PBS או במאגר התקשוב.
   3. לשטוף 5 פעמים עם מאגר כביסה רגיל הדגירה עם טלטול עבור 15 דקות בחושך על 20 ° צ' עם TMB כמו מצע peroxidase (100 μL לכל טוב).
   4. סיים את התגובה עם פתרון עצירה סטנדרטית, 0.1 M H₂SO₄ (100 μl לכל טוב).
   5. קראו את תגובת הצביעה ב-450 בספיגת ננומטר עם ספיגת הפניות ב-650 nm בקורא לוחית מעבדה סטנדרטית.
3. AGNx1
   1. מודד מדידת שחרור על ידי מדידה של שחרורו של AGNx1 ניאו-אפירופה. זו מטרה מתחרה עקיפה מטרות ה-מסופים (NITEGE³⁷³) שנוצרו על ידי adamts-4 ו-5 מחשוף. הנוגדן החד-שבטיים מזהה את כל הקטעים עם אפיבגיה חשופה. הפרטים הניסיוניים של המנה פורסמו במקומות אחרים¹⁹.
4. ProC2
   1. מכמת סוג II היווצרות קולגן על ידי מדידת שחרורו של profragment של קולגן סוג II. זו שיטת ה-דיאגנוסטיקה התחרותית בעקיפין מטרות האפיפיטיות של הפרופפטיד של PIIBNP (QDVRQPG) שנוצר על ידי N-propep, במהלך קיצוץ של קולגן מסונתז סוג II החדש. הפרטים הניסיוניים של המנה פורסמו במקומות אחרים¹⁶.
5. C2M
   1. מכמת סוג II השפלה קולגן על ידי מדידת שחרורו של רסיס ניאו אפירופה C2M. זו אליסה תחרותי ישירה מזהה את הפפטיד C-מסוף של MMP (KPPGRDGAAG¹⁰⁵³). השיקול הזה שונה מ AGNx1 ו ProC2 כפי שהוא הנוגדן העיקרי כי הוא peroxidase מתויג וכך, משמש גלאי. הפרטים הניסיוניים של המנה פורסמו במקומות אחרים²⁰.

5. ניתוח היסטולוגית

1. הסתננות, הטבעה וגזירה
   1. מניחים את האקסוצמחים המתויגים (ראו שלב 3.2) לקלטות המסומנות באופן אינדיבידואלי. כלול גם תווית בתוך קלטות הקלטת והתווית כדי להבטיח זיהוי.
   2. העבר את הקלטות המכילות הרחבות למכונת מעבד רקמות. לאחר מכן לחדור את explants עם פרפין בסדרה של התייבשות ו הסתננות שלבים החדירה.
      1. מייבשים עם 96% אתנול עבור 90 דקות עם התאמת טמפרטורה. חזור על שלב זה 3 פעמים.
      2. נקה את אתנול עם טולואן עבור 90 דקות ללא התאמת טמפרטורה. חזור על שלב זה 2 פעמים.
      3. נקה את אתנול עם טולואן עבור 90 דקות ב 60 ° c.
      4. לחדור עם פרפין שעווה עבור 30 דקות ב 60 ° c.
      5. לחדור עם פרפין שעווה עבור 60 דקות ב 60 ° c.
      6. לחדור עם פרפין שעווה עבור 90 דקות ב 60 ° c.
      7. עבור כל שלב, להוסיף את הפתרונות לתוך התא לדוגמה עם המשאבה איטית-out ו-משאבה זורם תחת 33-34 kPa. הפעל את תהליך החדירה בתוך לחץ/מחזור ואקום עם ואקום מקסימלית של-65 עד 70 kPa.
   3. בעקבות חדירה, למקם את הקלטות על בלוק החימום כדי לאפשר הסרה זהירה של explants מתוך הקלטת. להטביע בעדינות את הצמחים החדרו לתוך גושי פרפין בודדים. עם מלקחיים מחומם, המקום explants עם הסחוס שטחי שטחית הצדדים subchondral עצם בניצב על פני השטח חיתוך, להבטיח ויזואליזציה של שכבות הסחוס שונים בתוך כל מקטע הדגימה.
   4. גזור 5 יקרומטר סעיפים של מקורר פרפין בלוקים עם explants מוטבעים על מיקרוטומה. העבירו את הקטעים החתוכים לאמבט מים קרים. במקרה הצורך, ניתן להפריד בין מקטעים באמצעות אזמל או כיסוי זכוכית.
   5. באמצעות שקופית זכוכית בלתי מצופה, העבירו את הסעיפים לאמבט מים חמים (50 ° c), שם מתגלמים הסעיפים. הרם כל קטע אל שקופית כיסוי עם תווית ומקום על צלחת חמה במשך 30 דקות.
   6. מניחים את השקופיות בסל ו-הדגירה ב 60 ° c עבור 1 h ולאחר מכן לשמור אותם לילה ב 37 ° c. להלן, אחסן שקופיות במכלים סגורים ב-4 ° צ' עד לצביעת.
2. מכתים ויזואליזציה של ירוק Safranin O/מהיר
   1. מניחים את השקופיות כדי להיות מוכתם בסל ו מוד, את השקופיות ב 60 ° c עבור 1 h.
   2. להכין ולסנן את כל ריאגנטים עם פילטר 0.45 מ"מ.
   3. כהכנה לצביעת, יוצקים את הריאגנטים המסונן בספלים לאמצעי אחסון המאפשר לפתרונות לכסות את השקופיות לחלוטין בעת מיזוג הסל. הספלים בשימוש נדרש נפח של 250 mL כדי לכסות את השקופיות.
   4. מיזוג השקופיות מומסת על ידי שוקע הסל ב טולואן עבור 10 דקות פעמיים, 99% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, 96% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, ו 70% אתנול עבור 2 דקות פעמיים. ואז, מימה את השקופיות במים עבור 2 דקות.
   5. הכתם את מגלשות הגופות והנוזלים באמצעות מיזוג הסל בתמיסת המטאוקסילין של וייגרט (pH 1.5) במשך 10 דקות, טבול ב-1% HCl פעם אחת, ושטוף עם מי ברז זורמים למשך כ -5 דקות או עד ששטף את הצבע העודף.
   6. הבא, כתם ב 0.05% הפתרון הירוק מהיר (pH: 5.75) עבור 5 דקות, לטבול ב 1% CH₃cooh פעם, והכתם ב 0.1% Safranin O (pH: 6.5) עבור 20 דקות.
   7. מייבשים ולנקות את השקופיות על ידי לטבול פעמיים ב 70% אתנול, 96% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, 99% אתנול עבור 2 דקות פעמיים, ו טולואן 2 דקות פעמיים.
   8. הר מגלשות זכוכית ללא ציפוי עם מדיום שרף המכסה את שקופיות היסטולוגיה.

תוצאות

הרחבות של שור עומק מלא היו מבודדים, מתורבתים ומטופלים במשך 3 שבועות (איור 1). המדיום התרבותי השתנה עם תוספת טיפול 3 פעמים בשבוע. פעם בשבוע, פעילות מטבולית נמדדה על ידי שיטת resazurin. ביוארקרס של מחזור ECM נמדדו על הסופרנטנט שנקטפו מלוח התרבות 3 פעמים בשבוע. Explants חולקו 4 קבוצות לטיפול...

Discussion

הפרוטוקול המוצג כאן עבור הפרופיל של מחזור רקמות הסחוס בתוך הסחוס בתאי הפרה יכול לשמש לאפיון השפעות הטיפול של סוגים רבים של תרופות, כולל מעכבי של מסלולים תאיים, מעכבי של אנזימים פרוטנוגד חרדה, או גורמי גדילה אנבוליים.

שני הכיוונונים שונים תוארו בפרוטוקול זה: התקנה אנבוליים ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955