Ein Ex-Vivo-Gewebekulturmodell des Knorpel-Remodels in Rinderknie-Explants

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Isolierung und Kultivierung von Knorpelexpflanzen von Rinderknien beschreibt. Diese Methode bietet ein einfaches und zugängliches Werkzeug, um Gewebeveränderungen als Reaktion auf biologische Reize oder neuartige Therapeutika, die auf das Gelenk abzielen, zu beschreiben.

Zusammenfassung

Ex-vivo-Kultursysteme decken eine breite Palette von Experimenten ab, die sich der Untersuchung von Gewebe und zellulärer Funktion in einer nativen Umgebung widmen. Knorpel ist ein einzigartiges Gewebe, das für die ordnungsgemäße Funktion des Synovials wichtig ist und aus einer dichten extrazellulären Matrix (ECM) besteht, die reich an Proteoglykan und Typ-II-Kollagen ist. Chondrozyten sind der einzige Zelltyp, der im Knorpel vorliegt und weit verbreitet und relativ gering ist. Veränderte äußere Reize und zelluläre Signalgebung können zu Veränderungen in der Zusammensetzung und Verschlechterung des ECM führen, die wichtige pathologische Kennzeichen bei Krankheiten wie Arthrose (OA) und rheumatoider Arthritis sind.

Ex-vivo-Knorpelmodelle ermöglichen 1) Profilierung von Chondrozyten vermittelten Veränderungen des Knorpelgewebeumsatzes, 2) Visualisierung der Knorpel-ECM-Zusammensetzung und 3) Chondrozyten-Umlagerung direkt im Gewebe. Die Profilierung dieser Veränderungen als Reaktion auf Reize oder Behandlungen ist in verschiedenen Aspekten der Knorpelbiologie von großer Bedeutung und ergänzt In-vitro-Experimente an isolierten Chondrozyten oder komplexere Modelle bei lebenden Tieren, bei denen experimentelle Bedingungen sind schwieriger zu kontrollieren.

Knorpelexplantationen stellen eine translationale und leicht zugängliche Methode zur Beurteilung der Gewebeumgestaltung im Knorpel-ECM in kontrollierbaren Einstellungen dar. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung lebender Rinderknorpelexplantationen. Die Methode verwendet Gewebe aus dem Rinderknie, das von der örtlichen Metzgerei leicht zugänglich ist. Sowohl Explanten als auch konditioniertes Kulturmedium können analysiert werden, um den Gewebeumsatz, die ECM-Zusammensetzung und die Chondrozytenfunktion zu untersuchen und so die ECM-Modulation zu profilieren.

Einleitung

Chondrozyten produzieren und pflegen die Knorpelmatrix. Um die Biologie von Chondrozyten zu studieren und wie sie und das umgebende ECM auf äußere Reize reagieren, ist es entscheidend, sie in ihrer heimischen Umgebung zu befragen^1,2. Die Untersuchung des Knorpelgewebeumsatzes ist wichtig, um das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen bei Gelenkerkrankungen wie OA zu erweitern, einer Krankheit, für die es derzeit keine krankheitsmodifizierende Behandlung gibt. Folglich besteht ein erheblicher Bedarf an besseren Übersetzungsmodellen².

Die Ex-vivo-Charakterisierung von Zell- und Gewebeeffekten ist wesentlich, um andere präklinische Modelle zu ergänzen, sowohl in vitro, wie Chondrozyten-Monolayer-Kulturen, als auch in vivo, wie z. B. chirurgisch induzierte OA-Modelle oder das autoimmune Kollagen-induzierte Arthritis-Modell (CIA ). Zahlreiche Studien haben die Unterschiede zwischen dem Verhalten von Zellen in 2D-Monolayer-Kulturen und 3D-Strukturen oder in ihrem nativen Gewebe^3,4hervorgehoben. Viele Zellen in 2D-Schichten übernehmen unnatürliche Morphologien, einschließlich Unterschiede in der Zellpolarität und Gewebebindung, was zu visuellen und funktionellen Unterschieden in Zellen innerhalb nativer Gewebe^{führt 5}. Die Unterschiede zeigen sich auch in der Funktionalität der Zellen, die die Proteinexpression verschieben können, was zu tiefgreifend veränderten Differenzierungsmustern, regulatorischen Maschinen und Zellfunktionalität^{5,6,7 führt. ,8}.

Der Knorpel ECM besteht hauptsächlich aus Typ-II-Kollagen, das ein Matrix-Framework bietet, und Aggrecan, einem Proteoglykan, der hilft, Flüssigkeit im Gewebe zu halten. Andere Matrixmoleküle wie Kollagen Typ IV, VI, IX, X, XI, XII, Fibronectin, Knorpel-Oligomerprotein (COMP), Biglycan, Decorin und Perlecan sind ebenfalls vorhanden⁹.

Während die Ätiologie von OA bleibt unklar^10,11, der Beginn der Krankheit wird geglaubt, um durch Ungleichgewichte im Gewebeumsatz und Reparaturprozesse verursacht werden^12,13. Der Abbau des Gelenkknorpels ist ein Markenzeichen von OA. Knorpelresidente Chondrozyten oder Zellen in den umgebenden Geweben erhöhen ihre Freisetzung von Zytokinen und stimulieren die erhöhte Produktion von Proteinasen wie Matrixmetalloproteinasen (MMPs) und Aggrecanasen, die den Abbau von Knorpel ECM erhöhen ¹⁴. Dieser Abbau führt zur Freisetzung kleiner einzigartiger Proteinfragmente, sogenannteneo-Epitope, die in Serum, Urin oder Kulturmedium¹⁵quantifiziert werden können. Bei der Bildung und Reifung von Kollagen werden auch sogenannte Profragmente freigesetzt; diese können als Maß für die Matrixproduktion quantifiziert werden¹⁶.

Ziel dieses Protokolls ist es, ein ex vivo Knorpelmodell zu erstellen, um die Auswirkungen der Stimulation und/oder medikamentösen Behandlung auf den ECM-Gewebeumsatz zu vergleichen. Der Knorpelumsatz wird durch Messung von Matrix-abgeleiteten Neo-Epitop-Biomarkern direkt im konditionierten Kulturmedium mit ELISA profiliert: AGNx1 (reflektierende Aggrecanase-Aktivität), C2M (reflektierende Matrix-MMP-Aktivität) und ProC2 (reflektierendes Typ-II-Kollagen Bildung). Die Befunde können durch histologische Färbung des ECM überprüft werden, die auch die Organisation von Chondrozyten in den einzelnen Explants visualisiert. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um die Wirkung neuartiger Behandlungen auf chondrozytenfunktion und Knorpel-ECM-Umsatz zu testen. In einer Reihe von Studien wurden Knorpelexate verwendet, um biologische Prozesse oder die Wirkung von Interventionen auf zytokinbefragte Explanten mit quantitativen histologischen oder immunhistochemischen Ansätzen, mRNA, Proteinexpression oder Proteomik zu beschreiben^{2 ,17,18}. Diese Protokolle fallen jedoch nicht in den Anwendungsbereich des aktuellen Manuskripts.

Protokoll

1. Gewebeisolierung

1. Gewebebeschaffung
   1. Führen Sie den gesamten Gewebebeschaffungsbereich außerhalb einer laminaren Strömungshaube in einer aseptischen Umgebung durch.
   2. Vom örtlichen Schlachthof erhalten Sie ein ganzes frisches rindertibiofemorales Kniegelenk von Kälbern zwischen 1,5 und 2 Jahren.
   3. Sezieren Sie das Wadenknie vorsichtig, indem Sie zuerst das überschüssige Fleisch entfernen und die Kondylen, den Meniskus, die Sehnen und die Synovialmembran aufdecken. Schneiden Sie die Sehnen und die Synovialmembran, so dass das Gelenk zersplittert werden kann. Entfernen Sie den Meniskus, um die Femoralkondylen zu entblößen.
   4. Isolieren Sie Explanten aus dem tragenden Bereich der Femoralkondylen mit einem 3 mm Biopsie-Stanzer und lösen Sie sie von der Gelenkoberfläche, indem Sie mit einem Skalpell parallel zum subchondralen Knochen schneiden. Die harte Struktur des subchondralen Knochens sollte sicherstellen, dass Expflanzen keine verkalkte Matrix enthalten. Streben Sie nach Explants mit gleichmäßiger Höhe.
   5. Die Expflanzen sofort in DMEM/F12- GlutaMAX + 1% P/S Kulturmedium in einer 50 ml Tube oder Petrischale aufbewahren und mischen. Mischen Sie keine Expflanzen aus verschiedenen Kuhknien, sondern halten Sie sich für jede Studie getrennt.
2. Gewebekultivierung
   1. Übertragen Sie die Explants auf eine sterile 96-Well-Platte in einer laminaren Strömungshaube.
   2. Waschen Sie die Explants 3 mal in Kulturmedium oder PBS und kulturen Sie sie in 200 l Kulturmedium pro Brunnen bis zum Beginn des Experiments. Verwenden Sie eine Auswaschzeit von 1 Tag, um die zelluläre Aktivität der Biopsie und die passive Freisetzung von Biomarkern zu synchronisieren.
   3. Die Explantieren bis zu 10 Wochen in einem 37 °C Inkubator mit 5%_CO2. Platzieren Sie alle Replikationen innerhalb jeder Gruppe diagonal in der Kulturplatte, um die durch Verdunstung induzierte Variation zu minimieren. Um die Verdunstung des Überstandes weiter zu vermeiden, fügen Sie PBS an die äußeren Brunnen der Kulturplatte hinzu.

2. Rinderknorpelexplantationsbehandlung und Bewertung der metabolischen Aktivität

1. Kulturmedium Veränderung und Behandlung
   1. Ändern Sie das Kulturmedium alle 2-3 Tage in einer laminaren Strömungshaube.
   2. Wenn Sie irgendwelche Behandlungen anwenden, bereiten Sie diese vor dem Wechsel des Mediums vor. Bereiten Sie die Behandlungen auf die gewünschte Konzentration in den Explantbrunnen durch Verdünnung im Kulturmedium vor.
   3. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig von jedem Brunnen und übertragen Sie ihn auf eine neue 96-Wellplatte. Bewahren Sie den Überstand mit Dichtband bei 20 °C für die Biomarkeranalyse des Gewebeumsatzes und der Proteinexpression auf.
   4. Fügen Sie sofort 200 l frisches Kulturmedium oder Behandlung pro Brunnen hinzu. Lassen Sie die Explants während des mittleren Wechsels nicht austrocknen und stellen Sie sicher, dass alle Expflanzen vollständig in das neue Medium getaucht sind.
2. Resazurin Färbung
   1. Messen Sie die stoffwechselmetabolische Aktivität einmal wöchentlich als indirekte Messung der Zelllebensfähigkeit. Der Resazurin-Test ist eine einfache Möglichkeit zu beurteilen, ob sich die metabolische Aktivität der Explanten für eine einzelne Explantation aufgrund von Zelltod oder zellulären Veränderungen verschlechtert. Explanten im Kulturmedium allein haben während des gesamten Experimentierzeitraums eine relativ stabile Resazurin-Messung.
   2. Machen Sie eine Lösung der Kultur Medium mit 10% Resazurin.
   3. Ernten Sie den Überstand wie in Schritt 2.1.3 beschrieben.
   4. Die Expflanzen in 10% Resazurinlösung für 3 h bei 37 °C oder bis die Überstande violett werden. Schließen Sie 4 Brunnen ohne Explants als Hintergrundsteuerungen ein.
   5. Übertragen Sie die konditionierte und Hintergrundsteuerung Resazurin-Lösung auf eine schwarze Mikrotiterplatte und messen Sie fluoreszenz bei 540 nm Anregung/590 nm Emission.
   6. Waschen Sie gründlich 3 Mal in Kulturmedium oder PBS und tauchen Sie die Ex-Pflanzen in Waschmedium für 5-10 min, damit das Resazurin vollständig ausdiffus. Fügen Sie neue Kulturmedium oder Behandlungen, wenn verwendet.

3. Beendigung, Fixierung und Probenlagerung

1. Beendigung der Kultivierungsfrist
   1. Messen Sie die metabolische Aktivität, wie in Schritt 2.2 beschrieben. Fügen Sie 200 L PBS pro Brunnen hinzu.
2. Fixierung und Lagerung
   1. Entfernen Sie die PBS, fügen Sie 200 l Formaldehyd pro Brunnen hinzu und lassen Sie für 2 h bei Raumtemperatur.
   2. Das Formaldehyd entsorgen und 200 L PBS pro Brunnen hinzufügen. Bedecken Sie die Platte mit Dichtband und lagern Sie sie bei 4 °C für die histochemische Analyse. Wir empfehlen, die histochemische Analyse innerhalb von 3 Monaten durchzuführen.

4. Biomarker für den Gewebeumsatz (ELISA)

1. Indirekte wettbewerbsfähige ELISAs
   1. Beschichten Sie eine Streptavidin-Platte mit dem spezifischen biotinylierten Assay-Zielpeptid verdünnt 1:100 im Assaypuffer (100 l pro Brunnen) für 30 min bei 20 °C.
   2. 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und Probenüberstand (20 l pro Brunnen) zusammen mit primärem monoklonalen Antikörper gegen das Assay-Target-Peptid verdünnt 1:93,3 für ProC2 und 1:100 im Assaypuffer für AGNx1 (100 l pro Brunnen) und 2 h bei 20 °C inkubieren mit Schütteln für ProC2 und 3 h bei 20 °C für AGNx1.
      HINWEIS: Das Probenvolumen wird direkt von den gelagerten Überstandplatten entnommen. Wenn die gemessene Konzentration anicht im Test-Messbereich liegt, verdünnen Sie den Überstand in einer v-bodenförmigen Verdünnungsplatte in PBS oder Assaypuffer.
   3. 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und mit peroxidasemarkiertem Sekundärantikörper 1:100 im Assaypuffer (100 l pro Brunnen) für 1 h bei 20 °C inkubieren.
   4. 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und mit Schütteln 15 min im Dunkeln bei 20 °C mit Tetramethylbenzidin (TMB) als Peroxidasesubstrat (100 l pro Brunnen) bebrüten.
   5. Beenden Sie die Reaktion mit einer Standard-Stopplösung, 0,1 M H₂SO₄ (100 l pro Brunnen).
   6. Lesen Sie die kolorimetrische Reaktion bei 450 nm Absorption mit einer Referenzabsorption bei 650 nm auf einem Standard-Laborplattenleser.
2. Direkte wettbewerbsfähige ELISAs zur Messung des Knorpelgewebeumsatzes im Überstand
   HINWEIS: Dies quantifiziert C2M.
   1. Beschichten Sie eine Streptavidin-Platte mit spezifischem biotinylierten Assay-Target-Peptid verdünnt 1:100 im Assaypuffer (100 l pro Brunnen) für 30 min bei 20 °C.
   2. 5 Mal mit Waschpuffer waschen und Probenüberstand zusammen mit 100 l peroxidase-markiertem monoklonalen Antikörper gegen den Assay Target-Peptid verdünnt 1:100 im Assaypuffer (20 l pro Brunnen) hinzufügen. 20 h bei 2–8 °C mit Schütteln bebrüten.
      HINWEIS: Das Probenvolumen wird direkt von den gelagerten Überstandplatten entnommen. Wenn die gemessene Konzentration anicht im Test-Messbereich liegt, verdünnen Sie den Überstand in einer v-bodenförmigen Verdünnungsplatte in PBS oder Assaypuffer.
   3. 5 Mal mit Standard-Waschpuffer waschen und mit Schütteln 15 min im Dunkeln bei 20 °C mit TMB als Peroxidasesubstrat (100 l pro Brunnen) bebrüten.
   4. Beenden Sie die Reaktion mit einer Standard-Stopplösung, 0,1 M H₂SO₄ (100 l pro Brunnen).
   5. Lesen Sie die kolorimetrische Reaktion bei 450 nm Absorption mit einer Referenzabsorption bei 650 nm auf einem Standard-Laborplattenleser.
3. AGNx1
   1. Quantifizieren Sie den Aggrecan-Abbau, indem Sie die Freisetzung des AGNx1 Neo-Epitops messen. Dieser indirekte wettbewerbsfähige ELISA-Test zielt auf das aggrecan C-Terminal Peptid (NITEGE³⁷³) ab, das von ADAMTS-4 und 5 Spaltung erzeugt wird. Der monoklonale Antikörper erkennt alle Fragmente mit einem exponierten NITEGE-Epitop. Die experimentellen Einzelheiten des Assays wurden an anderer Stelle veröffentlicht¹⁹.
4. ProC2
   1. Quantifizieren Sie die Kollagenbildung typ II, indem Sie die Freisetzung des Profragments des Kollagentyps II messen. Dieser indirekte wettbewerbsfähige ELISA-Test zielt auf das Epitop des PIIBNP-Propeptids (QDVRQPG), das durch N-Propeptidasen beim Trimmen von neu synthetisiertem Typ-II-Kollagen erzeugt wird. Die experimentellen Einzelheiten des Assays wurden an anderer Stelle veröffentlicht¹⁶.
5. C2M
   1. Quantifizieren Sie den Kollagenabbau vom Typ II, indem Sie die Freisetzung des C2M-Neo-Epitop-Fragments messen. Dieser direkt konkurrenzfähige ELISA erkennt das MMP-gesponnene C-Terminal-Peptid (KPPGRDGAAG¹⁰⁵³). Dieser Assay unterscheidet sich von AGNx1 und ProC2, da er der primäre Antikörper ist, der peroxidase-markiert ist und somit als Detektor verwendet wird. Die experimentellen Einzelheiten des Assays wurden an anderer Stelle veröffentlicht²⁰.

5. Histologische Analyse

1. Infiltration, Einbettung und Schneiden
   1. Legen Sie die fixierten Explants (siehe Schritt 3.2) in einzeln beschriftete Kassetten. Fügen Sie sowohl ein Etikett in die Kassette als auch die Etikettenkassette ein, um die Identifizierung sicherzustellen.
   2. Übertragen Sie die Kassetten mit Explants auf eine Tissueprozessormaschine. Dann infiltrieren Sie die Expflanzen mit Paraffin in einer Reihe von Dehydrierung und Paraffin-Infiltrationsschritte.
      1. Mit 96% Ethanol für 90 min ohne Temperatureinstellung dehydrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
      2. Löschen Sie das Ethanol mit Toluin für 90 min ohne Temperaturanpassung. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 Mal.
      3. Das Ethanol mit Toluin 90 min bei 60 °C löschen.
      4. Mit Paraffinwachs 30 min bei 60 °C infiltrieren.
      5. Infiltrat mit Paraffinwachs für 60 min bei 60 °C.
      6. Infiltrat mit Paraffinwachs für 90 min bei 60 °C.
      7. Fügen Sie die Lösungen für jeden Schritt in die Probenkammer mit langsamen Pump-Out- und Pump-In-Strömen unter 33–34 kPa ein. Führen Sie den Infiltrationsprozess in einem Druck-/Vakuumzyklus mit einem maximalen Vakuum von 65 bis 70 kPa aus.
   3. Legen Sie die Kassetten nach dem Eindringen auf einen Heizblock, um eine sorgfältige Entfernung der Explants aus der Kassette zu ermöglichen. Die infiltrierten Expflanzen sanft in einzelne Paraffinblöcke einbetten. Mit erhitzten Zangen die Expflanzen mit dem oberflächlichen Gelenkknorpel und den subchondralen Knochenseiten senkrecht zur Schnittfläche platzieren, um die Visualisierung der verschiedenen Knorpelschichten innerhalb jedes Probenabschnitts zu gewährleisten.
   4. Schneiden Sie 5 m Abschnitte von gekühlten Paraffinblöcken mit eingebetteten Explants auf einem Mikrotom. Die Schnittabschnitte in ein Kaltwasserbad übertragen. Bei Bedarf können Abschnitte entweder mit einem Skalpell oder einem Deckglas getrennt werden.
   5. Übertragen Sie die Abschnitte mit einer unbeschichteten Glasrutsche vorsichtig in ein Warmwasserbad (50 °C), wo sich die Abschnitte entfalten. Heben Sie jeden Abschnitt auf eine beschriftete Abdeckungsrutsche und legen Sie sie 30 min auf eine Kochplatte.
   6. Die Dias in einen Korb geben und bei 60 °C 1 H bebrüten und dann bei 37 °C über Nacht aufbewahren. Danach lagern Sie Dias in geschlossenen Behältern bei 4 °C bis zur Färbung.
2. Safranin O/Fast Green Färbung und Visualisierung
   1. Legen Sie die zu befleckenden Dias in einen Korb und bebrüten die Dias bei 60 °C für 1 h.
   2. Bereiten und filtern Sie alle Reagenzien mit einem 0,45 mm Filter.
   3. In Vorbereitung auf die Färbung, gießen Sie die gefilterten Reagenzien in Becher nakers auf ein Volumen, das es den Lösungen ermöglicht, die Dias vollständig zu decken, wenn sie den Korb untertauchen. Die verwendeten Becher benötigten ein Volumen von 250 ml, um die Dias abzudecken.
   4. Entparaffinisieren Sie die geschmolzenen Dias, indem Sie den Korb zweimal für 10 min in Toluin, zweimal 99% Ethanol für 2 min, 96% Ethanol für 2 min zweimal und 70% Ethanol für 2 min zweimal untertauchen. Dann hydratisieren Sie die Rutschen in Wasser für 2 min.
   5. Die deparaffinierten und hydratisierten Dias färben, indem man den Korb in Weigerts Eisenhämatoxylinlösung (pH 1,5) 10 min untertauchen, einmal in 1% HCl eintauchen und mit fließendem Leitungswasser ca. 5 min oder bis überschüssige Farbe weggespült hat, eintauchen.
   6. Als nächstes in 0,05% Fast Green Lösung (pH: 5,75) für 5 min, tauchen Sie in 1% CH₃COOH einmal, und Flecken in 0,1% Safranin O (pH: 6,5) für 20 min.
   7. Dehydrieren und löschen Sie die Rutschen, indem Sie zweimal in 70% Ethanol, 96% Ethanol für 2 min zweimal, 99% Ethanol für 2 min zweimal und Zweimal Toluen 2 min.
   8. Montieren Sie die unbeschichteten Glasschlitten mit harzigem Medium, das die Histologie-Dias abdeckt.

Ergebnisse

Rinder-Explanten mit voller Tiefe wurden isoliert, kultiviert und 3 Wochen lang behandelt (Abbildung 1). Das Kulturmedium wurde mit der Zugabe der Behandlung 3 mal pro Woche verändert. Einmal wöchentlich wurde die metabolische Aktivität durch den Resazurin-Assay gemessen. Biomarker des ECM-Umsatzes wurden in dem Überstand gemessen, der dreimal pro Woche von der Kulturplatte geerntet wurde. Die Explanten wurden zur Behandlung in 4 Gruppen eingeteilt: 1) Oncostatin M und TNF (O+T); 2) O+T ...

Diskussion

Das hier vorgestellte Protokoll zur Profilierung des Knorpelgewebeumsatzes in Rinderknorpelexplanten kann zur Charakterisierung von Behandlungseffekten vieler Arten von Arzneimitteln verwendet werden, einschließlich Inhibitoren entzündlicher intrazellulärer Bahnen, proteolytische Enzyme oder anabole Wachstumsfaktoren.

In diesem Protokoll wurden zwei verschiedene Setups beschrieben: ein anaboles Setup, bei dem Exmodule mit Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) stimuliert wurden, und e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955