Un modello di cultura del tessuto Ex Vivo di Cartilage Rimodellamento in Esplants bovina del ginocchio

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive l'isolamento e la coltura di espiante cartilaginee dalle ginocchia bovine. Questo metodo fornisce uno strumento facile e accessibile per descrivere i cambiamenti dei tessuti in risposta a stimoli biologici o nuove terapie mirati all'articolazione.

Abstract

I sistemi di coltura Ex vivo coprono un'ampia gamma di esperimenti dedicati allo studio della funzione cellulare e dei tessuti in un ambiente nativo. La cartilagine è un tessuto unico importante per il corretto funzionamento dell'articolazione sinoviale ed è costituito da una densa matrice extracellulare (ECM), ricca di collagene proteoglicano e di tipo II. I condrociti sono l'unico tipo di cellula presente all'interno della cartilagine e sono diffusi e relativamente bassi nel numero. Gli stimoli esterni alterati e la segnalazione cellulare possono portare a cambiamenti nella composizione e nel deterioramento dell'ECM, che sono importanti segni patologici in malattie come l'osteoartrite (OA) e l'artrite reumatoide.

I modelli di cartilagine Ex vivo consentono la profilazione di 1) di alterazioni mediate da condrociti del turnover del tessuto cartilagineo, 2) visualizzando la composizione ECM della cartilagine e 3) riarrangiamento dei condrociti direttamente nel tessuto. La profilazione di queste alterazioni in risposta a stimoli o trattamenti è di grande importanza in vari aspetti della biologia della cartilagine e completa gli esperimenti in vitro in condrociti isolati, o modelli più complessi in animali vivi in cui le condizioni sperimentali sono più difficili da controllare.

Gli esepanti della cartilagine presentano un metodo traslazionale e facilmente accessibile per valutare il rimodellamento dei tessuti nella cartilagine ECM in ambienti controllabili. Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare gli esoti della cartilagine bovina viva. Il metodo utilizza tessuto dal ginocchio bovino, che è facilmente accessibile dalla macelleria locale. Sia gli espianti che il mezzo di coltura condizionata possono essere analizzati per studiare il turnover dei tessuti, la composizione ECM e la funzione di condrocite, profilando così la modulazione ECM.

Introduzione

I condrociti producono e mantengono la matrice della cartilagine. Per studiare la biologia dei condrociti e come loro e l'ECM circostante reagiscono a stimoli esterni, è fondamentale interrogarli nel loro ambiente nativo^1,2. Lo studio del turnover dei tessuti cartilanei è importante per aumentare la comprensione dei meccanismi sottostanti nelle malattie articolari come l'OA, una malattia per la quale attualmente non esiste un trattamento che modifichi la malattia. Di conseguenza, vi è una notevole necessità di migliori modelli di traduzione².

La caratterizzazione ex vivo degli effetti cellulari e tissutali è essenziale per completare altri modelli preclinici, sia in vitro, come le colture di motrice condrociti, sia in vivo, come i modelli oA indotti da interventi chirurgici o il modello di artrite autoimmune al collagene (CIA ). Numerosi studi hanno evidenziato le differenze tra il modo in cui le cellule si comportano nelle colture di monostrato 2D e nelle strutture 3D o nel loro tessuto nativo^3,4. Molte cellule negli strati 2D adottano morfologie innaturali, comprese le differenze nella polarità cellulare e nell'attaccamento dei tessuti, con conseguenti differenze visive e funzionali nelle cellule all'interno dei tessuti nativi⁵. Le differenze sono evidenti anche nella funzionalità delle cellule, che possono spostare l'espressione proteica, portando a modelli di differenziazione profondamente alterati, macchinari regolatori e funzionalità cellulare^{5,6,7 ,8}.

La cartilagine ECM consiste principalmente di collagene di tipo II che fornisce un quadro a matrice, e aggrecan, un proteoglicano che aiuta a trattenere il fluido all'interno del tessuto. Altre molecole matriciali come collagene di tipo IV, VI, IX, X, XI, XII, fibronectina, proteina oligomericica cartilaginea (COMP), biglycan, decorin e perlecan sono presenti anche⁹.

Mentre l'eziologia dell'OA rimane poco chiara^10,11, l'insorgenza della malattia si crede di essere causato da squilibri nel turnover dei tessuti e processi di riparazione^12,13. La degradazione della cartilagine articolare è un segno distintivo di OA. I condrociti residenti nella cartilagine o le cellule nei tessuti circostanti aumentano il loro rilascio di citochine, stimolando la produzione elevata di proteine come le metalloproteine a matrice (MMP) e le aggrecanasi, che aumentano la degradazione della cartilagine ECM ^14.Questa degradazione si traduce nel rilascio di piccoli frammenti proteici unici chiamati neo-epitopi, che possono essere quantificati nel siero, nelle urine o nel mezzo di coltura¹⁵. Dopo la formazione e la maturazione del collagene, vengono rilasciate anche le cosiddette proframmentazioni; questi possono essere quantificati come misura della produzione di matrici¹⁶.

Lo scopo di questo protocollo è quello di stabilire un modello di cartilagine ex vivo per confrontare l'effetto della stimolazione e/o del trattamento farmacologico sul turnover dei tessuti ECM. Il fatturato della cartilagine è profilato misurando i biomarcatori neo-epitopi derivanti dalla matrice direttamente nel mezzo di coltura condizionata utilizzando ELISA: AGNx1 (riflettendo l'attività dell'aggrecanasi), C2M (che riflette l'attività MMP a matrice) e ProC2 (riflettendo il collagene di tipo II) formazione). I risultati possono essere verificati dalla colorazione istologica dell'ECM, che visualizza anche l'organizzazione dei condrociti nei singoli espianti. Il protocollo descritto può essere utilizzato per testare l'effetto di nuovi trattamenti sulla funzione condrocite e sulla cartilagine turnover ECM. Una serie di studi ha utilizzato espianti della cartilagine per descrivere i processi biologici o l'effetto dell'intervento sugli espianti sfidati con citochine utilizzando approcci quantitativi istologici o immunohistochimici, mRNA, espressione proteica o proteomica^{2 ,17,18}. Tuttavia, questi protocolli esulano dall'ambito del manoscritto corrente.

Protocollo

1. Isolamento dei tessuti

1. Approvvigionamento dei tessuti
   1. Eseguire l'intera sezione di approvvigionamento dei tessuti all'esterno di una cappa a flusso laminare in un ambiente asettico.
   2. Dal macello locale, ottenere un'intera articolazione tibiofemorale del ginocchio bovino fresco dai vitelli tra 1,5 e 2 anni di età.
   3. Sezionare delicatamente il ginocchio del polpaccio rimuovendo prima la carne in eccesso, scoprendo i condili, il menisco, i tendini e la membrana sinoviale. Tagliare i tendini e la membrana sinoviale, permettendo all'articolazione di smembrare. Rimuovere il menisco per esporre i condili femorali.
   4. Isolare gli espianti dall'area portante dei condili femorali utilizzando un perforatore biopsia da 3 mm e rilasciarli dalla superficie articolare tagliando con un bisturi parallelo e il più vicino possibile all'osso subcondrale. La struttura dura dell'osso subcondrale dovrebbe garantire che gli espianti non contengano matrice calcificata. Sforzatevi di espianti con altezza uniforme.
   5. Conservare e mescolare immediatamente gli espianti in DMEM/F12- GlutaMAX - 1% di supporto di coltura P/S in un tubo da 50 mL o piatto Petri. Non mescolare espianti da ginocchia di mucca diverse, ma tenere separati per ogni studio.
2. Coltura di tessuti
   1. Trasferire gli espianti in una piastra sterile da 96 po' di terreno in un cappuccio a flusso laminare.
   2. Lavare gli espianti 3 volte in mezzo di coltura o PBS e coltura in 200 , L di mezzo di coltura per pozzo fino all'inizio dell'esperimento. Utilizzare un periodo di lavaggio di 1 giorno per sincronizzare l'attività cellulare biopsia e il rilascio passivo di biomarcatori.
   3. Cultura degli espianti fino a 10 settimane in un'incubatrice a 37 gradi centigradi con 5% di CO₂. Posizionare tutte le repliche all'interno di ogni gruppo diagonalmente nella piastra di coltura per ridurre al minimo la variazione indotta dall'evaporazione. Per evitare ulteriormente l'evaporazione del supernatante, aggiungere PBS ai pozzetti esterni della piastra di coltura.

2. Trattamento degli espiantatori della cartilagine bovina e valutazione dell'attività metabolica

1. Coltura medio cambiamento e trattamento
   1. Cambiare il mezzo di coltura ogni 2-3 giorni in una cappa di flusso laminare.
   2. Se si applicano trattamenti, prepararli prima di cambiare il mezzo. Preparare i trattamenti alla concentrazione desiderata nei pozzi espiante per diluizione nel mezzo di coltura.
   3. Rimuovere delicatamente il supernatante da ogni pozzo e trasferirlo in una nuova piastra 96 pozzo. Conservare il supernatante con nastro adesivo a 20 gradi centigradi per l'analisi dei biomarcatori del turnover dei tessuti e dell'espressione proteica.
   4. Aggiungere immediatamente 200 l di fresco mezzo di coltura o trattamento per pozzo. Non lasciare che gli espianti si asciughino durante il cambio medio e assicurarsi che tutti gli espianti siano completamente sommersi nel nuovo mezzo.
2. Colorazione di Resazurin
   1. Misurare l'attività metabolica una volta alla settimana come una misurazione indiretta della vitalità cellulare. Il test di resazurina è un modo semplice per valutare se l'attività metabolica degli espiantatori si deteriora per un singolo espianto a causa della morte cellulare o dei cambiamenti cellulari. Gli esepanti nel mezzo di coltura da soli hanno una lettura relativamente stabile di retozurina durante tutto il periodo dell'esperimento.
   2. Rendere una soluzione di mezzo di coltura con 10% resazurin.
   3. Raccogliere il supernatante come descritto al punto 2.1.3.
   4. Immergere gli espianti in una soluzione di resazurina del 10% per 3 h a 37 gradi centigradi o fino a quando i supernatanti non diventano viola. Includere 4 pozzi senza espiante come controlli di sfondo.
   5. Trasferire la soluzione di resazurina di controllo condizionato e di background in una piastra di microtitro nero e misurare la fluorescenza a 540 nm eccitazione/590 nm di emissione.
   6. Lavare accuratamente 3 volte in mezzo di coltura o PBS e immergere gli espianti nel mezzo di lavaggio per 5-10 min per consentire alla resazurina di diffondersi completamente. Aggiungere un nuovo mezzo di coltura o trattamenti se utilizzati.

3. Terminazione, fissaggio e archiviazione dei campioni

1. Interruzione del periodo di coltura
   1. Misurare l'attività metabolica come descritto al punto 2.2. Aggiungere 200 l di PBS per pozzo.
2. Fissaggio e stoccaggio
   1. Rimuovere il PBS, aggiungere 200 l di formaldeide per pozzo, e lasciare per 2 h a temperatura ambiente.
   2. Smaltire la formaldeide e aggiungere 200 l di PBS per bene. Coprire la piastra con del nastro adesivo e conservare a 4 gradi centigradi per l'analisi istochimica. Si consiglia di eseguire analisi istochimiche entro 3 mesi.

4. Biomarcatori del fatturato dei tessuti (ELISA)

1. ELa Concorrenza indiretta concorrenziale
   1. Cappotto una piastra di streptavidin con il saggio biotinylato specifico target-peptide diluito 1:100 in tampone di altalina (100 -L per pozzo) per 30 min a 20 gradi centigradi.
   2. Lavare 5 volte con buffer di lavaggio standard e aggiungere un campione-supernatante (20 gradi al pozzo) insieme all'anticorpo monoclonale primario contro l'analisi bersaglio-peptide diluito 1:93.3 per ProC2 e 1:100 in cuscinetto di assaggio per AGNx1 (100 gradi al pozzo) e incubare per 2 h a 20 gradi centigradi con agitazione per ProC2 e 3 h a 20 gradi centigradi per AGNx1.
      NOTA: il volume del campione viene prelevato direttamente dalle piastre sovrnatali immagazzinate. Se la concentrazione misurata è al di fuori dell'intervallo di misurazione dell'analisi, diluire il supernatante in una piastra di diluizione con fondo a V in PBS o buffer di analisi.
   3. Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio standard e incubare con anticorpo secondario con etichetta perossidasi diluito 1:100 nel tampone di analisi (100 l per pozzo) per 1 h a 20 gradi centigradi.
   4. Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio standard e incubare con agitazione per 15 min al buio a 20 gradi centigradi con tetramethylbenzidine (TMB) come substrato perossidasi (100 luna per pozzo).
   5. Terminare la reazione con soluzione di arresto standard, 0,1 M H₂SO₄ (100 l per pozzo).
   6. Leggere la reazione colorimetrica a 450 nm assorbimento utilizzando un assorbimento di riferimento a 650 nm su un lettore di lastre di laboratorio standard.
2. ELAS competitive dirette per la misurazione del turnover del tessuto cartilagineo nel supernatante
   NOTA: questo quantifica C2M.
   1. Cappotto una piastra di streptavidin con un saggio biotinylato specifico target-peptide diluito 1:100 in tampone di aspo (100 -L per pozzo) per 30 min a 20 gradi centigradi.
   2. Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio e aggiungere un campione-supernatante insieme a 100 l di anticorpo monoclonale con etichetta perossidase contro il pone target-peptide diluito 1:100 nel buffer di analisi (20L per pozzo). Incubare per 20 h a 2-8 gradi centigradi con agitazione.
      NOTA: il volume del campione viene prelevato direttamente dalle piastre sovrnatali immagazzinate. Se la concentrazione misurata è al di fuori dell'intervallo di misurazione dell'analisi, diluire il supernatante in una piastra di diluizione con fondo a V in PBS o buffer di analisi.
   3. Lavare 5 volte con il buffer di lavaggio standard e incubare con agitazione per 15 min al buio a 20 gradi centigradi con TMB come substrato perossidase (100 l per pozzo).
   4. Terminare la reazione con soluzione di arresto standard, 0,1 M H₂SO₄ (100 l per pozzo).
   5. Leggere la reazione colorimetrica a 450 nm assorbimento con un assorbimento di riferimento a 650 nm su un lettore di lastre di laboratorio standard.
3. AGNx1
   1. Quantificare la degradazione dell'aggrecan misurando il rilascio del neo-epitopo AGNx1. Questo analisi eLISA competitivo indiretto si rivolge al peptide aggrecan C-terminal (NITEGE³⁷³) generato da ADAMTS-4 e 5 scissione. L'anticorpo monoclonale riconosce tutti i frammenti con un epitopo NITEGE esposto. I dettagli sperimentali del saggio sono stati pubblicati altrove¹⁹.
4. ProC2 (in via ProC2)
   1. Quantificare la formazione di collagene di tipo II misurando il rilascio della proframmentazione del collagene di tipo II. Questo test ELISA competitivo indiretto si rivolge all'epitopo del propeptide PIIBNP (QDVRQPG) generato da N-propeptidases durante il taglio del collagene di tipo II appena sintetizzato. I dettagli sperimentali del saggio sono stati pubblicati altrove¹⁶.
5. C2M (in modo int
   1. Quantificare la degradazione del collagene di tipo II misurando il rilascio del frammento neo-epitopo C2M. Questo ELISA, competitivo diretto, riconosce il peptide del terminale C MMP (KPPGRDGAAG^1053). Questo saggio differisce da AGNx1 e ProC2 in quanto è l'anticorpo primario che è etichettato perossidasi e quindi, utilizzato come rivelatore. I dettagli sperimentali del saggio sono stati pubblicati altrove²⁰.

5. Analisi istologica

1. Infiltrazione, incorporamento e taglio
   1. Posizionare gli espianti fissati (vedere il punto 3.2) in cassette etichettate singolarmente. Includere sia un'etichetta all'interno della cassetta che le cassette per garantire l'identificazione.
   2. Trasferire le cassette contenenti espianti in una macchina per robot tessuti. Poi infiltrati nelle espiante con paraffina in una serie di gradini di disidratazione e infiltrazione della paraffina.
      1. Disidratare con 96% etanolo per 90 min senza regolazione della temperatura. Ripetere questo passaggio 3 volte.
      2. Pulire l'etanolo con toluene per 90 min senza regolazione della temperatura. Ripetere questo passaggio 2 volte.
      3. Cancellare l'etanolo con toluene per 90 min a 60 gradi centigradi.
      4. Infiltrarsi con la cera di paraffina per 30 min a 60 gradi centigradi.
      5. Infiltrarsi con la cera di paraffina per 60 min a 60 gradi centigradi.
      6. Infiltrarsi con la cera di paraffina per 90 min a 60 gradi centigradi.
      7. Per ogni fase, aggiungere le soluzioni nella camera campione con flussi di pompaggio e pompaggio lenti al di sotto di 33-34 kPa. Eseguire il processo di infiltrazione in un ciclo di pressione/vuoto con un vuoto massimo da 65 a 70 kPa.
   3. Dopo l'infiltrazione, posizionare le cassette su un blocco riscaldante per consentire un'attenta rimozione degli espianti dalla cassetta. Incorporare delicatamente le espiante infiltrate in singoli blocchi di paraffina. Con pinze riscaldate, posizionare gli espianti con la cartilagine articolare superficiale e i lati ossei subcondrici perpendicolarmente alla superficie di taglio, garantendo la visualizzazione dei diversi strati della cartilagine all'interno di ogni sezione del provino.
   4. Tagliare 5 sezioni di blocchi di paraffina raffreddati con espianti incorporati su un microtoma. Trasferire le sezioni tagliate in un bagno d'acqua fredda. Se necessario, le sezioni possono essere separate utilizzando un bisturi o un vetro di copertura.
   5. Utilizzando con cura uno scivolo di vetro non rivestito, trasferire le sezioni in un bagno d'acqua calda (50 gradi centigradi), dove si dispiegano le sezioni. Sollevare ogni sezione su uno scivolo di copertura etichettato e posizionarlo su una piastra calda per 30 min.
   6. Mettete i vetrini in un cesto e incubatevi a 60 gradi centigradi per 1 h, quindi conservateli durante la notte a 37 gradi centigradi. In seguito, conservare i vetrini in contenitori chiusi a 4 gradi centigradi fino a colorare.
2. Safranin O/Fast Green colorazione e visualizzazione
   1. Posizionare i vetrini da macchiare in un cesto e incubare i vetrini a 60 gradi centigradi per 1 ora.
   2. Preparare e filtrare tutti i reagenti con un filtro da 0,45 mm.
   3. In preparazione per la colorazione, versare i reagenti filtrati in becher in un volume che permette alle soluzioni di coprire completamente i vetrini durante l'immergenza del cestello. I becher utilizzati richiedevano un volume di 250 mL per coprire i vetrini.
   4. Deparaffinare i vetrini fusi sommergendo il cestello in toluene per 10 min due volte, 99% etanolo per 2 min due volte, 96% etanolo per 2 min due volte, e 70% etanolo per 2 min due volte. Quindi, idratare i vetrini in acqua per 2 min.
   5. Macchiare i vetrini deparati e idratati immergendo il cestello nella soluzione Iron Hematoxylin di Weigert (pH 1,5) per 10 minuti, immergere in 1% HCl una volta, e risciacquare con acqua corrente del rubinetto per circa 5 minuti o fino a quando il colore in eccesso è lavato via.
   6. Successivamente, macchia in 0.05% Fast Green soluzione (pH: 5.75) per 5 min, tuffo in 1% CH₃COOH una volta, e macchia in 0.1% Safranin O (pH: 6.5) per 20 min.
   7. Disidratare e svuotare i vetrini immergendo due volte nel 70% di etanolo, 96% etanolo per 2 min due volte, 99% etanolo per 2 min due volte, e toluene 2 min due volte.
   8. Montare i vetrini in vetro non rivestiti con un mezzo resinoso che copre i vetrini dell'istologia.

Risultati

Gli espianti bovini a fondo sono stati isolati, coltivati e trattati per 3 settimane(Figura 1). Il mezzo di coltura è stato cambiato con l'aggiunta di trattamento 3 volte a settimana. Una volta settimanalmente, l'attività metabolica è stata misurata dall'assaggio di resazurina. I biomarcatori del turnover di ECM sono stati misurati nel supernatore raccolto dalla piastra di coltura 3 volte a settimana. Gli esepanti sono stati divisi in 4 gruppi per il trattamento: 1) Oncostatin M e TNF ( 2...

Discussione

Il protocollo qui presentato per la profilazione del ricambio dei tessuti cartilari negli espepoli della cartilagine bovina può essere utilizzato per caratterizzare gli effetti di trattamento di molti tipi di farmaci, tra cui inibitori delle vie infiammatorie intracellulari, inibitori di enzimi proteolitici, o fattori di crescita anabolizzanti.

In questo protocollo sono state descritte due diverse impostazioni: un setup anabolizzante in cui gli espianti sono stati stimolati con fattore di cre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955