牛膝外生软骨重塑的外骨组织培养模型

摘要

在这里，我们提出一个协议，描述分离和培养软骨外植从牛膝盖。这种方法提供了一个简单易懂的工具，用于描述组织变化，以响应生物刺激或针对关节的新型治疗。

摘要

外体培养系统涵盖广泛的实验，致力于在原生环境中研究组织和细胞功能。软骨是一种独特的组织，对结膜关节的正常运作非常重要，由密集的细胞外基质（ECM）组成，富含蛋白酶和II型胶原蛋白。软骨细胞是软骨中唯一的细胞类型，广泛存在且数量相对较少。改变的外部刺激和细胞信号可导致ECM成分的变化和恶化，这是骨关节炎（OA）和风湿性关节炎等疾病的重要病理特征。

前软骨模型允许1）分析软骨细胞介导的软骨组织周转改变，2）可视化软骨ECM组合，和3）软骨细胞直接在组织中重新排列。分析这些改变对刺激或治疗的反应在软骨生物学的各个方面非常重要，并补充在分离的软骨细胞体外实验，或在实验条件的活体动物中更复杂的模型更难控制。

软骨外植植物提供了一种翻译和易于访问的方法，用于在可控设置下评估软骨 ECM 中的组织重塑。在这里，我们描述了一个分离和培养活牛软骨外植植物的协议。该方法使用来自牛膝的组织，从当地的屠宰场很容易获得。可以分析外植和条件培养基，以研究组织周转、ECM组成和软骨细胞功能，从而分析ECM调制。

引言

软骨细胞产生并维持软骨基质。为了研究软骨细胞的生物学，以及它们和周围的ECM对外部刺激的反应，在它们的原生环境中询问^它们1，2是至关重要的。研究软骨组织周转对于增进对关节疾病（如OA）的基本机制的理解非常重要，OA是一种目前尚无疾病改变治疗的疾病。因此，迫切需要更好的翻译^模型2。

细胞和组织效应的外体表征对于补充其他临床前模型至关重要，包括体外模式，如软骨细胞单层培养，以及体内，如手术诱导的OA模型或自身免疫胶原蛋白诱发关节炎模型（CIA).许多研究都强调了细胞在2D单层培养和3D结构或其原生^组织3、4中行为方式之间的差异。二维层中的许多细胞采用非自然形态，包括细胞极性和组织附着性的差异，导致原生组织细胞的视觉和功能^差异5。这些差异在细胞的功能上也很明显，这可能改变蛋白质表达，导致分化模式、调节机制和细胞功能发生深刻变化^{5，6，7 ，8}.

软骨ECM主要由II型胶原蛋白组成，提供基质框架，以及帮助在组织内保留液体的蛋白酶。其他基质分子，如胶原蛋白IV型、VI型、IX型、X型、十一种、十二种、纤维素、软骨寡聚蛋白（COMP）、大脂蛋白、分体素和渗透素也^存在9。

虽然OA的病因仍^{不清楚10，11，}疾病的发病被认为是由组织周转和修复过程的不平衡^{造成的12，13。}关节软骨的退化是OA的标志。软骨驻留软骨细胞或周围组织中的细胞增加细胞因子的释放，刺激基质金属蛋白酶 （MmPs） 和 agacanas 等蛋白酶的增产，从而增加软骨 ECM 的降解^14.这种降解导致小的独特蛋白质片段的释放，称为新表位，可以在血清、尿液或培养培养^基15中量化。在胶原蛋白形成和成熟时，所谓的蛋白酶也被释放;这些可以量化为矩阵生产的度量^16。

该协议的目的是建立一个体外软骨模型，以比较刺激和/或药物治疗对ECM组织周转的影响。软骨周转率是通过使用 ELISA:AGNx1（反射阿胶酶活性）、C2M（反映基质 MMP 活性）和 ProC2（反映类型 II 胶原蛋白）直接在条件培养基中测量基质衍生的新表位生物标志物来分析的形成）。这些发现可以通过ECM的组织染色来验证，这也形象化了软骨细胞在个别外植中的组织。所述方案可用于测试新疗法对软骨细胞功能和软骨ECM周转的影响。许多研究使用软骨外植来描述生物过程或干预对细胞因子挑战的外植的影响，使用定量组织学或免疫组织化学方法，mRNA，蛋白质表达，或蛋白质组^{学2 ，17，18}.但是，这些协议超出了当前手稿的范围。

研究方案

1. 组织隔离

1. 组织采购
   1. 在无菌环境中在层流罩外执行整个组织采购部分。
   2. 从当地的屠宰场，从1.5至2岁的小牛那里获得整个新鲜牛的膝关节。
   3. 通过首先去除多余的肉，揭开小腿、月经、肌腱和肌膜，轻轻解剖小腿膝盖。切割肌腱和肌膜，使关节肢解。取出半月板，露出股骨。
   4. 使用 3 mm 活检打孔机从股骨的承重区域分离出外植物，并通过用平行于和尽可能靠近亚孔拉骨的手术刀将其从关节表面释放。亚孔拉骨的硬结构应确保外植体不含钙化基质。努力为身高均匀的外植。
   5. 立即在 DMEM/F12- GlutaMAX + 1% P/S 培养基中储存和混合外植，在 50 mL 管或培养皿中。不要混合不同牛膝盖的外植，但每次研究都分开。
2. 组织培养
   1. 将外植转移到层流罩中的无菌 96 孔板中。
   2. 在培养基或PBS中清洗外植3次，并在每井200μL培养培养基，直到实验开始。使用1天的冲洗期同步活检细胞活性和被动生物标志物释放。
   3. 在37°C的培养箱中培养排泄时间长达10周，其中5%_为CO2。将每个组内的所有复制沿角线放置在培养板中，以尽量减少蒸发引起的变异。为进一步避免上清液蒸发，在培养板的外孔中加入PBS。

2. 牛软骨外植治疗及代谢活性评估

1. 培养媒介的改变与治疗
   1. 在层流罩中每 2-3 天更换一次培养基。
   2. 如果应用任何治疗，在更换介质之前准备这些。通过在培养基中稀释，准备对植物井中需要浓度的处理。
   3. 轻轻地从每个井中取出上清液，并将其转移到新的 96 孔板。将上清液与密封胶带储存在+20°C，用于组织周转和蛋白质表达的生物标记分析。
   4. 立即添加200μL的新鲜培养基或每口治疗。不要让外植在介质变化期间干燥，并确保所有外植完全浸入新的介质中。
2. 雷萨祖林染色
   1. 每周测量一次代谢活动，作为细胞活力的间接测量。resazurin 测试是评估植物外的代谢活性是否因细胞死亡或细胞变化而恶化的简便方法。仅在培养基中，植物在整个实验阶段都有相对稳定的再沙林读数。
   2. 用10%的再沙林解决培养介质。
   3. 如步骤 2.1.3 所述，收获上清液。
   4. 在37°C下或直到上生物变成紫色时，将外植液浸入10%的resazurin溶液中3小时。包括 4 口没有外泄的井作为背景控制。
   5. 将调节和背景控制resazurin溶液转移到黑色微子板，并在540nm激发/590nm发射时测量荧光。
   6. 在培养基或PBS中彻底清洗3次，将外植在洗涤培养基中浸入5-10分钟，使resazurin完全扩散。使用时添加新培养基或处理方法。

3. 终止、固定和示例存储

1. 终止培养期
   1. 测量步骤 2.2 中描述的代谢活动。每口井添加 200 μL 的 PBS。
2. 固定和存储
   1. 取出PBS，每口井加入200μL甲醛，在室温下保持2小时。
   2. 处理甲醛，每口井加入200μL的PBS。用密封胶带盖住盘子，并储存在4°C处进行化学分析。我们建议在3个月内进行分析分析。

4. 组织周转生物标志物（ELISA）

1. 间接竞争市场
   1. 在测定缓冲液（每孔100 μL）中涂上特定的生物素化测定靶肽1:100，在20°C下涂30分钟。
   2. 使用标准洗涤缓冲液洗涤 5 次，在 20°C 的检测靶蛋白肽中针对测定靶蛋白肽 1:93.3 和 1:100 在 AGNx1（每口井 100 μL）下加入样品上清液（每口 20 μL），并在 20°C 下孵育 2 小时与摇动 ProC2 和 3 h 在 20 °C AGNx1。
      注: 样品体积直接从存储的上清板中抽取。如果测量的浓度超过测定测量范围，在PBS或测定缓冲液中的V-底部稀释板中稀释上清液。
   3. 用标准洗涤缓冲液洗涤5次，在测定缓冲液（每口100μL）中用过氧化物酶标记的二级抗体孵育1:100，在20°C下孵育1小时。
   4. 用标准洗涤缓冲液洗涤5次，在黑暗中用四甲基苯胺（TMB）作为过氧化物酶基质（每口100μL）在黑暗中摇15分钟。
   5. 使用标准停止溶液 0.1 M H₂SO_4（每口 100 μL）结束反应。
   6. 在标准实验室板读取器上使用 650 nm 的参考吸光，在 450 nm 吸收时读取色度反应。
2. 用于测量上清的软骨组织周转率的直接竞争 ELISA
   注:这量化了 C2M。
   1. 在测定缓冲液（每孔100 μL）中涂上特定生物素化测定靶肽1:100，在20°C下涂30分钟。
   2. 用洗涤缓冲液洗涤5次，在检测缓冲液（每口20μL）中，将100μL的过氧化物酶标记单克隆抗体与测定靶肽稀释1:100一起加入样品上清液。在2~8°C下孵育20小时，摇动。
      注: 样品体积直接从存储的上清板中抽取。如果测量的浓度超过测定测量范围，在PBS或测定缓冲液中的V-底部稀释板中稀释上清液。
   3. 用标准洗涤缓冲液洗涤5次，在黑暗中用TMB作为过氧化物酶基质（每口100μL）在黑暗中摇15分钟。
   4. 使用标准停止溶液 0.1 M H₂SO_4（每口 100 μL）结束反应。
   5. 在标准实验室板读取器上读取 450 nm 吸光度下具有 650 nm 参考吸光度的色度反应。
3. AGNx1
   1. 通过测量 AGNx1 新表位的释放来量化 agcan 降解。这种间接竞争的ELISA测定针对ADAMTS-4和5裂解产生的agacan C-终端肽（NITEGE^373）。单克隆抗体识别所有片段与暴露的NITEGE表位。该测定的试验细节^已于19日在其他地方公布。
4. ProC2
   1. 通过测量 II 型胶原蛋白的释放，量化 II 型胶原蛋白的形成。这种间接竞争的ELISA测定针对新合成II型胶原蛋白修剪过程中N-前列腺苷酸酶产生的PIIBNP原肽（QDVRQPG）的表位。该测定的试验细节已^发表在16日的其他位置。
5. C2M
   1. 通过测量C2M新表位片段的释放，量化II型胶原蛋白降解。这种直接竞争的ELISA识别MMP-裂口C-终端肽（KPPGRDGAAG¹⁰⁵³）。此测定方法不同于 AGNx1 和 ProC2，因为它是标有过氧化物酶的主要抗体，因此用作检测器。该测定的试验细节^已于20日在其他地方公布。

5. 组织学分析

1. 渗透、嵌入和切割
   1. 将固定外植放入单独标记的盒式磁带中（参见步骤 3.2）。在盒式磁带和标签盒中同时包含标签，以确保识别。
   2. 将含有外植的盒式磁带转移到组织处理机。然后用石蜡在一系列脱水和石蜡渗透步骤中渗入植物外。
      1. 用96%乙醇脱水90分钟，无需温度调节。重复此步骤 3 次。
      2. 用苯清除乙醇90分钟，无需调节温度。重复此步骤 2 次。
      3. 在60°C下用苯清除乙醇90分钟。
      4. 在60°C下用石蜡渗透30分钟。
      5. 在60°C下用石蜡渗透60分钟。
      6. 在60°C下用石蜡渗透90分钟。
      7. 对于每个步骤，在 33*34 kPa 以下的缓慢泵出和泵入流量的情况下，将溶液添加到样品室中。在最大真空为 +65 至 +70 kPa 的压力/真空循环中运行渗透过程。
   3. 渗透后，将盒式磁带放在加热块上，以便小心地从盒中取出外植物。轻轻地将渗入的外植植物嵌入到单独的石蜡块中。用加热钳子，将表面关节软骨和垂直于切割表面的亚孔拉骨侧放置外部，确保每个试样部分内不同软骨层的可视化。
   4. 在微体上切割5μm的冷却石蜡块，并植入外植物。将切割部分转移到冷水浴中。如有必要，可以使用手术刀或盖玻璃分隔部分。
   5. 小心使用未涂布玻璃滑动，将部分转移到温水浴（50°C），其中部分展开。将每个部分提升到贴有标签的盖板上，并放在热板上 30 分钟。
   6. 将幻灯片放入篮子中，在 60°C 孵育 1 小时，然后在 37°C 下过夜。之后，将幻灯片存放在4°C的封闭容器中，直到染色。
2. 萨夫兰宁 O/快速绿色染色和可视化
   1. 将要染色的幻灯片放入篮子中，并在 60°C 孵育幻灯片 1 小时。
   2. 使用 0.45 mm 过滤器制备和过滤所有试剂。
   3. 为准备染色，将过滤过的试剂倒入烧杯中，使其体积允许溶液在浸入篮筐时完全覆盖滑轨。使用的烧杯需要 250 mL 的体积才能覆盖幻灯片。
   4. 将熔化的滑片浸入甲苯中10分钟，2分钟使用99%乙醇2分钟，2分钟使用96%乙醇2分钟，2分钟将70%乙醇两次浸入70%乙醇。然后，将滑梯在水中水合2分钟。
   5. 将水粉和水分浸渍在威格特的铁血氧林溶液（pH 1.5）中浸入篮子10分钟，浸入1%的HCl中，用自来水冲洗约5分钟，或直到多余的颜色被冲走。
   6. 接下来，染色在0.05%快速绿色溶液（pH:5.75）5分钟，浸在1%CH₃COOH一次，污渍在0.1%萨夫兰宁O（pH:6.5）20分钟。
   7. 两次浸渍70%乙醇，2分钟2分钟96%乙醇，2分钟两次99%乙醇，2分钟两次，2分钟使用环苯2分钟，两次浸湿， 脱水和清除滑轨。
   8. 用树脂介质安装无涂层玻璃玻片，覆盖于活动学幻灯片上。

结果

牛全深度外植被隔离、培养和治疗3周（图1）。培养基因每周增加3次治疗而改变。每周一次，通过resazurin测定测量代谢活性。ECM周转的生物标志物在从培养板收获的上清液中测量，每周3次。外植被分为4组进行治疗:1）青花青丁丁和TNF+（O+T）;2） O+T = GM6001 （GM6001）;3） 胰岛素，如生长因子-1（IGF-1）;4） 无处理的控件（w/o）。

代谢活动。

...

讨论

这里提出的用于分析牛软骨外植的软骨组织周转率的协议可用于描述许多类型药物的治疗效果，包括炎症细胞内通路的抑制剂、抑制药物的蛋白解物酶，或合成代谢生长因子。

该协议描述了两种不同的设置:一种是合成代谢设置，其中外植用胰岛素样生长因子1（IGF-1）刺激;另一种代谢设置，包括TNF-α和Oncostatin M的刺激，其中组织周转率可以使用广谱MMP抑制剂抑制。该方法的主...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955