소 무릎 이식에서 연골 리모델링의 전 생체 외 조직 문화 모델

요약

여기에서, 우리는 소 무릎에서 연골 이식의 격리 및 배양을 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 관절을 표적으로 하는 생물학적 자극 또는 새로운 치료법에 반응하여 조직 변화를 설명하기 위한 쉽고 접근가능한 도구를 제공한다.

초록

Ex vivo 배양 시스템은 네이티브 환경에서 조직 및 세포 기능을 연구하는 데 전념하는 광범위한 실험을 다룹니다. 연골은 활액 관절의 적절한 기능에 중요한 독특한 조직이며, 프로테오글리칸과 타입 II 콜라겐이 풍부한 조밀한 세포외 매트릭스(ECM)로 구성됩니다. 연골 세포는 연골 내에 존재하는 유일한 세포 유형이며 광범위하고 상대적으로 숫자가 낮습니다. 변경된 외부 자극 및 세포 신호는 골관절염 (OA) 및 류마치스성 관절염과 같은 질병에 있는 중요한 병리학 적인 특징인 ECM 조성 그리고 열화에 있는 변경으로 이끌어 낼 수 있습니다.

Ex vivo 연골 모델은 1) 연골 조직 회전율의 연골 세포 매개 변경의 프로파일링을 허용하고, 2) 연골 ECM 조성물을 시각화하고, 3) 연골 세포 재배열을 조직에서 직접 재배열할 수 있다. 자극 또는 치료에 대한 응답으로 이러한 변경을 프로파일링은 연골 생물학의 다양한 측면에서 매우 중요하며, 분리 된 연골 세포에서 시험관 내 실험, 또는 실험 조건이있는 살아있는 동물의 복잡한 모델을 보완합니다. 제어하기가 더 어렵습니다.

연골 전지는 제어 가능한 설정에서 연골 ECM에서 조직 리모델링을 평가하기위한 번역 및 쉽게 접근 할 수있는 방법을 제시한다. 여기에서, 우리는 살아있는 소 연골 이식을 격리하고 배양하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 소 무릎의 조직을 사용하며, 현지 도축장에서 쉽게 접근 할 수 있습니다. 이식 및 컨디셔닝 된 배양 배지 모두 조직 회전율, ECM 조성 및 연골 세포 기능을 조사하기 위해 분석 될 수 있으며, 따라서 ECM 변조를 프로파일링합니다.

서문

연골 세포는 연골 매트릭스를 생성하고 유지합니다. 연골 세포의 생물학을 연구하고 그들과 주변 ECM이 외부 자극에 어떻게 반응하는지 연구하기 위해서는 그들의 모국 환경에서 심문하는 것이 중요합니다^1,2. 연골 조직 회전율을 공부하는 것은 OA와 같은 합동 질병에 있는 근본적인 기계장치의 이해를 증가시키기 위하여 중요합니다, 질병 은 현재 아무 질병 변경 처리도 없습니다. 따라서 더 나은 번역 모델^2에대한 상당한 필요성이 있습니다.

세포 및 조직 효과의 생체 내 특성화는 연골세포 단층 배양과 같은 체외 및 생체 내, 수술 유발 OA 모델 또는 자가면역 콜라겐 유도 관절염 모델(CIA)을 보완하는 데 필수적입니다. ). 수많은 연구는 세포가 2D 단층 배양과 3D 구조또는 그들의 기본 조직에서 어떻게 행동하는지의 차이를 강조했다^3,4. 2D 층의 많은 세포는 세포 극성과 조직 부착의 차이를 포함하여 부자연스러운 형태를 채택하여 기본 조직 내의 세포에서 시각적 및 기능적 차이를 모두^{초래합니다 5.} 그 차이는 또한 단백질 발현을 변화시킬 수 있는 세포의 기능성에서 명백하며, 이는 심오한 변화된 분화 패턴, 조절 기계 및 세포 기능^{5,6,7로 이어진다. ,8}.

연골 ECM은 주로 매트릭스 프레임 워크를 제공하는 유형 II 콜라겐으로 구성, 그리고 aggrecan, 조직 내에서 유체를 유지하는 데 도움이 프로테오글리칸. 콜라겐 형 IV, VI, IX, X, XII, 피브로넥틴, 연골 올리고메릭 단백질(COMP), 빅리칸, 데코린 및 펄칸과 같은 다른 매트릭스 분자도^9.

OA의 병인학은 불분명하게 남아 있는 동안^10,11,질병의 개시는 조직 회전율 및 수리 과정의 불균형에 기인하는 것으로 여겨진다^12,13. 관절 연골의 저하는 OA의 특징입니다. 주변 조직에 있는 연골 세포 또는 세포는 사이토카인의 그들의 방출을 증가시키고, 매트릭스 금속 단백질성 (MMPs) 및 동맥과 같은 단백질아종의 높은 생산을 자극하여 연골 ECM의 분해를 증가시다. ^14.이러한 분해는 신에피토프라고 불리는 작은 독특한 단백질 단편의 방출을 초래하며, 이는 혈청, 소변, 또는 배양 배지^15에서정량화될 수 있다. 콜라겐의 형성과 성숙시, 소위 profragments는 또한 풀어 놓입니다; 이들은 매트릭스 생산^(16)의측정으로 정량화 될 수있다.

이 프로토콜의 목적은 ECM 조직 회전율에 대한 자극 및 / 또는 약물 치료의 효과를 비교하기 위해 생체 연골 모델을 확립하는 것입니다. 연골 회전율은 ELISA를 사용하여 컨디셔닝 된 배양 배지에서 매트릭스 유래 네오 에피토프 바이오 마커를 직접 측정하여 프로파일링됩니다: AGNx1 (응형 활성 반영), C2M (반사 매트릭스 MMP 활성), 및 ProC2 (반성 형 II 콜라겐 반사) 형성)을 형성합니다. 사실 인정은 또한 개별 적인 이식에 있는 연골 세포의 조직을 구상하는 ECM의 조직학 염색에 의해 확인될 수 있습니다. 기재된 프로토콜은 연골세포 기능 및 연골 ECM 회전율에 대한 신규한 치료법의 효과를 테스트하는데 사용될 수 있다. 많은 연구에서 생물학적 과정 또는 정량적 조직학적 또는 면역 조직화학적 접근법, mRNA, 단백질 발현 또는 프로테오믹스를 사용하여 사이토카인 도전 이식에 대한 개입의 효과를 설명하기 위해 연골 이식을 사용했습니다^{2 ,17,18}. 그러나 이러한 프로토콜은 현재 원고의 범위를 벗어납니다.

프로토콜

1. 조직 격리

1. 조직 소싱
   1. 무균 환경에서 층류 후드 외부의 전체 조직 소싱 섹션을 수행합니다.
   2. 지역 도살장에서 1.5 세에서 2 세 사이의 송아지에서 신선한 소 경골 무릎 관절 전체를 얻으라.
   3. 먼저 여분의 살을 제거하고, 콘디일, 반월 상 연골, 힘줄 및 활막막을 발견하여 종아리 무릎을 부드럽게 해부하십시오. 힘줄과 활막을 잘라 관절이 절단 할 수 있도록. 대퇴 골반 을 노출 하는 반 월 상 연 골을 제거 합니다.
   4. 대퇴골 의 하중 운반 영역에서 3mm 생검 펀처를 사용하여 대퇴 부도덕한 부위로부터 이식을 분리하고 가능한 한 골수 뼈에 평행하게 메스를 절단하여 관절 표면에서 방출합니다. 경골 뼈의 단단한 구조는 이식이 석회화 된 매트릭스를 포함하지 않도록해야합니다. 균일 한 높이의 이식을 위해 노력하십시오.
   5. 즉시 저장하고 50 mL 튜브 또는 페트리 접시에 DMEM / F12- 글루타 맥스 + 1 % P / S 배양 매체에 이식을 혼합합니다. 다른 암소 무릎에서 이식을 혼합하지 말고 각 연구에 대해 별도로 유지하십시오.
2. 조직 배양
   1. 동식물을 멸균된 96웰 플레이트로 층류 후드로 옮김을 전달한다.
   2. 배양 배지 또는 PBS에서 3회 이식을 세척하고 실험이 시작될 때까지 잘 당 배양 배지의 200 μL에서 배양한다. 생검 세포 활성과 수동 바이오마커 방출을 동기화하기 위해 1일의 세척 기간을 사용하십시오.
   3. 배양된 배양은 5%_CO2를가진 37°C 인큐베이터에서 10주까지 이식한다. 모든 복제물을 배양 판에 대각선으로 배치하여 증발에 의해 유발되는 변동을 최소화합니다. 상급물의 증발을 더 피하려면 배양 판의 외부 우물에 PBS를 추가하십시오.

2. 소 연골 이식 치료 및 신진 대사 활동의 평가

1. 배양 배지 변화 및 치료
   1. 배양 배지를 층류 후드에서 2-3일마다 변경한다.
   2. 어떤 처리를 적용하는 경우에, 매체를 바꾸기 전에 이들을 준비하십시오. 배양 배지에서 희석하여 배양 웰에서 원하는 농도로 처리를 준비한다.
   3. 각 우물에서 상판을 부드럽게 제거하고 새로운 96 웰 플레이트로 옮김하십시오. 조직 회전율 및 단백질 발현의 바이오마커 분석을 위해 -20°C의 밀봉 테이프로 상급자를 보관하십시오.
   4. 즉시 신선한 배양 배지 또는 치료1개당 200 μL을 추가합니다. 배지 가변 중에 이식이 마르지 않도록 하고 모든 이식이 완전히 새 매체에 잠기도록 하십시오.
2. 레자주린 염색
   1. 세포 생존의 간접 측정으로 매주 한 번 신진 대사 활동을 측정합니다. resazurin 시험은 세포 죽음 또는 세포 변경 때문에 개별 적인 이식에 대 한 이식의 신진 대사 활동 악화 하는 경우 평가 하는 쉬운 방법. 배양 배지에서의 이적은 실험 기간 내내 비교적 안정된 레자주린 판독값을 가진다.
   2. 10 % resazurin으로 배양 배지의 용액을 만드십시오.
   3. 2.1.3단계에서 설명한 대로 상급체를 수확한다.
   4. 37°C에서 또는 상피제자가 보라색으로 변할 때까지 3시간 동안 10% resazurin 용액에 이식합니다. 배경 컨트롤로 이식없이 4 웰을 포함합니다.
   5. 조절식 및 배경 제어 레사주린 용액을 블랙 마이크로티터 플레이트로 옮기고 540 nm 여기/590 nm 방출에서 형광을 측정합니다.
   6. 배양 배지 또는 PBS에서 3회 철저히 세척하고 레자주린이 완전히 확산될 수 있도록 5-10분 동안 세척 매체에 박을 담급금합니다. 사용 하는 경우 새로운 배양 매체 또는 치료를 추가 합니다.

3. 종료, 고정 및 샘플 저장

1. 배양 기간의 종료
   1. 2.2단계에서 기재된 바와 같이 대사 활성을 측정한다. 웰당 200 μL의 PBS를 추가합니다.
2. 고정 및 보관
   1. PBS를 제거하고, 잘 당 200 μL의 포름알데히드를 추가하고, 실온에서 2 시간 동안 둡니다.
   2. 포름알데히드를 폐기하고 웰당 200 μL의 PBS를 첨가한다. 밀봉 테이프로 플레이트를 덮고, 의 화학적 분석을 위해 4 °C에서 저장합니다. 우리는 3 개월 이내에 조직 화학 분석을 수행하는 것이 좋습니다.

4. 조직 회전율 바이오 마커 (ELISA)

1. 간접 경쟁 엘리사
   1. 스트렙타비딘 플레이트를 특이적 생체분석표적-펩타이드로 코팅하여 20°C에서 30분 동안 분석 완충액(well 당 100 μL)으로 1:100희석하였다.
   2. 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 시료 상판(잘당 20 μL)을 ProC2의 경우 1:93.3, AGNx1(웰당 100 μL)에 대해 희석된 분석 표적 펩티드에 대해 1차 단일클론 항체와 함께 추가하고 20°C에서 2시간 동안 배양합니다. ProC2에 대한 흔들림과 3 시간 AGNx1에 대한 20 °C에서.
      참고: 샘플 부피는 저장된 상급 플레이트에서 직접 채취됩니다. 측정된 농도가 분석 측정 범위를 벗어난 경우, PBS 또는 분석 버퍼에서 v-바닥 희석판에 상판을 희석한다.
   3. 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 20°C에서 1시간 동안 1:100의 분석 버퍼(웰당 100 μL)로 희석된 과산화아제 표지 이차 항체로 배양합니다.
   4. 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 20°C에서 어둠 속에서 15분 동안 흔들어서 페산화아제 기질(Well 당 100 μL)으로 테트라메틸벤지딘(TMB)으로 배양합니다.
   5. 표준 정지 용액, 0.1 M H₂SO₄ (웰 당 100 μL)로 반응을 종료합니다.
   6. 표준 실험실 플레이트 리더에서 650 nm에서 기준 흡광도를 사용하여 450 nm 흡광도에서 대색 반응을 판독합니다.
2. 상복부에서 연골 조직 회전율의 측정을 위한 직접 경쟁 ELISA
   참고: C2M을 정량화합니다.
   1. 20°C에서 30분 동안 특정 생체분석표적-펩타이드를 1:100으로 희석한 분석완충액(웰당 100 μL)으로 스트렙타비딘 플레이트를 코팅한다.
   2. 세척 버퍼로 5 회 세척하고 분석 표적 펩티드 희석 1:100에 대해 100 μL의 과록시다아제 표지 된 단일 클론 항체와 함께 샘플 상급제를 첨가하십시오 (잘 당 20 μL). 2-8 °C에서 20 시간 동안 배양하고 흔들어 보세요.
      참고: 샘플 부피는 저장된 상급 플레이트에서 직접 채취됩니다. 측정된 농도가 분석 측정 범위를 벗어난 경우, PBS 또는 분석 버퍼에서 v-바닥 희석판에 상판을 희석한다.
   3. 표준 세척 버퍼로 5회 세척하고 20°C에서 암흑에서 15분 동안 흔들어 서 과산화아제 기판으로 TMB(웰당 100 μL)로 배양합니다.
   4. 표준 정지 용액, 0.1 M H₂SO₄ (웰 당 100 μL)로 반응을 종료합니다.
   5. 표준 실험실 플레이트 리더에서 650 nm에서 기준 흡광도로 450 nm 의 흡광도에서 대색 반응을 판독합니다.
3. 아그앤스1
   1. AGNx1 네오 에피토프의 방출을 측정하여 침략열화를 정량화한다. 이러한 간접경쟁적인 ELISA 분석은 ADAMTS-4 및 5 절단에 의해 생성된 아그레칸 C-말단 펩티드(NITEGE^373)를대상으로 한다. 단일클론 항체는 노출된 NITEGE 에피토프를 가진 모든 단편을 인식합니다. 분석의 실험 세부 사항은 다른 곳에서 출판되었습니다^19.
4. ProC2
   1. 타입 II 콜라겐의 프로프란단의 방출을 측정하여 타입 II 콜라겐 형성을 정량화한다. 이 간접 경쟁 ELISA 분석은 새로 합성된 타입 II 콜라겐의 트리밍 중에 N-프로펩티다제에 의해 생성된 PIIBNP 프로펩티드(QDVRQPG)의 에피토프를 대상으로 합니다. 분석의 실험 세부 사항은 다른 곳에서 게시되었습니다^16.
5. C2M
   1. C2M 네오 에피토프 단편의 방출을 측정하여 타입 II 콜라겐 분해를 정량화한다. 이러한 직접적인 경쟁적인 ELISA는 MMP-크리브 C-말단 펩티드(KPPGRDGAAG^1053)를인식한다. 이 분석은 AGNx1 및 ProC2와 다릅니다. 분석의 실험 세부 사항은 다른 곳에서 게시되었습니다^20.

5. 조직학적 분석

1. 침투, 임베딩 및 절단
   1. 고정된 이식(3.2단계 참조)을 개별적으로 레이블이 있는 카세트에 넣습니다. 식별을 보장하기 위해 카세트와 라벨 카세트 에 라벨을 모두 포함하십시오.
   2. 이식이 들어 있는 카세트를 티슈 프로세서 기계로 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 담는다. 그런 다음 일련의 탈수 및 파라핀 침투 단계에서 파라핀으로 이식을 침투시고 파라핀을 침투시고 파라핀을 침투시면 됩니다.
      1. 온도 조절 없이 90분 동안 96% 에탄올로 탈수합니다. 이 단계를 3번 반복합니다.
      2. 온도 조절 없이 톨루엔으로 에탄올을 90분 동안 치웁습니다. 이 단계를 2번 반복합니다.
      3. 60 °C에서 90 분 동안 톨루엔으로 에탄올을 지웁습니다.
      4. 60 °C에서 파라핀 왁스로 30 분 동안 침투하십시오.
      5. 60 °C에서 파라핀 왁스로 60 분 동안 침투하십시오.
      6. 60 °C에서 90 분 동안 파라핀 왁스로 침투하십시오.
      7. 각 단계에 대해 33~34kPa 미만의 느린 펌프 아웃 및 펌프 인 흐름으로 샘플 챔버에 솔루션을 추가합니다. 최대 진공 -65 ~ -70 kPa의 압력/진공 사이클에서 침투 공정을 실행합니다.
   3. 침투 후, 카세트가 카세트에서 조심스럽게 제거 될 수 있도록 가열 블록에 카세트를 놓습니다. 침투된 이식액을 개별 파라핀 블록에 부드럽게 내장합니다. 가열 된 집게로, 각 표본 섹션 내에서 다른 연골 층의 시각화를 보장, 절단 표면에 수직 표면 관절 연골과 하위 연골 뼈 측면으로 박동을 배치합니다.
   4. 마이크로토메에 이식이 내장된 냉각된 파라핀 블록의 5 μm 섹션을 잘라냅니다. 절단 된 부분을 냉수 욕조로 옮니다. 필요한 경우 메스 또는 커버 유리를 사용하여 섹션을 분리 할 수 있습니다.
   5. 코팅되지 않은 유리 슬라이드를 조심스럽게 사용하여 섹션을 따뜻한 수조(50°C)로 옮기고 섹션이 펼쳐지도록 합니다. 각 부분을 라벨이 붙은 커버 슬라이드에 올려 놓고 핫 플레이트에 30분 동안 놓습니다.
   6. 슬라이드를 바구니에 넣고 60 °C에서 1 시간 동안 배양 한 다음 37 °C에서 밤새 유지하십시오. 이에 따라 밀폐용기에 미끄럼을 4°C로 보관하여 얼룩이 지닫는다.
2. 사프라닌 O/패스트 그린 염색 및 시각화
   1. 슬라이드를 바구니에 얼룩지게 하고 슬라이드를 60°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 0.45mm 필터로 모든 시약을 준비하고 여과하십시오.
   3. 염색을 준비하기 위해 비커에 여과된 시약을 부어 바구니를 담글 때 용액이 슬라이드를 완전히 덮을 수 있도록 합니다. 사용된 비커는 슬라이드를 덮기 위해 250 mL의 부피가 필요했습니다.
   4. 바구니를 톨루엔에 10분 2회, 에탄올 99%, 에탄올 2회, 에탄올 96%, 에탄올 2회, 에탄올 70%를 2회 2회 담그어 녹인 슬라이드를 탈파합니다. 그런 다음 슬라이드를 물에 2 분 동안 수화하십시오.
   5. Weigert의 철 헤마톡실린 용액(pH 1.5)에 바구니를 10분 동안 담그고, 1% HCl에 1회 담그고, 흐르는 수돗물로 약 5분 간 또는 과도한 색이 씻겨나갈 때까지 씻어냅니다.
   6. 다음으로, 0.05% 빠른 녹색 용액(pH: 5.75)을 5분 동안, 1% CH₃COOH에 1회 담그고, 0.1% 사프라닌 O(pH: 6.5)에서 20분 동안 얼룩을 가다.
   7. 70% 에탄올, 96% 에탄올을 2회, 에탄올 99%를 2회, 2회 2회, 톨루엔 2분 2회에 2회 침지하여 슬라이드를 탈수하고 제거합니다.
   8. 코팅되지 않은 유리 슬라이드를 구조학 슬라이드를 덮는 수지 매체로 장착합니다.

결과

소 전체 깊이 의 이식은 3 주 동안 분리, 배양 및 처리하였다(그림 1). 배양 배지는 일주일에 3회 치료를 추가하여 변경하였다. 1회 주간, 대사 활성은 레자주린 분석에 의해 측정되었다. ECM 회전율의 바이오마커는 배양플레이트로부터 수확한 상복부에서 주 3회 측정하였다. 이식은 치료를 위해 4그룹으로 나누어졌다: 1) 온코스테틴 M 및 TNFα (O+T); 2) O + T + GM6001 (GM6001); 3) 성장 인...

토론

소 연골 이식에서 연골 조직 회전율의 프로파일링을 위해 여기에 제시 된 프로토콜은 염증성 세포 내 경로의 억제제, 억제제를 포함하여 많은 유형의 약물의 치료 효과를 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 프로테올리산 효소, 또는 단백 동화 성장 인자.

두 개의 다른 설정이 프로토콜에 설명 되었다: 이식 인슐린 같은 성장 인자로 자극 했다 단백 동화 설정 1 (IGF-1), 그리고 TN...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
45% Iron(III) chloride solution	Sigma-Aldrich	12322
Acetic acid	Merck	1.00056.2500
Alamar Blue	Life tech Invitrogen	DAL1100
Biopsy processing cassettes – green	IHCWORLD	BC-0109G
Biopsy punch W/Plunger (3 mm)	Scandidat	MTP-33-32
Bovine cartilage (Bovine knees)	Local slaughterhouse
C2M	Nordic Bioscience		Fee for service
Corning 96-well plate	Sigma-Aldrich	CLS7007
Cover Glass Ø 13 mm	VWR	631-0150P
DMEM/F12-GlutaMAX Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) without HEPES	Gibco	31331-028
Ethanol ≥96%	VWR	83804.36
Ethanol absolute ≥99.5%	VWR	83813.36
exAGNx1	Nordic Bioscience		Fee for service
exPRO-C2	Nordic Bioscience		Fee for service
Fast green	Sigma-Aldrich	F7252
Formaldehyde solution 4%	Merck	1004965000
GM6001	Sigma-Aldrich	M5939-5MG
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	H3136
Hydrochloric acid	Merck	30721-M
IGF-1	Sigma-Aldrich	I3769-50UG
Oncostatin M	Sigma-Aldrich	O9635-10UG
Penicillin-streptomycin (P/S)	Sigma-Aldrich	P4333
Pertex (mounting medium for light microscopy)	HistoLab	811
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Safranin O	Sigma-Aldrich	S2255
Sterile Standard Scalpels	Integra Miltex	12-460-451
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	30743
SUPERFROST PLUS Adhesion Microscope Slides	Thermo scientific	J1800AMNT
TNF-alpha	R&D Systems	210-TA-100
Toluene	Merck	1.08327.2500
Vacuum Filtration "rapid"-Filtermax	TPP	99955