牛膝剥離植物における軟骨改造のEx Vivo組織培養モデル

要約

ここでは、ウシの膝からの軟骨の切除と培養を記述するプロトコルを提示する。この方法は、関節を標的とする生物学的刺激または新規治療に応答して組織の変化を記述するための容易でアクセス可能なツールを提供する。

要約

Ex vivo培養システムは、ネイティブの設定で組織と細胞機能を研究することに特化した幅広い実験をカバーしています。軟骨は、静脈関節の適切な機能のために重要なユニークな組織であり、密な細胞外マトリックス(ECM)によって構成され、プロテオグリカンとII型コラーゲンが豊富です。軟骨細胞は軟骨内に存在する唯一の細胞型であり、広範囲にわたり、比較的少ない数である。変化した外部刺激および細胞シグナル伝達は、変形性関節症(OA)および関節リウマチなどの疾患において重要な病理学的特徴であるECM組成および劣化の変化につながる可能性がある。

ex vivo軟骨モデルは、軟骨組織回転率の変化を媒介する軟骨細胞のプロファイリング、2)軟骨ECM組成物の可視化、および3)軟骨細胞転位を組織中で直接行うことを可能にする。刺激または治療に応答してこれらの変化をプロファイリングすることは、軟骨生物学の様々な側面において非常に重要であり、単離された軟骨細胞におけるインビトロ実験、または実験条件がある生きている動物におけるより複雑なモデルを補完する制御がより困難です。

軟骨剥離植物は、制御可能な設定で軟骨ECMにおける組織改造を評価するための翻訳的かつ容易にアクセス可能な方法を提示する。ここでは、生きた牛軟骨切除植物を分離および培養するためのプロトコルについて説明する。この方法は、地元の肉屋から簡単にアクセスできる牛の膝からの組織を使用しています。除植物および調節培養培地の両方を分析して、組織のターンオーバー、ECM組成物、および軟骨細胞機能を調べ、ECM変調をプロファイリングすることができる。

概要

軟骨細胞は軟骨マトリックスを産生し、維持する。軟骨細胞の生物学を研究し、それらと周囲のECMが外部刺激にどのように反応するかを研究するためには、彼らの母国^環境1、2でそれらを尋問することが重要です。軟骨組織のターンオーバーを研究することは、OAなどの関節疾患の基礎的メカニズムの理解を深めるために重要であり、現在疾患改変治療がない疾患である。その結果、より良い翻訳^モデル2が大きく必要になります。

細胞および組織効果のEx vivo特性評価は、軟骨細胞単層培養物などのインビトロと、手術誘発OAモデルや自己免疫コラーゲン誘発関節炎モデル(CIA)などの生体内の両方の他の前臨床モデルを補完するために不可欠である).多くの研究は、2D単層培養物と3D構造、または天然^組織3、4における細胞の振る舞いの違いを強調している。2D層の多くの細胞は、細胞極性および組織結合の違いを含む不自然な形態を採用し、その結果、天然^組織5内の細胞における視覚的および機能的な違いをもたらす。違いは、タンパク質発現をシフトさせる可能性のある細胞の機能性においても明らかであり、分化パターン、調節機械、および細胞機能の大幅な変化につながる^{5,6,7 、8}.

軟骨ECMは、マトリックスフレームワークを提供するII型コラーゲンと、組織内の流体を保持するのに役立つプロテオグリカンであるアグレカンで構成されています。コラーゲンタイプIV、VI、IX、X、XI、XII、フィブロネクチン、軟骨オリゴマータンパク質(COMP)、ビッグリカン、デコリン、およびペルレカンなどの他のマトリックス分子^も9に存在する。

OAの病因は不明のままである^{が、10、11、}この疾患の発症は、組織のターンオーバーおよび修復^{プロセス12、13}の不均衡によって引き起こされると考えられている。関節軟骨の劣化はOAの特徴である。周囲の組織の軟骨細胞または細胞はサイトカインの放出を増加させ、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)やアグレカナーズなどのタンパク質アナーゼの産生の上昇を刺激し、軟骨ECMの分解を増加させる^14.この分解は、血清、尿、または培養^培地15で定量することができるネオエピトープと呼ばれる小さなユニークなタンパク質断片の放出をもたらす。コラーゲンの形成と成熟に際して、いわゆるプロフラグメントも放出される。これらは、マトリックス^生産16の尺度として定量することができる。

このプロトコルの目的は、ECM組織回転率に対する刺激および/または薬物治療の効果を比較するex vivo軟骨モデルを確立することである。軟骨回転率は、ELISAを用いてコンディショニング培養培地中でマトリックス由来ネオエピトープバイオマーカーを直接測定することによってプロファイリングされる:AGNx1(アグレカナゼ活性を反映する)、C2M(マトリックスMMP活性を反映する)、およびProC2(反射型IIコラーゲン)形成)。この知見は、個々の外見における軟骨細胞の組織を可視化するECMの組織学的染色によって検証することができる。記載のプロトコルは、軟骨細胞機能および軟骨ECM回転率に対する新規治療の効果を試験するために使用することができる。多くの研究は、生物学的プロセスまたは細胞カインに挑戦した見葉植物に対する介入の効果を、定量的組織学的または免疫組織化学的アプローチ、mRNA、タンパク質発現、またはプロテオミクス2を用いて記述するために軟骨剥離植物を使用してきた。 ^、17、18.しかし、これらのプロトコルは、現在の原稿の範囲外です。

プロトコル

1. 組織分離

1. ティッシュソーシング
   1. 無菌環境で層流フードの外側で組織全体の調達セクションを実行します。
   2. 地元の食肉処理場から、1.5歳から2歳までの子牛から新鮮なウシ脛骨大腿骨膝関節全体を得る。
   3. 最初に余分な肉を取り除き、凹凸、半月板、腱、およびスイノビカル膜を明らかにして、ふくらはぎの膝を穏やかに解剖します。腱とスイノブニカル膜を切断し、関節を分解できるようにします。大腿骨の結節を露出させるために半月板を取り除く。
   4. 3mm生検パンチャーを使用して大腿骨の耐荷重領域から除植物を分離し、可能な限り軟骨下骨に平行かつ近いメスで切断することにより、関節表面からそれらを解放します。軟骨下骨の硬い構造は、除植物が石灰化されたマトリックスを含まないことを保証する必要があります。均一な高さのエクスプラントのために努力してください。
   5. すぐに貯蔵し、50 mLチューブまたはペトリ皿でDMEM/F12-グルタマックス+1%P/S培養培地で植物を混合します。異なる牛の膝から交え出すのではなく、研究ごとに別々に保管してください。
2. 組織培養
   1. 積層流のフードの無菌96ウェルプレートにエクスプラントを移します。
   2. 培養培地またはPBSで3回エクスプラントを洗浄し、実験開始までウェル当たり200μLの培養培地で培養する。生検細胞活性と受動バイオマーカー放出を同期させるために1日の洗い流し期間を使用してください。
   3. 培養は、5%CO2で37°インキュベーターで10週間まで植え付けます。蒸発によって誘発される変動を最小限に抑えるために、各グループ内のすべての複製を培養プレート内に斜めに配置します。さらに上清の蒸発を避けるために、培養プレートの外側の井戸にPBSを加える。

2. 牛軟骨剥離植物の治療と代謝活性評価

1. 培養培地の変化と治療
   1. 層流フードで2~3日ごとに培養培地を交換します。
   2. 治療を適用する場合は、培地を変更する前にこれらを準備してください。培養培地中の希釈により、剥離井戸内の所望の濃度に対する処理を準備する。
   3. 各井戸から上清をそっと取り除き、新しい96ウェルプレートに移します。組織のターンオーバーおよびタンパク質発現のバイオマーカー分析のために、密封テープで上清を−20°Cで保管してください。
   4. すぐに200°Lの新鮮な培養培地またはウェルあたりの処理を追加します。培地交換中に外見植物を乾燥させず、すべての外見が新しい培地に完全に沈んでいられるようにしてください。
2. レサズリン染色
   1. 細胞生存率の間接測定として週1回代謝活性を測定する。レサズリン試験は、細胞死または細胞変化によって個々の移植植物の代謝活性が悪化するかどうかを評価する簡単な方法である。培養培地単独のエクスプラントは、実験期間を通じて比較的安定したレサズリン読み取り値を有する。
   2. 10%のレサズリンで培養培地の溶液を作る。
   3. ステップ2.1.3に記載の上清を収穫する。
   4. 37°Cで3時間、または上清が紫色になるまで10%リサズリン溶液にエクスプラントを浸漬します。背景コントロールとして植え付けなしの4つの井戸を含めます。
   5. 条件付きおよびバックグラウンドコントロールレサズリン溶液を黒いマイクロテータープレートに移し、540 nm励起/590 nmの放出で蛍光を測定します。
   6. 培養培地またはPBSで3回をよく洗浄し、5〜10分間洗浄培地に沈み込み、リサズリンが完全に拡散できるようにします。新しい培養培地または治療法を追加します(使用する場合)。

3. 終了、固定、およびサンプルストレージ

1. 培養期間の終了
   1. ステップ2.2に記載の代謝活性を測定する。井戸ごとに200°LのPBSを加えます。
2. 固定とストレージ
   1. PBSを取り出し、ウェル当たり200μLのホルムアルデヒドを加え、室温で2時間放置します。
   2. ホルムアルデヒドを処分し、井戸ごとに200μLのPBSを加えます。プレートをシールテープで覆い、ヒストケミカル分析のために4°Cで保管してください。3ヶ月以内にヒストケミカル分析を行うことをお勧めします。

4. 組織回転バイオマーカー(ELISA)

1. 間接競争力のあるエリサス
   1. ステレプトアビジンプレートを、20°Cで30分間、アッセイバッファー(ウェル当たり100μL)で1:100希釈した特異的ビオチン化アッセイターゲットペプチドでコートする。
   2. 標準的な洗浄バッファーで5回洗浄し、サンプル上清(ウェルあたり20°L)を加え、ProC2用のアッセイ標的ペプチド希釈1:93.3に対する一次モノクローナル抗体と、AGNx1(ウェル当たり100°Lあたり100°L)のアッセイバッファーに1:100を加え、20°Cで2時間インキュベートするAGNx1の場合はProC2と3時間の揺れを伴う。
      メモ:サンプル体積は、保存された上清プレートから直接取られます。測定濃度がアッセイ測定範囲外の場合は、PBSまたはアッセイバッファー内のv底希釈板で上清を希釈する。
   3. 標準的な洗浄バッファーで5回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識二次抗体をアッセイバッファー(ウェル当たり100μL)で1:100希釈して20°Cで1時間インキュベートします。
   4. 標準的な洗浄バッファーで5回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質(ウェル当たり100°L)としてテトラメチルベンジジン(TMB)で20°Cの暗闇の中で15分間振とうでインキュベートします。
   5. 標準的な停止溶液で反応を終了し、0.1 M H₂SO₄₍ウェル当たり100°L)。
   6. 標準的な実験室の版の読者の650 nmの基準吸光度を使用して450 nmの吸光度の比色反応を読み取る。
2. 上清における軟骨組織回転率測定のための直接競合ELISA
   注: これにより、C2M が定量化されます。
   1. ステレプトアビジンプレートを、20°Cで30分間、アッセイバッファー(ウェル当たり100μL)で1:100希釈した特異的ビオチン化アッセイターゲットペプチドを用いてコートする。
   2. 洗浄緩衝液で5回洗浄し、アッセイ対象ペプチドに対するペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体100μLと共に試料上清をアッセイバッファー(ウェル当たり20μL)で希釈したアッセイターゲットペプチドに対して加えた。振とうで2~8°Cで20時間インキュベートします。
      メモ:サンプル体積は、保存された上清プレートから直接取られます。測定濃度がアッセイ測定範囲外の場合は、PBSまたはアッセイバッファー内のv底希釈板で上清を希釈する。
   3. 標準的な洗浄バッファーで5回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質としてTMB(ウェルあたり100°L)として20°Cの暗闇の中で15分間振とうでインキュベートします。
   4. 標準的な停止溶液で反応を終了し、0.1 M H₂SO₄₍ウェル当たり100°L)。
   5. 標準的な実験室の版の読者の650 nmの参照吸光度と450 nmの吸光度の比色反応を読み取る。
3. AGNx1
   1. AGNx1ネオエピトープの放出を測定することにより、アグレカン分解を定量化する。この間接的競合ELISAアッセイは、ADAMTS-4および5切断によって生成されたアグレカンC末端ペプチド(NITEGE³⁷³⁾を標的とする。モノクローナル抗体は、露出したNITEGEエピトープを有するすべての断片を認識する。アッセイの実験的な詳細は、他の場所で公開されています^19.
4. ProC2
   1. II型コラーゲンのプロフラグメントの放出を測定してII型コラーゲン形成を定量する。この間接的競合ELISAアッセイは、新たに合成されたII型コラーゲンのトリミング中にN-プロペプチダーゼによって生成されたPIIBNPプロペプチド(QDVRQPG)のエピトープを標的とする。アッセイの実験的な詳細は、他の場所で公開されています^16.
5. C2M
   1. C2Mネオエピトープ断片の放出を測定してII型コラーゲン分解を定量する。この直接競合するELISAは、MMP-切断されたC末端ペプチド(KPPGRDGAAG¹⁰⁵³⁾を認識します。このアッセイは、ペルオキシダーゼ標識され、検出器として使用される一次抗体であるため、AGNx1およびProC2とは異なります。アッセイの実験的な詳細は、他の場所で公開されています²⁰.

5. 組織学的分析

1. 浸潤、埋め込み、切断
   1. 固定されたエクスプラント(ステップ3.2を参照)を個別にラベル付けされたカセットに入れます。識別を確実にするために、カセットとラベルカセットの両方にラベルを含めます。
   2. 交付物を含むカセットをティッシュプロセッサー機に移します。次いで、一連の脱水およびパラフィン浸潤工程でパラフィンで見他植物に浸潤する。
      1. 96%エタノールで96%のエタノールで脱水し、温度調整なしで90分間脱水します。この手順を 3 回繰り返します。
      2. 温度調整なしで90分間トルエンでエタノールをクリアします。この手順を 2 回繰り返します。
      3. 60°Cで90分間トルエンでエタノールをクリアします。
      4. 60°Cで30分間パラフィンワックスで浸潤する。
      5. 60°Cで60分間パラフィンワックスで浸潤する。
      6. 60°Cで90分間パラフィンワックスで浸潤する。
      7. 各ステップについて、33~34 kPa以下の低速ポンプアウトおよびポンプインフローを備えたサンプルチャンバーにソリューションを追加します。最大真空-65~−70 kPaの圧力/真空サイクルで浸潤プロセスを実行します。
   3. 浸潤後、カセットを加熱ブロックの上に置き、カセットから植物を慎重に取り除くようにします。浸潤したエクスプラントを個々のパラフィンブロックにゆっくりと埋め込みます。加熱鉗子を使用して、切断面に垂直な表面関節軟骨と軟骨下骨側を備えた除植物を配置し、各検体セクション内の異なる軟骨層の可視化を保証します。
   4. 冷却されたパラフィンブロックの5μmセクションを、ミクロトームに埋め込まれたエクスプラントでカットします。切り傷切り切りを冷水風呂に移します。必要に応じて、メスまたはカバーガラスのいずれかを使用して切片を分離することができます。
   5. コーティングされていないガラススライドを使用して、セクションを温水浴(50°C)に移し、セクションが展開します。各セクションをラベル付きカバースライドに持ち上げ、ホットプレート上に30分間置きます。
   6. スライドをバスケットに入れ、60°Cで1時間インキュベートし、37°Cで一晩保管します。以下、染色するまで4°Cの密閉容器にスライドを保存する。
2. サフラニンO/ファストグリーン染色と可視化
   1. 汚すスライドをバスケットに入れ、60°Cで1時間インキュベートします。
   2. 0.45 mmフィルターですべての試薬を準備し、フィルター処理します。
   3. 染色の準備として、フィルターをかけられた試薬をビーカーに注ぎ、バスケットを水没させる際に溶液がスライドを完全に覆えるようにするボリュームにします。使用されるビーカーはスライドを覆うために250 mLの容積を要求した。
   4. 溶けたスライドを10分間に2回、99%エタノールを2分間、96%エタノールを2分間、70%エタノールを2回2回に浸して脱パラフィン化する。その後、2分間水でスライドを水和します。
   5. ヴァイガートの鉄ヘマトキシリン溶液(pH1.5)にバスケットを10分間浸漬して脱パラフィン化および水和スライドを染色し、1%HClに1回浸し、水道水を流して約5分間または余分な色が洗い流されるまですすす。
   6. 次に、0.05%のファストグリーン溶液(pH:5.75)で5分間染色し、1%CH₃COOHに1回浸し、0.1%サフラニンO(pH:6.5)で20分間染色します。
   7. 脱水し、70%エタノールに2回浸漬し、96%エタノールを2分間2回、99%エタノールを2分間、トルエン2分間2回浸漬する。
   8. 無塗装のガラススライドに、ヒストロジースライドを覆う樹脂媒体で取り付けます。

結果

牛の全深分の植え付けを単離し、培養し、3週間処理した(図1)。培養培地は、週3回の治療を加えて変更した。週1回、代謝活性をレサズリンアッセイにより測定した。ECM回転率のバイオマーカーは、培養プレートから採取した上清で週3回測定した。エクスプラントは、治療のために4つのグループに分けられた:1)オンコスタチンMおよびTNFα(O+T);。2) O+T + GM6001 (GM6001);3) 成長?...

ディスカッション

ここで提示されるウシ軟骨除植物における軟骨組織回転率のプロファイリングのために提示されるプロトコルは、炎症性細胞内経路の阻害剤、阻害剤を含む多くの種類の薬物の治療効果を特徴付するために使用することができるタンパク質分解酵素、または同化成長因子。

このプロトコルでは、2つの異なるセットアップが説明されました:除植物がインスリン様成長因子...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955